بررسی ژن‌های stx1، stx2 و eaeA به روش Multiplex PCR در اشریشیاکلی‌های جداسازی شده از گوشت گوسفندان استان چهارمحال و بختیاری

مقدمه

حیواناتی که گوشت آن‏ها‏‏ برای مصارف غذایی استفاده می‏شوند، مهم‏‏ترین مخازن بسیاری از عوامل بیماری‌زا از قبیل کمپیلوباکتر، سالمونلا انتریکا، اشریشیاکلی‌های تولید کننده‌ی شیگاتوکسین و یرسینیا انتروهمولیتیکا هستند (1). رعایت نکردن بهداشت در هنگام ذبح و حمل و نقل گوشت این حیوانات می‌تواند به آلودگی آن‏ها‏‏ به عوامل بیماری‌زا منجر شود. این عوامل بیماری‌زا از طریق زنجیره‌ی غذایی ممکن است به انسان انتقال یابند و به ایجاد بیماری‌های ناشی از مواد غذایی در انسان منجر شوند (2).

اشریشیاکلی‌های تولیدکننده شیگاتوکسین در اواخر دهه 1970 درکانادا به عنوان یک عامل اتیولوژیک اسهال شناسایی شدند (3). سویه‌های اشریشیا کلی، وروتوکسیژنیک توکسینی ترشحمی‏کنندکهبهدلیلتواناییآندرکشتنسلول‌های ورو[1] وروتوکسینوبهدلیلشباهتشبهنوروتوکسینشیگایمترشحه ازشیگلا‏دیسانتریتیپ یک، توکسینشبهشیگا نامیدهمی‏شودو سویه‌های تولید کننده آن به اشریشیاکلی‌های تولید کننده‌ی شیگاتوکسین نیز معروفند (4). توکسین‌های ورو به دو گروه stx1 و stx2 تقسیم بندی می‏شوند. وروتوکسین با اثر بر RNA ریبوزومی سبب ممانعت از سنتز پروتئین‌ها می‌شود. انواعی از اشریشیا‏کلی که این سم را تولید می‏کنند موجب سندروم‌های خطرناکی از جمله کولیت هموراژیک و به دنبال آن نارسایی کلیوی به ویژه در کودکان و پورپورای ترمبوتیک ترمبوسایتوپنیک در انسان می‏شوند (5- 7).

ازدیگرعواملبیماریزایاینسویه‌ها،پروتئینیبهناماینتیمین[2] استکهمسئولاتصالباکتریبهرودهوایجادآسیب‌های خاصیبهناماتصالومحوشدن درسلول‌هایاپیتلیالروده است. بههمیندلیلبهژنکدکنندهاینپروتئین eae[3] می‌گویند (8).

تحقیقات نشان می‌دهد سویه‌های تولیدکننده شیگاتوکسین در چهارپایان نیز وجود داشته که 40 درصد آن‏ها‏‏ برای انسان بیماری‌زا شناخته شده اند. این مسئله چهارپایان را به عنوان مخزن مهم برای سویه‌ها مطرح می‌سازد (9).

بروز کلینیکی عفونت با اشریشیاکلی‌های شیگاتوکسین‌زا می‌تواند از اسهال آبکی خفیف تا کمپلکس‌های جدی از قبیل کولیت هموراجیک و سندروم اورمی همولیتیک تا حتی مرگ باشد (10 و 11). اگرچه سروتیپ O157 اشریشیاکلی معمول‏ترین سروتیپ تولید کننده‌ شیگاتوکسین است اما نشان داده شده که بیش از 250 سروتیپ مختلف از آنتی ژن O، شیگاتوکسین تولید می‌کنند و بیش از 100 عدد از آن‏ها‏‏ با بیماری‌های انسانی مرتبط اند (12). سایر سروتیپ‌های شیگاتوکسین‌زای اشریشیاکلی (غیر از O157) عامل ایجاد 60 درصد از عفونت‌های اشریشیاکلی شیگاتوکسین‌زا هستند و در بسیاری از نقاط دنیا از قبیل آرژانتین، استرالیا، اسپانیا، دانمارک، شیلی و آلمان شایع هستند (12).

بیشتر مطالعاتی که در زمینه بررسی آلودگی گوشت‌های مختلف از نظر آلودگی به ژن‌های حدت اشریشیاکلی در نقاط مختلف انجام شده است نشان دهنده‌ وضعیت متفاوت آلودگی به این ژن‌ها از مقادیر پایین تا بالا در مناطق مختلف بوده است. برای مثال طی مطالعاتی که در سال‌های اخیر در کره، ایتالیا و آرژانتین انجام شده، میزان آلودگی به اشریشیاکلی شیگاتوکسین‌زا به ترتیب 6/2، 4/43 و 87 گزارش شده است (13- 15). متاسفانه در کشور ما تنها در یک مطالعه به بررسی سایر سروتیپ‌های تولید کننده‌ شیگاتوکسین (غیر از O157) که عامل ایجاد 60 درصد از عفونت‌های اشریشیاکلی شیگاتوکسین‌زا هستند پرداخته شده است (16) و بیشتر مطالعات انجام شده روی ردیابی ژن‌های تولید کننده شیگاتوکسین در اشریشیاکلی O157:H7 محدود بوده است (17- 21).

در مطالعه‌ حاضر، با توجه به توانایی بالقوه‌ گوشت در انتقال عوامل بیماری‌زا به انسان و با در نظر گرفتن اهمیت بیماری‌زایی ژن‌های stx1، stx2 و eaeA، به جست و جوی این ژن‌ها در اشریشیاکلی‌های جداسازی شده از نمونه‌های گوشت گوسفندان استان چهارمحال و بختیاری به روش MultiplexPCR پرداخته شد.

مواد و روش‏ها‏

در این مطالعه، از 270 نمونه گوشت گوسفند در پاییز و زمستان سال 1389 در شرایط استریل نمونه گیری انجام شد. برای جستجوی اشریشیاکلی 25 گرم از هر نمونه به شکل هموژن شده به 225 میلی‏‏لیتر آبگوشت تریپتون سوی[4] (مرک، ساخت آلمان) اضافه شد و به مدت 18 تا 24 ساعت در 37 درجه سانتی‏گراد انکوبه شدند. سپس، 100 میکرولیتر از نمونه غنی شده بر روی محیط مکانیکی آگار (مرک، ساخت آلمان) به منظور ردیابی اشریشیاکلی کشت داده شد و به مدت 18 تا 24 ساعت در 37 درجه سانتی‏گراد گرم خانه گذاری شد. پرگنه‌های مشکوک روی محیط آبگوشت تریپتون سوی کشت داده شدند و آزمون‏های اندول، متیل رد، وگس پروسکوئر و سیترات (IMViC) بر روی نمونه‌های مشکوک انجام شد. جدایه‌های اشریشیاکلی تا زمان انجام PCR در محیط آبگوشت تریپتون سوی به شکل گلیسیرینه در دمای منفی 20 درجه سانتی‏گراد نگه داری شدند.

جدایه‌های اشریشیاکلی پس از استخراج DNA، به وسیله‌ PCR با استفاده از پرایمرهای توصیف شده توسط ویدال[5] و همکاران (22) آزمایش شدند. (جدول 1). مواد PCR از شرکت سیناژن ساخت ایران تهیه شد و واکنش در حجم 25 میکرولیتر (5/2 میکرولیتر بافر10XPCR، 5/1 میکرولیتر MgCl2 50 میلی‏مولار، 5/0 میکرولیتر dNTP 10 میلی‏مولار، 5/1 واحد آنزیم Taq پلی مراز، 5/0 میکرولیتر با غلظت 10 میکرومولار از هر پرایمر، 1 میکرولیتر DNA الگو) انجام شد. برنامه دمایی مورد استفاده به ترتیب واسرشت ابتدایی در 94 درجه سانتی‏گراد به مدت 5 دقیقه و 40 سیکل از قرار 94 درجه به مدت 45 ثانیه، 64 درجه به مدت 45 ثانیه، 72 درجه به مدت 60 ثانیه و گسترش نهایی در 72 درجه به مدت 5 دقیقه در دستگاه ترموسایکلر (بایورد، ساخت آمریکا) انجام شد. در پایان، محصولات PCR روی ژل آگاروز (ساخت سیناژن، ایران) 5/1 درصد الکتروفورز (بایورد، ساخت آمریکا) شد.

جدول 1- مشخصات پرایمرهای مورد استفاده

نتایج

میزان آلودگی نمونه‌های مورد مطالعه به اشریشیاکلی در کل 3/33 درصد (90 از 270) بود. میزان ژن‌های stx1 و eaeA در جدایه‌های اشریشیاکلی به به ترتیب 1/11 (10 از 90) و 8/8 درصد (8 از 90) بود. ژن stx2 در هیچ کدام از جدایه‌ها یافت نشد. جدایه‌های اشریشیاکلی که واجد ژن stx1 بودند هیچ کدام حامل ژن eaeA نبودند (شکل1)

اگرچه میزان آلودگی به اشریشیاکلی در فصل زمستان از فصل پاییز بیشتر بود اما هیچ‌کدام از آن‏ها‏‏ واجد ژن‌های کد کننده‌ی شیگاتوکسین (stx1وstx2) نبودند (جدول2).

.

شکل 1- تصویر الکتروفورز ژل آگاروز. M: نشانگر‏‏100 جفت بازی پلاس، NC: کنترل منفی، PC: کنترل مثبت، 1 تا 3: نمونه‌های مثبت از نظر آلودگی به ژن stx1، 4 تا 6: نمونه‌های مثبت از نظر آلودگی به ژن eaeA

جدول2- مشخصات نمونه‌های آزمایش شده