جدا‏سازی، شناسایی و بهینه‌سازی باکتری‌های تولیدکننده اتانول از فرآیند تخمیر با پایه ساکارومیسس در صنایع الکل‌سازی ایران

مقدمه

بحران جهانی انرژی و این واقعیت که روزی سوخت‌های فسیلی تمام خواهد شد، از مهم‏ترین دغدغه‌های امروز بشر شده است. با توجه به رشد جمعیت جهان، مصرف زیاد انرژی، محدودیت منابع نفتی تامین کننده انرژی و افزایش قیمت سوخت جایگزینی یک منبع انرژی دیگر امری ضروری به شمار می‌رود (1).

تولید اتانول از منابع ارزان قیمت به عنوان مکمل و یا حتی جایگزین سوخت‌های فسیلی، ضرورتی انکارناپذیر است (2 و 3). بر خلاف سوخت‌های فسیلی، اتانول سوختی پاک و تجدید پذیر بوده و به آن به عنوان یک سوخت سالم، ایمن و جایگزین توجه شده است (4).

میکروارگانیسم‌ها قادرند با مصرف مواد طبیعی زاید و ارزان قیمت، محصولات با ارزشی نظیر سوخت‌های پاک تولید کنند (5). بنابراین، جستجوی میکروارگانیسم‌های صنعتی و شناسایی تخمیرگرها با توانایی تولید بیشتر، از اهمیت زیادی برخوردار است. تولید جهانی اتانول بیشتر بر پایه‌ی تخمیر قندها توسط سویه‌های ساکارومیسس سروزیه[1] است (6). مخمرها دارای محدودیت‌هایی هستند که به عنوان بزرگ‌ترین مانع در کاهش بهای تولید الکل به شمار می‌رود. از جمله می‌توان به طیف محدود ماده اولیه، تحمل محدود الکل و عدم توانایی آن‌ها در تخمیر انواع مواد اولیه ارزان ‌قیمت نظیر بیشتر قندهای پنج‌کربنه اشاره کرد (7). علاوه بر مخمرها، سویه‌های باکتریایی نظیر انواع زایموموناس، باسیلوس، کلستریدیوم­های ترموفیلیک، استوباکتر و لاکتوباسیلوس توانایی تولید الکل را دارند (8، 9 و 10). امروزه، به باکتری‌ها به علت توانایی تخمیر سریع و مصرف طیف وسیعی از سوبستراها (11)، تحمل‌ بالای اتانول (12)، توانایی تولید زیاد اتانول (13)، تولید کم فرآورده‌های جانبی نظیر اسیدها و گلیسرول (14)، تحمل تغییرات فشار اسمزی و تحمل‌ گرما، بیش‌تر توجه شده است (15).

باکتری‌های متعلق به جنس زایموموناس در سال 1912 از فساد ناشی از آب سیب تخمیر یافته، جداسازی شدند. بعدها آن را از شیره سایر گیاهان غنی از قند تخمیر یافته نظیر شیره‌ گیاه گوش‌خر[2] در مکزیک، شیره نخل خرما در نواحی مختلف آفریقا و آسیا و شیره نیشکر در برزیل نیز جداسازی کردند (16).زایموموناس‌ها باکتری‌های میله‌ای شکل به اندازه 5/1-1 میکرون، گرم منفی، بی‌هوازی، تاژه‌دار و فاقد اسپور و کپسول هستند. زایموموناس موبیلیس[3] گلوکز را جذب کرده و 3 تا 4 برابر سریع‌تر از مخمر، اتانل تولید می‌کند و محصول اتانل تا 97 درصد حداکثر محاسبه تئوریک می‌رسد (1، 17 و 18).

جنس استوباکتر، باکتری گرم‌منفی، میله‌ای شکل و هوازی است. در صورت متحرک بودن به وسیله فلاژل‌های پیرامونی حرکت می‌کند. این باکتری در کشت تازه به شکل گرم منفی و در کشت کهنه، بیشتر گرم متغییراند. کاتالاز مثبت بوده و فعالیت اکسیداتیو شدید دارند (19). استوباکترها علاوه بر تولید استیک اسید، اتانول نیز تولید می‌کنند (8). این ارگانیسم‌ها به دو گروه تقسیم می‌شود: گروه اول شامل استوباکترها با اکسایش شدید که اتانول را به طور موقت به استیک اسید تبدیل می‌کند اما دوباره آن را به اتانول احیا می‌کند. گروه دوم استوباکترها با اکسایش جزیی هستند که استیک اسید تولید شده را دوباره به اتانول تبدیل نمی‌کند و متابولیسم پایان می‌پذیرد. از گروه استوباکترها با اکسایش شدید می‌توان استوباکتر پراکسیدانس و استوباکتر پاستوریانوم و از استوباکترها با اکسایش جزیی می‌توان گلوکونوباکتر اکسیدانس را نام برد (20).

جنس لاکتوباسیلوس بسیار ناهمگن بوده و از نظر خواص فنوتیپی، بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی بسیار متنوع است. گونه‌های وحشی لاکتوباسیل‌ها از جمله لاکتوباسیلوس پلانتاروم توانایی تولید لاکتیک اسید و اتانول را تحت شرایط هوازی و بی‌هوازی دارد (10). باکتری‌ها از طریق مسیر متابولیکی انتنر- دودروف[4] و توسط آنزیم‌های الکل دهیدروژناز و پیروات دکربوکسیلاز، قند را به اتانل احیا می‌کنند (21).

مطالعه تنوع زیستی میکروارگانیسم‌ها و جداسازی سویه‌های جدید باکتریایی با توانایی تولید بیشتر اتانول، جذاب و مهم است. همچنین، جستجوی حضور باکتری‌های تولید کننده اتانول در کنار مخمرها در تانک تخمیر، ضروری است. به این منظور، حضور این باکتری‌ها در تانک تخمیر کارخانجات الکل‌سازی بررسی شد. بررسی تاثیر عوامل مختلف محیطی و رشد نظیر: درجه حرارت، اسیدیته، غلظت اولیه سوبسترا، منبع کربن، منبع نیتروژن، زمان تخمیر و هوادهی بر باکتری‌های جداشده از اهداف دیگر این مطالعه بود.

مواد و روش‌ها

غنی‌سازی و جداسازی باکتری

برای جداسازی باکتری‌های تولیدکننده اتانول، از محتویات تانک تخمیر کارخانجات الکل‌سازی بیدستان قزوین و فارکو خرمشهر نمونه‌برداری شد و در شرایط سرمای 4 درجه سانتی‏گراد به آزمایشگاه منتقل شد. دمای محفظه تانک تخمیر 2±35 درجه سانتی‏گراد و اسیدیته 5/0±0/6 ثبت شد. برای افزایش جمعیت باکتری‌های تولید کننده اتانول، نمونه‌ها در محیط کشت‌ اختصاصی مایع ZSM[5] غنی‌سازی شد. این محیط کشت از مخلوط کردنساکارز دو درصد، عصاره مخمر یک درصد، آمونیوم ­سولفات 2/0 درصد، پتاسیم هیدروژن فسفات 2/0 درصد، منیزیم سولفات 7 آبه 05/0 درصد در 1000 میلی‌لیتر آب مقطر تهیه شد (22).

پس از تلقیح 5 درصد از هر نمونه به محیط کشت مایع ZSM، در دمای 35 درجه سانتی‏گراد و به مدت 48 تا 72 ساعت گرماگذاری شد. لوله‌ها از نظر تولید گاز در لوله درهام (به عنوان نشانه اولیه تولید اتانول) بررسی شدند (23). سپس برای جداسازی باکتری‌های تولید کننده اتانول، به محیط کشت محتوی آگار RMA (گلوکز دو درصد، عصاره مخمر یک درصد، آمونیوم سولفات 2/0 درصد، پتاسیم هیدروژن فسفات 2/0 درصد، منیزیم سولفات 7 آبه 05/0 درصد و آگار 5/1 درصد در 1000 میلی‌لیتر آب) منتقل شد (24). پلیت‌ها در دمای 35 درجه سانتی‏گراد گرماگذاری و کشت خالص باکتری‌ها برای بررسی بیشتر نگهداری شد.

سنجش تولید اتانول

برای سنجش اولیه تولید اتانول، باکتری‌های جداسازی شده از تانک تخمیر به محیط­کشت مایع ZSM تلقیح و به مدت 24 تا 48 ساعت در دمای 35 درجه سانتی‏گراد به دو صورت بدون هوادهی و با هوادهی گرماگذاری شدند. سنجش تولید اتانول با دو روش کمی رنگ‌سنجی دی‌کرومات پتاسیم و کروماتوگرافی گازی طیف سنجی جرمی انجام شد (25 و 26).

در روش رنگ‌سنجی دی‌کرومات پتاسیم، اتانول تولید شده در محیط رشد تقطیر شد. سپس به یک میلی‏لیتر نمونه تقطیر شده، حجم یک میلی‏لیتر محلول دی‌کرومات‌ پتاسیم و یک میلی‏لیتر محلول اشباع دی‌فنیل کاربازید اضافه شد. ترکیب در 90 درجه سانتی‏گراد به مدت 5 تا 15 دقیقه، تا ایجاد رنگ قرمز قهوه‌ای گرما داده شد. برای پایدار کردن رنگ، حجم یک میلی‏لیتر محلول تارتارات‌ سدیم پتاسیم 40 درصد اضافه شد. پس از خنک کردن و رساندن به دمای اتاق به کمک حمام آب سرد، میزان جذب با اسپکتروفتومتر در 575 نانومتر اندازه‌گیری و غلظت اتانول تولید شده به کمک منحنی استاندارد، سنجش شد (25).

همچنین، غلظت اتانول موجود در محیط رشد با استفاده از ریزپردازنده مبتنی بر کروماتوگرافی گازی طیف‌سنجی جرمی[6] مجهز به آشکارساز یونیزاسیون شعله و ستون DB-5 اندازه‌گیری شد. درجه حرارت انژکتور، آشکارساز و اجاق گاز کروماتوگرافی به ترتیب بر روی 200، 210 و 100 درجه سانتی‏گراد تنظیم شد (1).

بهینه‌سازی منابع غذایی و شرایط رشد باکتری‌های جداشده

برای بهینه‌سازی شرایط مناسب رشد برای تولید اتانول، تاثیر منابع مختلف کربن و نیتروژن بررسی شد. به محیط کشت پایه RM (محیط کشت RMA بدون آگار) مقدار 20 گرم بر لیتر به طور مجزا از منابع مختلف کربن شامل: گلوکز، گزیلوز، فروکتوز، مالتوز، ساکارز، ریبوز، گالاکتوز، مانوز و آرابینوز افزوده شد. همچنین، برای مطالعه تاثیر غلظت گلوکز اولیه در تولید اتانول، از غلظت‌های مختلف 5، 10، 15 و 20 گرم بر لیتر استفاده شد. بهینه‌سازی منبع نیتروژن محیط رشد با افزودن عصاره مخمر، پپتون، سیستئین، سولفات آمونیوم، آلانین، آرژنین و تریپتوفان مطالعه شد. مقدار 10 گرم بر لیتر منبع نیتروژن به شکل مجزا به محیط کشت پایه RM اضافه شد.

همچنین، تاثیر عوامل محیطی شامل: دما (درجه حرارت 25، 30، 35 و 40 درجه سانتی‏گراد)، اسیدیته (2، 4، 6 و 8)، زمان تخمیر (24، 48، 72 و 96 ساعت) و هوادهی (50، 100، 150 و 200 دور در دقیقه) بر تولید اتانول، بررسی شد. تمام آزمایش‌ها با سه بار تکرار انجام شد.

شناسایی باکتری‌های جدا شده تولید کننده اتانول

برای شناسایی باکتری‌های جداشده، صفات ریخت‏شناسی و فیزیولوژیکی بررسی شد. پس از رنگ‌آمیزی گرم، شکل باکتری‌ها و واکنش گرم آن‌ها مطالعه شد. همچنین، فعالیت کاتالازی و اکسیدازی، تولید اندول، مصرف گلوکز از مسیر تخمیر اسید‌های مخلوط (متیل‌رِد[7] MR) یا مسیر تخمیر بوتاندیول (وژزپروسکوئر[8] VP) و حرکت باکتری مطابق جداول شناسایی کتاب سیستماتیک باکتریولوژی بِرگی، بررسی شد (27). تمام آزمایش‌ها با سه بار تکرار انجام شدند.

استخراج نوکلئیک اسید، واکنش زنجیره‌ای پلیمراز ژن 16S rRNA و رسم درخت فیلوژنی

برای استخراج DNA باکتری‌ها از روش دست‌ورزی شده استخراج DNA پیشنهاد شده توسط استفِنت[9] در سال 1996 استفاده شد (28). ابتدا دیواره‌ سلولی باکتری‌ها با دترجنت هگزادسیل‌تری‌متیل‌آمونیوم بروماید[10] متلاشی شد. سپس از محلول فنل: کلروفرم: ایزوآمیل الکل (به نسبت 1:24:25) برای حذف پروتئین‌ها و قند‌ها استفاده شد. برای رسوب نوکلئیک اسید از محلول نمکی پلی اتیلن گلیکول و نیز برای شستشو و حذف سایر ناخالصی‌ها از اتانول خالص استفاده شد. درستی استخراج نوکلئیک‌اسید، با استفاده از الکتروفورز ژل آگاروز 8/0 درصد رنگ آمیزی شده با اتیدیوم برماید بررسی شد (29).

برای تکثیر ژن 16S rRNAاز پرایمرهای عمومی ((PA 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ و (PH 5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′) استفاده شد (30). واکنش زنجیره‌ای پلیمراز با این روش انجام شد: واسرشت اولیه در دمای 95 درجه سانتی‏گراد به مدت 5 دقیقه انجام شد. چرخه تکثیر شامل: 35 تکرار با دمای واسرشت 95 درجه سانتی‏گراد به مدت 5 دقیقه، دمای اتصال 50 درجه سانتی‏گراد به مدت 5/0 دقیقه و دمای سنتز 72 درجه سانتی‏گراد به مدت 5/1 دقیقه بود. پس از اتمام چرخه‌ها و به منظور تکمیل نهایی ساختار DNA تکثیر شده، نمونه‌ها به مدت 5 دقیقه در دمای 72 درجه سانتی‏گراد نگهداری شد. 5 میکرولیتر از محصول PCR روی ژل آگاروز 8/0 درصد تحلیل شد. محصول PCR با استفاده از کیت تخلیص GeneJetPCR[11] خالص‏سازی شد. سپس توالی ژن 16S rRNA توسط شرکت GATC آلمان تعیین شد. نتایج توالی نوکلئوتیدها به کمک نرم افزار Chromas Lite (نسخه 01/2) دوباره بررسی شد. شباهت توالی نوکلئوتیدهای ژن 16S rRNA جدایه‌های تولیدکننده اتانول به کمک BLAST با توالی‌های ثبت شده در پایگاه اطلاعاتی ژنومی GenBank و EzTaxon-e مقایسه شد (31). به این ترتیب نزدیک‌‏ترین سویه‌ها با ترادف 16S rRNA جدایه‏ها، تعیین شد. همچنین، توالی بدست آمده در این پژوهش، در بانک ژنی NCBI ثبت شد و شماره ژنی[12] مربوطه دریافت شد.

تحلیل فیلوژنی باکتری‌های تولیدکننده اتانول با باکتری‌های نزدیک به آن‌ها با نرم‌افزار ClustalX (نسخه 2) انجام شد. درخت فیلوژنی توالی ژن 16S rRNA جدایه‌های ZYM7، ZYM8 و ZYM9 با توالی حاصل از جستجو در پایگاه اطلاعاتی Genbank و EzTaxon-e، به کمک نرم‌افزار MEGA (نسخه 5) و با الگوریتم Maximum likelihood و joining Neighbour، رسم شد. بررسی اعتبار شاخه با الگوریتم
bootstrap analysis و با 1000 بار نمونه‌گیری انجام شد.

نتایج

شمارش باکتری‌های تولید کننده اتانول به روش شمارش سلول‌های زنده انجام شد. نتایج نشان داد که تعداد این باکتری‌ها در تانک تخمیر شرکت فارکو خرمشهر و شرکت بیدستان قزوین به ترتیب cfu mL^-1 10³×2/2 و 10⁶×5/1 بود. از نمونه‌های جمع‌آوری شده از تانک‌های تخمیر، تعداد سه جدایه باکتریایی تولید کننده اتانول، جداسازی و به اسامی جدایه‌های ZYM7، ZYM8 و ZYM9 نام‏گذاری شد. سنجش اولیه تولید اتانول توسط باکتری‌های جداسازی شده از تانک تخمیر در محیط کشت مایع ZSM بررسی و تولید اتانول با دو روش کمی رنگ‌سنجی دی‌کرومات پتاسیم و کروماتوگرافی گازی طیف سنجی جرمی سنجش شد. اتانول تولید شده توسط جدایه‌های ZYM7، ZYM8 و ZYM9 (پس از 48 ساعت گرماگذاری) به ترتیب
00/5، 60/7 و 00/4 گرم بر لیتر اندازه‌گیری شد.

برای تولید بیشتر اتانول، شرایط مناسب رشد جدایه‌ها بهینه‌سازی شد. به این منظور تاثیر منابع مختلف کربن شامل: گلوکز، گزیلوز، فروکتوز، مالتوز، ساکارز، ریبوز، گالاکتوز، مانوز و آرابینوز بر تولید اتانول بررسی شد. نتایج تولید اتانول در جدول 1 نشان می‌دهد که هر سه جدایه علاوه بر مصرف بیشتر قندها، توانایی مصرف قند پنج کربنه زایلوز را داشتند. جدایه ZYM7 توانست با مصرف زایلوز، بیش‏ترین اتانول به مقدار 00/13 گرم بر لیتر را تولید کند. همچنین، همه جدایه‌ها، توانایی مصرف مالتوز را نداشتند (داده‌ها نشان داده نشد). تاثیر منابع مختلف نیتروژن بر تولید اتانول توسط جدایه‌ها نیز مطالعه شد. نتایج جدول 1 نشان می‌دهد بهترین منبع نیتروژن برای جدایه ZYM8، آلانین (03/9 گرم بر لیتر اتانول) بود در حالی که برای جدایه‌های ZYM7 و ZYM9 پپتون (به ترتیب 90/7 و 55/3 گرم بر لیتر اتانول) به عنوان مناسب‌‏ترین منبع نیتروژن بود.

جدول 1- تاثیر منابع کربن و نیتروژن بر تولید اتانول (گرم بر لیتر) جدایه‌ها

بهینه‌سازی شرایط رشد جدایه‌ها با بررسی تاثیر عوامل مختلف محیطی شامل: دما، اسیدیته، زمان تخمیر و هوادهی محیط رشد برتولید اتانول انجام شد. تاثیر دما بر رشد و تولید اتانول جدایه‌ها بررسی و نتایج در جدول‏2 خلاصه شد. نتایج نشان داد که بهترین دما برای رشد و تولید اتانول توسط باکتری‌های جداشده، 30 تا 35 درجه سانتی‏گراد است (شکل 1). بیش‏ترین تولید اتانول توسط جدایه ZYM7 و در دمای 30 درجه سانتی‏گراد، 74/5 گرم بر لیتر اتانول سنجش شد. همچنین، هر سه جدایه توانایی تولید اتانول در دمای 25 و 40 درجه سانتی‏گراد را نداشتند.

شکل1- نمودار تاثیر دمای رشد بر تولید اتانول توسط جدایه‌های باکتریایی

  : 25 درجه سانتی‏گراد؛ :30 درجه سانتی‏گراد

: 35 درجه سانتی‏گراد؛ : 40 درجه سانتی‏گراد

برای بررسی تاثیر زمان بر شرایط بهینه تخمیر، تولید اتانول در دمای 35 درجه سانتی‏گراد و در زمان‌های 24، 48، 72 و 96 ساعت بررسی شد. نتایج در جدول 2 نشان می‌دهد که بهترین زمان برای رشد و تولید اتانول باکتری‌های جداشده 48 ساعت بود و بیش‏ترین اتانول به مقدار 74/5 گرم بر لیتر، توسط جدایه ZYM7 تولید شد (شکل 2).

همچنین، برای بررسی شرایط بهینه اسیدیته، تولید اتانول در اسیدیته مختلف 2، 4، 6 و 8، سنجش شد. اسیدیته بهینه برای رشد و تولید اتانول باکتری‌های جداشده، 6 بود و بیش‏ترین اتانول توسط ZYM7 به مقدار 76/5 گرم بر لیتر تولید شد (شکل 3).

شکل2- نمودار تاثیر زمان تخمیر بر تولید اتانول توسط باکتری‌های جداشده

 : 24 ساعت؛ : 48 ساعت؛ : 72 ساعت؛ : 96 ساعت

شکل3- نمودار تاثیر اسیدیته محیط رشد بر تولید اتانول توسط باکتری‌های جداشده

 : اسیدیته 2؛ : اسیدیته 4؛ : اسیدیته 6؛ : اسیدیته 8.

برای بررسی تاثیر غلظت سوبسترا محیط رشد بر فرآیند تولید اتانول، غلظت مختلف قند گلوکز به محیط کشت افزوده و تولید اتانول سنجیده شد. نتایج این پژوهش نشان داد که باکتری‌های جداشده توانایی استفاده از دو درصد قند گلوکز را داشتند (شکل 4). بیش‏ترین اتانول در غلظت 5/1 درصد قند گلوکز و توسط جدایه ZYM8 به مقدار 67/6 گرم بر لیتر، تولید شد (جدول 2).

شکل4- نمودار تاثیر غلظت گلوکز اولیه (سوبسترا) بر تولید اتانول توسط باکتری‌های جداشده

 : 5 گرم؛ :10 گرم؛ : 15 گرم؛ :20 گرم گلوکز (گرم‏بر لیتر)

نتایج جدول 2 نشان می‌دهد علیرغم تولید اتانول در هر دو شرایط هوازی و بی‌هوازی توسط جدایه‌های ZYM7 و ZYM9، هوادهی تاثیر بسزایی بر تولید اتانول داشت. بیش‏ترین اتانول در هوادهی150 دور در دقیقه و توسط ZYM7 به مقدار 74/5 گرم بر لیتر، تولید شد (جدول 2). در مقابل کاهش هوادهی به مقدار 50 دور در دقیقه و یا افزایش آن به مقدار 200 دور در دقیقه، کاهش تولید اتانول را نشان داد (شکل 5).

شکل 5- نمودار تاثیر هوادهی بر تولید اتانول توسط باکتری‌های جداشده

 : 50؛ : 100؛ : 150؛ : 200 (دور در دقیقه)

جدول 2- تاثیر عوامل مختلف محیطی بر تولید اتانول (گرم بر لیتر) جدایه‌ها

برای شناسایی جدایه‌های تولید‌کننده اتانول، ویژگی‌های ریخت‏شناسی و فیزیولوژیکی جدایه‌ها از نظر مشخصات کلونی، رنگ آمیزی گرم و آزمون‌های بیوشیمیایی شامل: تولید کاتالاز، اکسیداز، اندول، حرکت و نیز آزمون‌های متیل رِد و وژزپروسکوئر، بررسی شد. ریخت‏شناسی کلونی جدایه‌های ZYM8 و ZYM9 به شکل کرم، شفاف، براق، نرم و نیز به شکل موکوئیدی بود. برخی نیز دارای کلونی‌های کرم مایل به سفید بودند (ZYM7). ویژگی‌ ریخت‏شناسی و فیزیولوژیکی جدایه‌های تولید­کننده در جدول 3 خلاصه شده است. نتایج مشخصات ریخت‏شناسی و آزمون‌های بیوشیمیایی بر اساس جداول شناسایی کتاب سیستماتیک باکتریولوژی بِرگی[13] (27) نشان داد که جدایه ZYM7 به جنس لاکتوباسیلوس و هر دو جدایه ZYM8 و ZMY9 به جنس استوباکتر متعلق اند.

جدول 3- مشخصات ریخت‏شناسی و نتایج آزمون‌های بیوشیمیایی سه جدایه تولیدکننده اتانول

شناسایی مولکولی جدایه‌ها با استفاده از توالی ژن 16S rRNAبررسی شد. به این منظور واکنش زنجیره‌ای پلیمراز ژن 16S rRNAانجام شد. پس از تعیین توالی، هومولوژی ژن 16S rRNAباکتری‌های تولید کننده اتانول با سایر توالی‌های ثبت شده در بانک اطلاعاتی NCBI و EzTaxon-e، تعیین شد. نتایج BLAST نشان داد که جدایه ZYM7 دارای 99 درصد هومولوژی با لاکتوباسیلوس رامنوسوس[14] بود. همچنین، جدایه‌های ZYM8 و ZYM9 به ترتیب 99 و 97 درصد هومولوژی با استویاکتر پاستیوریانوس[15] را نشان داد. توالی ‌ژن
16S rRNAباکتری‌های مشابه و جدایه‌ها به کمک نرم‏افزار ClustalX، هم‌ردیف‌سازی شد و درخت فیلوژنی آن به روش Neighbor joining و به کمک نرم افزار Mega5 رسم شد. موقعیت فیلوژنی جدایه‌ها با سایر باکتری‌ها در شکل 6 نشان داده شد. توالی ژن
16S rRNA جدایه‌های ZYM7، ZYM8 و ZYM9 نیز در بانک ژنی NCBI به ترتیب به شماره ژنی KF484801، KF484802 و KF484803 ثبت شد.

شکل 6- دندوگرام توالی ژن 16S rRNA باکتری‌های تولیدکننده اتانول ZYM7 که به جنس لاکتوباسیلوس و ZYM8 و ZYM9 به جنس استوباکتر نزدیکی نشان داد. اعداد ذکر شده در محل انشعاب نشانگر درصد نمونه‌گیری bootstrap از 1000 نمونه است. باکتری
 Sulfolobus acidocaldarius به عنوان out group قرار داده شد.