بررسی آثار بازدارندگی ترکیبات فورفورال و هیدروکسی متیل فورال در طی فرآیند تخمیر بر روی رشد و بازده اتانول تولیدی توسط مخمر ساکارومایسس سرویسیه

مقدمه

با توجه به کاهش منابع سوخت‏های فسیلی و آلودگی‏های زیست محیطی ناشی از انتشار گازهای
دی اکسیدکرین، دی اکسیدگوگرد و اکسیدهای نیتروژن نیاز به انرژی‏های تجدید پذیر، مناسب، غیر سمی و ارزان قیمت که آلودگی کمتری نسبت سوخت‏های فسیلی داشته باشند احساس می‏شود (1). استفاده از سوخت‏های زیستی به عنوان جایگزین سوخت‏های فسیلی به علت وجود اکسیژن در ساختار شیمیایی آن‏ها سبب بالا رفتن عدد اکتان سوخت و در نتیجه بهبود احتراق سوخت، کاهش انتشار مونواکسید کربن، مواد آلی فرار و هیدروکربن‏های اشباع که در واقع یکی از مهم‏ترین مشکلات استفاده از سوخت‏های فسیلی است، می‏شود (2).

در میان سوخت‏های زیستی مختلف، اتانول به دلایلی همچون، سادگی تولید، وجود انواع میکروارگانیسم‏های مختلف و مواد فراوان و ارزان قیمت برای تولید آن، بیش‏ترین توجه را در سراسر جهان به خود جلب کرده است به‏طوری که در چند دهه‏ اخیر بالای 90 درصد از سوخت‏های زیستی مصرفی جهان را به خود اختصاص داده است (3) . به طوری که می‏تواند به عنوان یک سوخت سازگار با محیط زیست که آلودگی کمتری نسبت به سوخت‏های فسیلی دارد، به شکل خالص به عنوان سوخت یا در ترکیب با بنزین به عنوان حامل اکسیژن به‏کار گرفته شود و محتوی اکسیژن آن را افزایش دهد. همچنین، سبب اکسیداسیون بهتر هیدروکربن‏ها و در نتیجه کاهش میزان آلودگی ناشی از آن‏ها شود (4).

امروزه در کشورهای مختلف به طور وسیعی از فرآیند تخمیر برای تولید اتانول ازمنابع مختلف قندی، نشاسته‏ای، سلولزی، لیگنوسلولزی و جلبک‏ها استفاده می‏شود (5). تخمیر اتانول یک فرآیند زیستی است که طی آن مواد آلی توسط میکروارگانیسم‏ها به ترکیبات ساده‏تر مانند قندها تبدیل می‏شوند. سپس، قندهای تولید شده طی فرآیند تخمیر به‏وسیله میکروارگانیسم‏ها به اتانول ودی اکسیدکربن تبدیل می‏شوند. به طور کلی در طول فرآیند تخمیر اتانول، دوگروه ازمیکروارگانیسم‏ها دخالت دارند گروه اول میکروارگانیسم‏هایی هستند که سوبستراهای تخمیرپذیر را به اتانول تبدیل می‏کنند و گروه دوم شامل میکروارگانیسم‏های تولیدکننده‏ آنزیم‏های کاتالیزکننده (مثل آنزیم آمیلاز وگلیکو آمیلاز) هستند که در واقع واکنش شیمیایی تجزیه سوبسترا به ترکیبات ساده‏تر مانند گلوکز را کاتالیز می‏کنند (6). در اصل تولید اتانول از مواد نشاسته‏ای مانند نشاسته گندم یا برنج یک فرایند دو مرحله‏ای است، مرحله اول فرایند ساکاریفیکاسیون (هیدرولیز) نام دارد که درطی آن نشاسته به کمک آنزیم یا اسید به قندهای ساده‏تر مانند گلوکز تبدیل می‏شود. در مرحله دوم قندهای حاصل از فرآیند ساکاریفیکاسیون توسط میگروارگانیسم‏های مناسب به اتانول تبدیل می‏شوند (فرآیند تخمیر) (7 و 8).

یکی از مهم‏ترین مسایل مربوط به تولید اتانول از مواد مختلف نشاسته‏ای، سلولزی و دیگر مواد پلی‏ساکاریدی در هنگام هیدرولیز این مواد، تشکیل مواد بازدارنده رشد میکروارگانیسم‏ها از قبیل اسیدهای ضعیف، مشتقات فوران، ترکیبات فنله و هیدروکسی متیل فورال[1]، به‏ویژه در هنگام هیدرولیز اسیدی این مواد است. در زمان هیدرولیز ترکیبات پلی‏ساکاریدی شامل نشاسته، سلولز و همی سلولز این مواد در ابتدا به قندهای ساده 5 کربنه و 6 کربنه تبدیل می‏شوند و سپس، در مرحله دوم این ترکیبات به شکل‏های دیگری همچون فورفورال[2] وهیدروکسی متیل فورال تبدیل می‏شوند که برای میکروارگانیسم‏ها به‏ویژه مخمرها سمی و مضر هستند. وجود این ترکیبات در محیط کشت مانع رشد و متابولیسم میکروارگانیسم‏ها شده و درنتیجه آن میزان اتانول تولیدی توسط میکروارگانیسم تخمیرکننده هم کاهش می‏یابد. بر این اساس پژوهشگران زیادی به بررسی آثار این ترکیبات بر روند رشد، متابولسیم، میزان گلوکز مصرفی واتانول تولیدی در هنگام تخمیر اتانول پرداختند. لارسون و همکاران[3] به بررسی تأثیر شدت هیدرولیز اسیدی چوب صنوبر با استفاده از سولفوریک اسید رقیق بر روی میزان قند مصرفی و تخمیر مخمر ساکارومایسس‏سرویسیه و ترکیبات بازدارنده مانند هیدروکسی متیل فورال پرداختند (9). مودیج[4]، به بررسی اثرفورفورال و هیدروکسی متیل فورال بر روی رشد وفعالیت آنزیم‏های پیروات دی‏هیدروژناز[5]، الکل دی‏هیدروژناز[6] و آلدئید دی هیدروژناز[7]توسط مخمر ساکارومایسس‏سرویسیه پرداخت. نتایج پژوهش وی نشان داد که فورفورال تأثیر شدیدی بر روی دوآنزیم آلدئید دی هیدروژناز و پیروات دی‏هیدروژناز دارد اما بر روی الکل دی‏هیدروژناز تأثیر کمتری می‏گذارد، در حالی که هیدروکسی متیل فورال تأثیر کمتری نسبت به فورفورال بر روی دو آنزیم آلدئید دی هیدروژناز و پیروات دی‏هیدروژناز دارد اما بر روی الکل دی‏هیدروژناز تأثیری شبیه به ترکیب فورفورال به ترکیب فورفورال داشت (10). بر این اساس با توجه به تأثیر مهم این ترکیبات بر رشد و تولید اتانول، مطالعه حاضر به بررسی تأثیر ترکیبات فورفورال و هیدروکسی متیل فورال بر رشد و تولید اتانول توسط مخمر ساکارومایسس سرویسیه می‏پردازد.

.مواد و روش‏ها

مخمر ومحیط کشت: در این بررسی از مخمر ساکارومایسس‏ سرویسه ITCCبرای تولید اتانول استفاده شد که از وزارت علوم و تحقیقات فناوری، سازمان پژوهشی، علمی و صنعتی ایران (مرکز کلکسیون قارچ‏ها و باکتری‏های صنعتی و عفونی) به شکل یخ خشک تهیه شد و سپس، در محیط کشت استریل شد.

شرایط انجام آزمایش: بعد از آماده شدن محیط کشت تکثیر مخمر ساکارومایسس سرویسیه حاوی ترکیبات گلوکز 15، عصاره مخمر 1، دی‏پتاسیم هیدروژن فسفات10، پتاسم دی هیدروژن فسفات 5، منیزیم سولفات 5/2، آمونیوم سولفات 9 (گرم بر لیتر)، محیط کشت آماده شده در اتوکلاو در دمای 120 درجه سانتی‏گراد و فشار 1 اتمسفر به مدت 20 دقیقه استریل شد. پس از استریل شدن محیط کشت و سرد شدن در دمای محیط در شرایط کاملا استریل و در نزدیک شعله عمل تلقیح مخمر به نسبت 3 درصد محیط کشت انجام شد (11). پس انجام عمل تلقیح محیط کشت حاوی مخمر در انکوباتور با دمای 25 درجه سانتی‏گراد و اسیدیته برابر 5/4 در شرایط ساکن تا مرحله نمایی رشد مخمر و تزریق به محیط کشت نگهداری شد. همچنین، تنظیم اسیدیته با سولفوریک اسید 1مولار و سود (سدیم هیدورکسید) 1 مولار تهیه شده از شرکت تجاری مرک[8] انجام شد. در هر آزمایش 200 میلی‏لیتر از محیط کشت در ارلن‏های با حجم 500 میلی‏لیتر تهیه شد. از زمان صفر تا 36 ساعت، هر 4 ساعت 3 نمونه از محیط کشت برای اندازه گیری قند مصرفی، اتانول تولیدی و غلظت بیومس گرفته شد. برای تعیین اثر ترکیبات فورفورال وهیدروکسی متیل فورال بر رشد مخمر، روند گلوکز مصرفی و میزان اتانول تولیدی توسط آن، 4 سری آزمایش و با غلظت‏های صفر یا شاهد، 5/0، 1 و 2 گرم بر لیتر از محیط کشت مناسب رشد مخمر برای هر ترکیب به طور جداگانه تهیه شد. برای مطالعه تأثیر غلظت این ترکیبات بر روی رشد این میکروارگانیسم‏ و مصرف قند، اتانول تولیدی هر آزمایش 3 بار تکرار و میانگین آن گزارش شد. همچنین، برای بررسی رفتار اتانول تولیدی و رشد سلولی مخمر در طی فرآیند تخمیر به ترتیب از مدل سنتیکی رشد بیومس سلولی، تولید اتانول و گلوکز مصرفی استفاده شد (معادله 1، 2 و 3).

 (1)

در معادله 1 (مدل سنتیکی رشد سلولی)، زمان تخمیر بر حسب ساعت، X میزان وزن خشک سلولی در حال رشد بر حسب گرم بر لیتر، x₀ غلظت اولیه وزن خشک سلولی بر حسب گرم بر لیتر، x_m بیش‏ترین مقدار وزن خشک سلولی بر حسب گرم بر لیتر، _mµبیش‏ترین شدت ویژه بر حسب (ساعت/1) است.

       (2)

در این رابطه t زمان تخمیر بر حسب ساعت،
 P غلظت اتانول تولیدی بر حسب گرم بر لیتر،
 P_m بیش‏ترین مقدار اتانول تولیدی برحسب گرم بر لیتر، P_r شدت ویژه تولید اتانول بر حسب (ساعت/1) و
P₀ غلظت اولیه اتانول تولیدی بر حسب گرم بر لیتر است.

      (3) .

در معادله 3 (معادله سنتیکی مصرف گلوکز) Y_P/S و Y_X/S به ترتیب بازده محصول تولیدی برای اتانول و زیست توده بر حسب گرم، اتانول بر گرم گلوکز مصرفی و گرم وزن خشک سلولی بر گلوکز مصرفی، P و P₀ به ترتیب میزان اتانول تولیدی نهایی و اولیه بر حسب گرم بر لیتر، x و x₀ غلظت نهایی و اولیه زیست توده بر حسب گرم بر لیتر و در نهایت، S₀ غلظت اولیه قند کل بر حسب گرم بر لیتر است.

.روش‏های تحلیل

.اندازه گیری قند، اتانول تولیدی و غلظت بیومس: در این بررسی برای تعیین تراکم سلولی یکی از نمونه‏های گرفته شده 3 برابر رقیق و میزان جذب آن در طول موج620 نانومتر با اسپکتروفتومتر تعیین شد. سپس وزن خشک سلولی با استفاده از نمودار کالیبراسیون (میزان جذب به‏دست آمده در 620 نانومتر در مقابل وزن خشک سلولی) به دست آمد. همچنین، در این مطالعه به منظور رسم محنی کالیبراسیون وزن خشک سلولی، ابتدا محیط کشت تهیه شده در بالا تا مرحله رسیدن به فاز رشد نمایی، در دمای 25 درجه سانتی‏گراد و اسیدیته برابر 5/4 نگهداری شد. سپس حجم‏های مختلف 1 تا 10 میلی‏لیتر از محیط کشت در 10 سری لوله آزمایش ریخته و میزان جذب آن‏ها در طول موج 620 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر قرائت شد (از آب مقطر به عنوان شاهد استفاده شد). پس از آن تعداد 10 عدد فیلتر سرسرنگی با اندازه منافذ 23/0میکرومتر به مدت 16 ساعت در آون با دمای 80 درجه سانتی‏گراد خشک و پس از سرد‏سازی در دسیکاتور و رسیدن به دمای محیط، توزین شد. سپس، 10 میلی‏لیتر از هر یک از محلول‏های مخمر رشد داده شده با غلظت‏های مختلف توسط این فیلترهای از قبل وزن شده، صاف و دوباره به مدت 16 ساعت در داخل آون در دمای 80 درجه سانتی‏گراد خشک شد. وزن ثانویه آن‏ها پس از خشک شدن دوباره اندازه‏گیری شد. با تفاضل وزن ثانویه از وزن اولیه فیلترها وزن خشک سلولی در غلظت‏های مختلف محیط کشت به‏دست آمد. برای تعیین غلظت قند احیا کننده از روش دی نیترو سالسیلیک اسید[9] (12) و همچنین، برای اندازه‏گیری غلظت اتانول تولیدی هر4 ساعت یک‏بار از محیط کشت به مدت 24 ساعت نمونه‏برداری و پس از سانتریفیوژ کردن نمونه به دستگاه کروماتوگرافی گازی تزریق شد. در این مطالعه، برای اندازه‏گیری غلظت اتانول از دستگاه کروماتوگرافی گازی مدل (فیلیپس 4400PU، اینگلند) مجهز به آشکارساز یونیزاسیون شعله‏ای و نرم افزار (Clarity 402, Data Apex, Czech Republic) استفاده ‏شد. همچنین، از ستون شیشه‏ای پر شده (فیلیپس PEG20M، USA) به طول 5/1 متر و و قطر داخلی 8/1 میلی متر با گاز حامل نیتروژن با جریان30 میلی‏لیتر بر دقیقه استفاده شد.

.اندازه‏گیری فورفورال وهیدروکسی متیل فورال: .در این مطالعه ابتدا استاندارد ترکیبات فورفوال و هیدورکسی متیل فورال (از شرکت سیگما) و موادی نظیر کلریدریک اسید و تیو باربیوتیک اسید از شرکت مرک تهیه شدند. سپس، استاندارد 100 میلی‏گرم بر لیتر از هر دو ترکیب، فورفورال و هیدروکسی‏متیل فورال به‏طور جداگانه تهیه شد. برای این منظور 01/0گرم از هر ترکیب در 100 میلی‏لیتر آب مقطر حل و سپس استاندارد 003/0 مولار از تیو باربیوتیک اسید تهیه شد. برای این منظور 4503/0 گرم از این ماده در 100 میلی‏متر آب مقطر حل و به مدت 20 دقیقه با دستگاه التراسونیک، (برای حل نمودن آن) التراسونیک شد.

برای رسم منحنی کالیبراسیون ترکیبات فورفورال و هیدورکسی‏متیل فورال، از محلول استاندارد 100 میلی‏گرم بر لیتر فورفورال و هیدروکسی متیل فورال با محلول‏های با غلظت استاندارد‏ 5/0، 1، 2، 3، 4 و 5 میلی‏گرم بر لیتر هر دو ترکیب در 6 سری بالن ژوژه 25 میلی‏لیتری تهیه شد. سپس، به هر یک از آن‏ها 5/8 میلی‏لیتر کلریک‏اسید به همراه 7 میلی‏لیتر معرف تیوباربیوتیک اسید با غلظت 003/ مولار اضافه ‏شد، همین کار با 1 میلی‏لیتر آب مقطر به عنوان نمونه شاهد نیز انجام شد. محلول‏های بالا به مدت 30 دقیقه در حمام آب با دمای 40 درجه قرار داده شدند و پس از سرد شدن تا رسیدن به دمای 20 درجه (برای متوقف کردن سرعت واکنش) میزان جذب آن‏ها با استفاده از برنامه مشتق‏گیری دستگاه اسپکتروفتومتر (جِن وی[10]6305، انگلستان) و در طول موج 414 نانومتر برای فورفورال و 436 نانومتر برای هیدروکسی متیل فورفورال با استفاده از مشتق مرحله اول قرائت شد (13).

تحلیل آماری: تحلیل‏های آماری با استفاده از نرم‏افزار ماکروسافت اکسل 2007انجام گرفت. نمودار مربوط به هر سه متغیر غلظت اتانول تولیدی، بیومس سلولی و قندهای احیا کننده در محیط اکسل رسم شد. همچنین برای بررسی مدل‏های سنتیکی متغیرهای نام برده شده از نرم‏افزار سیگما پلات 12 استفاده شد.

.نتایج

.اثر غلظت‏های مختلف هیدروکسی متیل فورال بر روی رشد، اتانول تولیدی و گلوکز مصرفی: نتایج حاصل از بررسی اثر غلظت ترکیب هیدروکسی متیل فورال بر روی رشد مخمر، میزان گلوکز مصرفی و اتانول تولیدی طی فرآیند تخمیر نشان داد: با افزایش غلظت هیدروکسی متیل فورال به بیش از 1 گرم بر لیتر، میزان رشد مخمر، گلوکز مصرفی و اتانول تولیدی کاهش می‏یابد. نتایج نشان داد که بیش‏ترین میزان وزن خشک سلولی در محیط کشت شاهد به میزان 37/4 گرم بر لیتر و محیط کشت حاوی هیدروکسی متیل فورال 5/0 گرم بر لیتر، به میزان 83/3 گرم بر لیتر وزن خشک در مدت زمان 20 ساعت پس از تلقیح مخمر به دست آمد. همچنین نتایج نشان داد که با افزایش غلظت میزان وزن خشک سلولی کم شده به‏طوری که کم‏ترین میزان وزن خشک در غلظت 2 گرم بر لیتر به میزان 8/2گرم بر لیتر به‏دست آمد. شکل 1 نتایج حاصل از بررسی اثر غلظت ترکیب فورفورال بر روی روند رشد، میزان گلوکز مصرفی واتانول تولیدی به همراه نتایج مدل سنتیکی تولید اتانول و رشد بیومس سلولی را توسط مخمرساکارومایسس سرویسیه نشان می‏دهد.

شکل 1- نتایج حاصل از بررسی غلظت‏های مختلف هیدروکسی متیل فورال بر روی روند بیومس سلولی (الف)، گلوکز مصرفی (ب) و اتانول تولیدی (ج) توسط مخمر ساکارومایسس سرویسیه در طی فرآیند تخمیربه همراه مدل سنتیکی رشد و تولید اتانول و گلوکز مصرفی در طی فرآیند تخمیر

یافته‏های حاصل از بررسی اثر غلظت‏های مختلف هیدروکسی متیل فورال بر روی میزان گلوکز مصرفی، اتانول تولیدی در طی فرآیند تخمیر نشان داد که افزایش غلظت هیدروکسی متیل فورال به بیشتر از 1 گرم بر لیتر، تأثیر بازدارندگی شدیدی بر روی میزان گلوکز مصرفی و اتانول تولیدی می‏گذارد. به‏طوری که بیش‏ترین میزان گلوکز مصرفی در طی فرآیند تخمیر به ترتیب در غلظت‏های صفر، 5/0، 1 و 2 گرم در لیتر و به میزان 2/39، 64/37، 83/33 و 5/30 بود (جدول 1). همچنین، نتایج حاصل از بررسی میزان بازده اتانول تولیدی طی فرآیند تخمیر نشان داد که بین غلظت‏های صفر یا (شاهد) و 5/0 گرم بر لیتر تفاوت چندانی در میزان بازده اتانول تولیدی وجود ندارد ولی با افزایش غلظت به بیش از 1 گرم در لیتر، میزان بازده تولیدی به مقدار زیادی کاهش می‏یابد. به طوری‏که بیش‏ترین بازده اتانول تولیدی‏ به ترتیب در غلظت‏های صفر، 5/0، 1 و 2 گرم در لیتر به میزان 43/0، 42/0، 38/0 و 36/0 گرم اتانول بر گرم گلوکز بود.

جدول 1- نتایج رگرسیون و شاخص‏‏های سنتیکی رشد مخمر، تولید اتانول و گلوکز مصرفی (گرم بر لیتر) در طی فرآیند تخمیر در غلظت‏های مختلف هیدروکسی متیل فورال

.بررسی اثر غلظت‏های مختلف فورفورال بر روی رشد، میزان اتانول تولیدی و گلوکز مصرفی: نتایج حاصل از بررسی اثر غلظت‏های مختلف ترکیب فورفورال بر روی رشد، میزان گلوکز مصرفی وبازده اتانول تولیدی نشان داد که با افزایش غلظت فورفورال، میزان رشد مخمر، گلوکز مصرفی و اتانول تولیدی کاهش می‏یابد. همچنین، نتایج حاصل از بررسی اثر غلظت‏های مختلف فورفورال بر میزان گلوکز مصرفی و اتانول تولیدی در طی فرآیند تخمیر نشان داد که افزایش غلظت فورفورال به بیشتر از 5/0 گرم بر لیتر تأثیر بازدارندگی شدیدی بر روی میزان گلوکز مصرفی و بازده اتانول تولیدی می‏گذارد (جدول 1)، به‏طوری که بیش‏ترین میزان گلوکز مصرفی در طی فرآیند تخمیر به ترتیب در غلظت‏های صفر، 5/0، 1 و 2 گرم در لیتر به میزان 39/0، 5/34، 33 و 2/29 گرم بر لیتر به‏دست آمد. همچنین، بیش‏ترین بازده اتانول تولیدی به ترتیب در غلظت‏های صفر، 5/0، 1 و 2 به ترتیب به میزان 42/0، 40/0، 37/0 و 34/0گرم اتانول بر گرم گلوکز مشاهده شد (شکل 2). نتایج حاصل از بررسی میزان وزن خشک سلولی نشان دادکه با افزایش غلظت فورفورال میزان وزن خشک سلولی به میزان زیادی نسبت به نمونه شاهد کاهش می‏یابد. به‏طوری که بیش‏ترین و کمترین وزن خشک سلولی به ترتیب در نمونه شاهد و2 گرم در لیتر به میزان 9/3 و 7/2 گرم بر لیتر به‏دست آمد (شکل 2).

شکل 2- نتایج حاصل از بررسی غلظت‏های مختلف فورفورال بر روی روند رشد بیومس سلولی (الف)، اتانول تولیدی (ب) وگلوکز مصرفی (ج) توسظ ساکارومایسس سرویسیه در طی فرآیند تخمیر همراه مدل سنتیکی آن‏ها

جدول 2- نتایج رگرسیون و شاخص‏‏های سنتیکی رشد مخمر، تولید اتانول و گلوکز مصرفی (گرم بر لیتر) درطی فرآیند تخمیر در غلظت‏های مختلف فورفورال