جداسازی و شناسایی مولکولی کلستریدیوم بای فرمانتانس از برکه‏ های بی‏ هوازی تصفیه‏ خانه فاضلاب

مقدمه

کلستردیوم بای فرمانتانس باکتری گرم مثبت بی‏هوازی و دارای تحرک است که نخستین بار توسط تیسیر و مارتلی در سال 1992 جدا‏سازی شد. این ارگانیسم به لحاظ تاکسونومی رابطه خیلی نزدیکی با کلستردیوم سوردیلی دارد (1). در اواخر سال 1962 این گونه به عنوان گونه‏ای جدید از جنس کلستردیوم مشخص شد (2 و 3). کلستردیوم سوردیلی به عنوان یک باکتری بیماری‏زا و کلستردیوم بای‏فرمانتانس به عنوان یک باکتری غیر بیماری‏زا مشخص شده‏اند (4). علاوه بر این، این دو باکتری می‏توانند بر اساس تولید اوره نیز از هم متمایز شوند (3). منبع اصلی این باکتری آب، خاک، فاضلاب، لجن و مدفوع حیوانات است (5). این باکتری قادر به تولید طیف وسیعی از متابولیت‏ها مانند اسید استیک، اسید لاکتیک، اسید فرمیک (6)، اتانول، بوتانول، استن (7)، کربن دی اکسید، هیدروژن و نیتروژن (3 و 8) است. با این حال تا کنون جزئیات بیشتری درباره مسیرهای متابولیکی این باکتری مشخص نشده است. از بارز‏ترین متابولیت‏های این باکتری می‏توان به هیدروژن اشاره کرد. هیدروژن به عنوان یک منبع انرژی پاک است. تبدیل بی‏هوازی توده‏های زیستی یکی از راه‏های دسترسی به این انرژی است. بستر‏های ‏مورد استفاده برای تولید هیدروژن عبارتند از: لجن فعال (9- 11)، زباله (11 و 12)، ملاس نیشکر (13). شیوه‏های ‏متفاوتی تا کنون برای تولید هیدروژن گزارش شده است که یکی از این روش‏ها تولید متان و سولفید هیدروژن در طی فرایند بی هوازی و سپس، تبدیل آن‏ها به هیدروژن است (13 و 14).

تولید مناسب هیدروژن در یک راکتور بی‏هوازی بستگی به روش‏های ویژه‏ای برای جلوگیری از شرکت متابولیت‏های ثانویه در طول واکنش دارد (15). بخش کمی از هیدروژن تولید شده در فاز گازی توسط باکتری‏های اسیدوژنیک و متاژنیک است‏ (11، 16 و 17). لجن فعال موجود در سیستم‏های تصفیه فاضلاب حاوی مواد آلی زیادی است در نتیجه یک بستر بالقوه برای تولید هیدروژن به حساب می‏آید. استفاده از سویه کلستردیوم به ویژه کلستریدیوم بای فرمانتانس برای تولید بیوهیدروژن، دارای بیش‏ترین راندمان و کم‏ترین هزینه است (18- 20). هدف از این مطالعه، جداسازی و شناسایی مولکولی کلستردیوم بای فرمانتانس است‏.

.مواد و روش‏ها

نمونه‏گیری: نمونه پساب از برکه بی‏هوازی تصفیه خانه فاضلاب مهدی‏شهر واقع در استان سمنان به وسیله نمونه‏گیر خاص از عمق حدود 2 متر تهیه شد و در ظروف شیشه‏ای استریل در کنار یخ به آزمایشگاه منتقل شد.

محیط کشت و شرایط رشد: برای تهیه محیط کشت ابتدا محلول‏های یاد شده در جدول 1 (21 و 22) تهیه و سپس، 4000 میلی‏لیتر ازمحلول A، 5 میلی‏لیتر از محلول B، 5 میلی‏لیتر از محلول C، 100 میلی‏لیتر از محلول D و 20 میلی‏لیتر از محلول E را با هم مخلوط کرده، میزان 15 گرم در لیتر به آن آگار اضافه کرده و حجم آن با آب مقطر به 5 لیتر رسانده شد. محیط آماده شده در لوله آزمایش به حجم 10 میلی‏لیتر تقسیم و توسط اتوکلاو استریل شد‏.

برای آماده‏سازی نمونه برای کشت، 50 میلی‏لیتر نمونه پساب در 5000 دور در دقیقه به مدت 15 دقیقه سانتریفوژ شده و رسوب به دست آمده در 5/0 میلی‏لیتر سرم فیزیولوژی استریل سوسپانسیون شد‏ و سپس، قبل از این‏که محیط سرد شده و ببندد، کل حجم باکتری‏های سوسپانسیون شده به محیط تلقیح شد. برای ایجاد شرایط بی‏هوازی کامل، از دو روش اضافه کردن پارافین مایع استریل بر روی سطح محیط در درون لوله و روش به‏کار بردن پیروگالول و سود 10 درصد استفاده شد‏. بعد از این که باکتری بر روی سطح شیب‏دار محیط کشت داده شد، یک در پوش پنبه‏ای ‏درون لوله قرار داده و دقیقا تا بالای سطح شیب دار محیط انتقال داده شد. سپس، فضای بین در پوش پنبه‏ای ‏تا سرلوله با کریستال‏های پیروگالول پر شده و 1 میلی‏‏لیتر NaOH 10 درصد به آن اضافه شد‏. درب لوله با درپوش پلاستیکی محکم بسته، لوله سریع بر عکس شده و نمونه‏ها ‏مدت 72 ساعت در دمای 30 درجه سانتی‏گراد قرار داده شدند (23). سپس، از لوله‏های ‏حاوی کدورت بر روی محیط یاد شده درون پلیت به شکل خطی کشت داده و در جار بی‏هوازی در دمای 30 درجه سانتی‏گراد گرماگذاری شد‏.

.بررسی ماکروسکوپی و میکروسکوپی کلونی‏‏های ‏خالص: کلونی‏‏های ‏خالص از نظر خواص ماکروسکوپی (شکل ظاهری کلونی‏) نظیر رنگ، اندازه، شکل، مشخصات کناره کلونی‏، برجستگی، ویژگی نوری، بوی کلونی‏ و قوام کلونی‏ و سپس از نظر خواص میکروسکپی با تهیه لام از هر نوع کلونی‏ و رنگ آمیزی گرم و اسپر طبق روش‏های متداول آزمایشگاه میکروبیولوژی بررسی شدند.

.بررسی باکتری‏های جدا شده: با توجه به این‏که هدف انجام این پژوهش‏ جداسازی باکتری کلستردیوم بای فرمانتانس است، آزمون‏‏های بیوشیمیایی مربوطه بر اساس باکتری‏شناسی ‏برجی (24) با انتخاب یک کلونی‏ خالص از باکتری‏های جدا شده انجام شد. بعد از اطمینان از این که باکتری جدا شده یک باسیل گرم مثبت اسپردار بی هوازی مطلق است، از آزمون‏ اوره‏آز و آمین به عنوان آزمون‏ شاخص برای تمایز بین گونه‏های مختلف این باکتری استفاده شد (25).

جدول 1- مواد لازم برای تهیه محیط کشت (21 و 22)

.جداسازی DNA ژنومی و شرایط PCR: جداسازی DNA ژنومی باکتری طبق روش چن[1] و همکاران (26) با تغییراتی به این شرح انجام شد. یک کلونی‏ از باکتری مورد نظر در داخل 5 میلی‏‏لیتر محیط کشت مایع تلقیح و به شکل بی‏هوازی به مدت 72 ساعت در دمای آزمایشگاه قرار داده شد تا کدورت مناسب از باکتری ایجاد شود‏‏. باکتری‏ها ‏به‏وسیله سانتریفوژ در 12000 دور در دقیقه و به مدت 3 دقیقه از محلول رویی جدا شده و در 300 میکرولیتر محلول شماره 1 (سوکروز 15درصد، تریس 04/0 مولار، EDTA 002/0 مولار، لیزوزیم 10 میکروگرم در میلی‏‏لیتر و RNAase 5 میکروگرم در میلی‏‏لیتر) سوسپانسیون شد. سپس به مدت 15 دقیقه در 37 درجه سانتی‏گراد قرار داده شده تا آنزیم لیزوزیم دیواره پپتیدوگلیکانی را تجزیه کند. به سوسپانسیون سلولی 600 میکرولیتر محلول شماره 2 (NaOH یک درصد و SDS یک درصد) اضافه و به آرامی هم زده شد تا سلول‏ها کاملا لیز شوند سپس سلول‏های لیز شده یک بار با دو حجم فنل و یک بار با دو حجم کلروفرم عصاره‏گیری شد‏. برای رسوب دادن DNA دو حجم اتانل 99 درصد اضافه و به آرامی هم زده شد تا رسوب DNA تشکیل شود‏‏. رسوب با سانتریفوژ در 12000 دور در دقیقه به مدت 5 دقیقه جدا شده و با اتانل 70 درصد شستشو شد‏ و بعد از خشک شدن آن، در 50 میکرولیتر آب مقطر حل شد‏.

کمیت و کیفیت DNA ژنومی جدا شده با اندازه‏گیری میزان جذب در طول موج 260 و 280 بررسی شد‏. ژن 16S rRNA به‏وسیله PCR با استفاده از پرایمرهای زیر تکثیر شد‏.

EC16-F 5'gTT-TgA-TCC-Tgg-CTC-A--3'

EC16-R5'–TAC-CTT-gTT-ACg-ACT-TC--3'

هر 25 میکرولیتر واکنش PCR حاوی 5/2 میکرولیتر بافر10X، انواع dNTP (شرکت کوثر، ایران) با غلظت نهایی 200 میکرو مولار، پرایمرها هر کدام با غلظت 2/0 میکرو مولار، MgCl₂ با غلظت 2 میلی‏‏مولار و آنزیم Taq DNA Polymerase (شرکت کوثر، ایران) با غلظت 1 واحد و 1 میکرو لیتر از DNA استخراج شده به عنوان الگو است. این واکنش با شرایط دمایی واسرشت شدن ابتدایی در 94 درجه سانتی‏‏‏گراد به مدت 5 دقیقه و در ادامه 40 چرخه شامل واسرشت شدن در دمای 95 درجه سانتی‏‏‏گراد به مدت یک دقیقه، اتصال در دمای 50 درجه سانتی‏‏‏گراد و گسترش در دمای 72 درجه سانتی‏‏‏گراد هر کدام به مدت یک دقیقه و در نهایت، 5 دقیقه در دمای 72 درجه سانتی‏‏‏گراد برای گسترش نهایی انجام شد‏. قطعه تکثیر یافته با استفاده از ژل آگاروز 1 درصد و رنگ آمیزی با اتیدیوم بروماید ارزیابی شد.

.تعیین ترادف بازی[2] و تحلیل آن: برای شناسایی کامل باکتری جدا شده، محصول PCR خالص شده توسط شرکت کره‏ای ماکروژن تعیین ترادف بازی شد‏. ترادف بازی به دست آمده با نرم افزار کروماس بررسی و سپس بعد از تصحیح‏های ‏مورد نیاز، در بانک ژن جهانی (NCBI) بلاست شد. با توجه به بلاست ترادف موجود با سکانس‏های 16S rRNA موجود در بانک ژن جهانی، بیش‏ترین شباهت‏ها بررسی و در نهایت باکتری مورد نظر تا حد گونه شناسایی شد‏.

.نتایج

.ویژگی‏های ماکروسکوپی و میکروسکوپی باکتری‏های جدا شده: از کشت نمونه پساب در محیط کشت کمپلکس، رشد مناسبی حاصل شد‏ (شکل 1). از لوله‏ها ‏به طور جداگانه نمونه برداشت کرده و رنگ آمیزی گرم انجام شد. هر دو لوله دارای مخلوطی از باکتری‏ها به شکل میله‏ای ‏گرم مثبت با قطرکمتر از یک میکرو متر، میله‏ای ‏گرم منفی با کمی انحنا با قطر بیشتر از یک میکرومتر، میله‏ای ‏گرم منفی و کوکوباسیل گرم منفی، بودند. در این پروژه هدف جداسازی باکتری‏های میله‏ای ‏گرم مثبت است‏ بنابراین، از هر لوله بر روی پلیت محیط کشت کمپلکس به شکل خطی کشت داده شد که 3 نوع کلونی‏ مختلف (شکل 2) با ویژگی‏های زیر ایجاد شد‏؛کلونی‏ شماره 1: سفید مایل به شیری، قطر حدود 7 میلی‏‏متر، مات، کناره‏ها ‏صاف، سطح صاف. کلونی‏ شماره 2: قرمز رنگ، قطر حدود 3 میلی‏‏متر، سطح محدب، نیمه شفاف، کناره‏ها ‏صاف، کلونی‏ شماره 3: شیری، قطر حدود 3 میلی‏‏متر، شفاف، سطح صاف، کناره‏ها ‏صاف. از کشت خالص و رنگ آمیزی گرم و اسپور مشخص شد‏ کلونی‏ شماره 1 از باکتری‏های میله‏ای ‏شکل گرم مثبت با قطر یک میکرو متر و طول حدود 2 تا 3 میکرومتر با دو انتهای گرد تشکیل شده است و دارای اسپور بیضی شکل نزدیک به انتهاست. کلونی‏ شماره 2 از باکتری‏های میله‏ای شکل کمی خمیده گرم منفی با قطر بیش از یک میکرومتر و فاقد اسپر است‏. کلونی‏ شماره 3 باسیل گرم منفی است. هر 3 کلونی‏ از نظر اکسیداسیون H₂S مثبت بوده و کلونی‏‏های ‏1 و3 متحرک بودند.

شکل 1- رشد نمونه‏ها ‏در محیط کشت

شکل 2- کلونی‏‏های ‏مختلف رشد کرده بر روی پلیت

.بررسی ویژگی‏های بیوشیمیایی: با توجه به جدول ویژگی‏های بیوشیمیایی جنس کلستریدیوم در کتاب برجی و نتایج آزمون‏‏های ‏بیوشیمیایی باکتری گرم مثبت اسپردار (جدول 2)، این باکتری متعلق به گونه کلستریدیوم بای فرمانتانس است.

جدول2- نتایج آزمون‏‏های بیوشیمایی انجام شده، برای شناسایی باکتری

شکل 3- الکتروفورز DNA ژنومی باکتری

. .جداسازی DNA ژنومی: نتیجه الکتروفورز DNA ژنومی جدا شده در شکل 3 آمده است و همین‏طور که در شکل مشخص است نمونه جدا شده دارای باند شارپ و خالص است.

بررسی کمی و کیفی DNA کروموزومی جدا شده: جذب رقت یک به صد نمونه در طول موج 260 برابر 112/0 و در طول موج 280 برابر 064/0 است. نسبت این دو جذب برابر 75/1 است؛ بنابراین، این DNA از نظر کیفی برای PCR مناسب است. با توجه به این‏که هر OD 1 جذب در طول موج 260 برابر با 50 میکروگرم DNA در میلی‏‏لیتر است، غلظت نمونه جدا شده 560 نانوگرم در میکرولیتر می‏باشد.

.اختصاصیت PCR: الکتروفورز 5 میکرولیتر از محصول PCR در کنار نشانگر 1kb[3] (فرمنتاس) بر روی ژل آگاروز‏‏‏ 1 درصد مطابق انتظار یک باند اختصاصی حدود 1500 جفت باز حاصل شد (شکل 4).

شکل 4- الکتروفورز محصول PCR. لاین 1: کنترل منفی،
لاین 2: مارکر، لاین3: محصول PCR

.نتایج تعیین ترادف محصول PCR: نتیجه تحلیل‏‏‏ و بلاست ترادف 16S rRNA نشان داد که این باکتری به جنس کلستریدیوم متعلق بوده و 99 درصد شباهت به گونه بای فرمانتانس دارد. با توجه به عدم شباهت 100 درصد، باکتری جدا شده سویه جدیدی است و کلستریدیوم بای فرمانتانس سویه IRI2 نام گذاری و در بانک ژن جهانی با شماره KC525132 ثبت شد‏. درخت فیلوژنتیکی به دست آمده براساس ژن 16S rRNA (شکل5) نشان می‏دهد که این سویه با توجه به عدم شباهت 100 درصد در شاخه جداگانه قرار دارد، که با توجه به قرار گرفتن آن بعد از کلستردیوم دیفیسیل و کلستردیوم سوردیلیسویه جدیدی از جنس کلستردیوم است.

شکل5- درخت فیلوژنتیک ترسیم شده برای کلستردیوم بای‏فرمانتانس و قرارگیری آن در شاخه‏ای جدا گانه که دلالت بر سویه‏ای جدید دارد.