
تعداد نشریات | 43 |
تعداد شمارهها | 1,685 |
تعداد مقالات | 13,846 |
تعداد مشاهده مقاله | 32,767,774 |
تعداد دریافت فایل اصل مقاله | 12,957,663 |
جداسازی و شناسایی مولکولی یک سویه جدید از Microbacterium resistens، قادر به تحمل شرایط سخت | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
زیست شناسی میکروبی | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
مقاله 5، دوره 2، شماره 5، فروردین 1392، صفحه 27-42 اصل مقاله (615.75 K) | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
نوع مقاله: پژوهشی- فارسی | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
نویسندگان | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
محمود غلامی1؛ زهرا اعتمادی فر* 2 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1کارشناس ارشد میکروبیولوژی، دانشگاه اصفهان، ایران | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
2استادیار میکروبیولوژی، دانشگاه اصفهان، ایران | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
چکیده | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
مقدمه: استفاده از باکتریهای مقاوم به اشعه، فرابنفش و دیگر شرایط سخت، برای پاکسازی زیستی و بازیابی فلزات موجود در زبالههای محیطی و صنعتی به خاطر توانایی بقا و کاتالیز عملکردی مطلوب تحت شرایط استرس بالای اشعه بسیار حائز اهمیت است. مواد و روشها: پس از غربالگری اولیه و ثانویه بهوسیله تابش اشعه با لامپ UV، یک جدایه بهدست آمد که براساس ویژگیهای ریختشناسی و بیوشیمیایی، تعیین توالی ژن S rRNA16 و تحلیل فیلوژنتیک، شناسایی شد. به منظور مطالعه ویژگیهای مقاومت جدایه فوق، سویه در معرض برخی شرایط سخت از قبیل اشعه فرابنفش (25 ژول)، خشکی (28 روز)، هیدروژن پراکسید (1 تا 5 درصد)، میتومایسین C (1 تا 8 میکروگرم)، غلظتهای مختلف نمک (5 تا 25 درصد) و مقادیر مختلف اسیدیته (1تا 11) گذاشته و رشد یا بقای باکتری در محیط TGY بهوسیله اسپکترومتری یا فلوسیتومتری ارزیابی شد. نتایج: جدایه MG6 باکتری میلهای گرم مثبت مقاوم به اشعه فرابنفش بود که توالی S rRNA16 آن 7/99 درصد شباهت با Microbacterium resistens نشان داد. این شباهت با تحلیل فیلوژنتیک تائید شد. رشد بهینه سویه در اسیدیته 5 و غلظت 5 درصد کلریدسدیم دیده شد. همچنین به غلظت 1تا 4 درصد هیدروژنپراکسید و 2 میکروگرم میتومایسین C مقاومت نشان داد. تحلیل میزان بقا نشان داد که این سویه در مقایسه با Deinococcus radioduransR1 مقاومت بالایی در برابر اشعه فرابنفش، ولی در برابر خشکی مقاومت متوسطی دارد. بحث و نتیجهگیری: در این تحقیق، سویه جدیدی از M. resistensجداسازی شد که مقاوم به اشعه UV بود و تحمل برخی شرایط سخت مثل اسیدیته، عوامل اکسیدان و موتاژن، شوری و خشکی را نیز نشان داد. مقاومت سویه MG6 به اشعه UV قابل مقایسه با سویه مقاوم به اشعه D. radioduransR1 بود. تحقیق حاضر اولین گزارش درباره مقاومت به شرایط سخت سویه جدید M. resistens در ایران میباشد. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
کلیدواژهها | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
اشعه فرابنفش؛ M. resistens؛ تکنیک فلوسایتومتری؛ شرایط سخت | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
اصل مقاله | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
مقدمه همزمان با پیشرفت تکنولوژی، آلودگیهای زیست- محیطی نیز افزایش یافتهاند. از جمله تدابیر امنیتی در برای پاکسازی و حفظ محیط زیست، اجرای سیاستهای لازم در طرح مدیریت زیستی میباشد. فاضلابهای رادیواکتیو و بازیابی فلزات مطلوب از قبیل اورانیوم، از جمله ترکیباتی هستند که امروزه نظر بسیاری از محققان را به خود جلب کردهاند. استفاده از روشهای شیمیایی به منظور پاکسازی زیستی بسیار پر هزینه است و در بیشتر موارد فاقد اختصاصیت مورد نیاز به منظور پاکسازی درست و بازیابی فلزات موجود در این جایگاهها میباشد (1). اما میکروبها درجه بالایی از اختصاصیت را نشان میدهند. محققان به تازگی از روشهای بیولوژیک برای زدودن پسابهای رادیواکتیو و بازیابی فلزات از محیط زیست بهره برده اند. به دنبال تحقیقات انجام شده در سال 1992 مشخص شدکه باکتریهایی نظیر Geobacter و جنسهای مختلف Pseudomonas قادر به سمیتزدایی از این گونه پسابها میباشند. اما به علت اینکه حساسیت بالایی نسبت به پرتوهای یونیزان دارند در محیطهای رادیواکتیو کاربرد چندانی ندارند. استفاده از باکتریهای مقاوم به اشعه و دیگر شرایط سخت برای پاکسازی زیستی و بازیابی فلزات موجود در زبالههای رادیواکتیو به خاطر توانایی بقا و کاتالیز عملکردی مطلوب تحت شرایط استرس بالای اشعه بسیار مهم است (2). همچنین، باکتریهای مقاوم به اشعه، مقاومت در خور توجهی به سایر شرایط سخت نشان میدهند که از جمله میتوان به انواعی از استرسهای شیمیایی و فیزیکی از قبیل خشکی، اشعه یونیزهکنده، میتومایسین[1]C، هیدروژن پراکسید، شرایط اسیدی و قلیایی و غلظت بالای نمک NaCl اشاره کرد. رادیکالهای آزاد اکسیژن[2] تولید شده توسط شرایط استرس به پروتئین، لیپید، نوکلئیک اسید و کربوهیدراتها آسیب رسانده و باعث شکستن DNA دو رشتهای (DBSs)[3]میشود. خانواده داینوکوکاسه در محیطهای غنی از ترکیبات آلی از قبیل خاک، مدفوع حیوانات، لجن و ریزوسفر گیاهان یافت میشوند. علاوه بر این در شرایط محیطی سخت از قبیل بیابانها، صخرهها، چشمههای آبگرم و مناطق منجمد نیز وجود دارند. همچنین، همه41 سویهی رادیودورانس که برای حساسیت به اشعه یونیزه کننده بررسی شدهاند، به تناسب حساس به خشکی نیز میباشند. این مطلب نشان دهنده این است که مقاومت به اشعه و خشکی دو پدیده مرتبط میباشند. D. radiodurans مقاومت در خور توجهی به عوامل مختلف ایجادکننده ROS، از جمله خشکی، اشعه یونیزان، اشعه UV، میتومایسینC و هیدروژن پراکسید، دارد و میتواند دوز بالای اشعه یونیزهکننده را که قادر به ایجاد تا 2000 قطعه در DNA ژنومی میباشد تحمل کند. مقاومت این باکتری به خاطر مکانیسمهایی میباشد که از پروتئینها و دیگر ماکرومولکولهای سلولی در برابر استرس محافظت میکنند و همچنین، فرآیندهای ترمیم DNA در این باکتری بسیار کارآمد هستند. سلولهایی که در معرض اشعه فرابنفش قرار میگیرند. علاوه بر تخریب DNA، قطعه قطعه شدن ژنوم نیز در آنها اتفاق میافتد. همچنین، میزان سنتز پروتئین نیز در این سلولها کاهش مییابد (3). برخلاف اشعه یونیزه کننده، اشعه فرابنفش حتی در دوزهای بالاتر از 1485 ژول بر متر مربع نیز قادر به ایجاد جهش نقطهای در داینوکوکوس رادیودوراس نمیباشد. همچنین، فقدان DNA پلیمراز TLS در داینوکوکوس رادیودورانس باعث صحت بیشتر ترمیم آسیبهای ایجاد شده در اثر اشعه میشود (4). مشاهده شده است داینوکوکوس رادیودورانس در حالت خشک نسبت به سوسپانسیون آبی سه بار بیشتر مقاومت به اشعه را نشان میدهد زیرا شرایط با آب کمتر باعث ایجاد رادیکال هیدروکسیل کمتری می شود (5). همچنین، باکتریهای هوازی در مقابل نور UV و هیدروژن پراکسید مقاومت بیشتری نسبت به باکتریهای میکروآئروفیلها نشان دادهاند (6). به طور کلی در باکتریهایی که در معرض استرس اکسیداتیو قرار گرفتهاند میزان کربونیلاسیون پروتئینها افزایش مییابد و ارتباط معکوسی با میزان بقا دارد. با وجود این، این میزان در باکتریهای مقاوم به اشعه فرابنفش در مقایسه با سایر ارگانیسمهای حساس به اشعه بسیار پایینتر میباشد (7). کربونیلاسیون پروتئینها به عنوان یک آسیب اکسیداتیو رایج شناخته میشود و بیشتر به عنوان یک نشانگر زیستی استرس اکسیداتیو استفاده میشود. این فرآیند به تغییر فعالیت عملکردی و برهم کنش پروتئینها منجر میشود که در نهایت باعث توقف فرآیندهای سلولی و مرگ سلول میشود (8). طبق مطالعات انجام شده تیمار اولیه باکتریهای مقاوم به اشعه، با میزان کمتر H2O2 برای مدت کوتاهی مقاومت آن را در دوزهای بالاتر اشعه افزایش میدهد. درواقع بیانگر آن است که باکتریها میتوانند پاسخهای خود را در مقابل این استرس سازگار کنند (9). باکتریهای مقاوم به اشعه از مکانیسمهای متعددی برای مقاومت در برابر اثرات کشنده رادیکالهای آزاد اکسیژن استفاده میکنند که از جمله این استراتژیها میتوان به آنزیمهای آنتی اکسیدانت، کاتالاز و سوپراکسید دیسموتاز اشاره کرد (10). درسالهای گذشته، گونهها و سویههای جدید زیادی از داینوکوکوسهای مقاوم به اشعه یافت شده است. بسیاری از این باکتریها در صحراهای ساهارا و تاکیماکان یافت شده اند. همچنین، داینوکوکوسهای مقاوم به اشعه در محیطهایی مثل اتمسفر، قطب جنوب، آبهای تازه، خاکهای مختلف، ماهیهای دریایی و چشمههای آب داغ جداسازی شدهاند (11). از جمله باکتریهای دیگری که مقاوم به اشعه میباشند میتوان به Rubrobacter radiotolerans،
مواد و روشها جداسازی و غربالگری باکتریهای مقاوم به اشعه پس از جمع آوری نمونههای خاک سطحی از ناحیه صخرههای اطراف کوه صفه در جنوب شهر اصفهان که در برابر نور مستقیم خورشید قرار داشت، به منظور غنیسازی اولیه باکتریهای موجود در نمونهها، ابتدا یک گرم از هر نمونه به 50 میلیلیتر محیط TGY برات (تریپتون 5گرم، عصاره مخمر 5گرم، گلوکز 1 گرم و K2HPO4 1 گرم در یک لیتر آب مقطر) تلقیح و به مدت سه روز در انکوباتور شیکردار در دمای 30 درجه سانتیگراد و 180 دور در دقیقه انکوبه شدند. به منظور غربالگری اولیه 100 میکرولیتر از نمونههای غنی شده به پلیت TGY آگار تلقیح و با میله شیشهای سرکج پخش شدند. سپس، پلیتها پس از یک انکوباسیون اولیه در 30 درجه سانتیگراد به مدت 2 تا 4 ساعت برای رویش اسپورها، در فاصله 14 سانتیمتری از یک لامپ دارای تابش فرابنفش قرار گرفتند. میزان کل اشعه 15 ژول در نظر گرفته شد (13). پس از اشعه پلیتها به منظور اجتناب از ترمیم وابسته به نور در داخل فویل آلومینیومی پیچیده و به مدت سه تا ده روز در 30 درجه سانتیگراد انکوبه شدند. همزمان با این کار یک پلیت حاوی محیط کشت TGY آگار نیز در زیر اشعه قرار داده و پس از اشعه بر روی آن کشت داده شد، تا از اثرات مهاری اجزای محیط کشت که در معرض اشعه فرابنفش قرار گرفتهاند، بر روی باکتریها اطمینان حاصل شود. در نهایت کلونیهای رنگی مقاوم به اشعه فرابنفش براساس مشخصات ظاهری کلونی از یکدیگر متمایز، جداسازی و خالصسازی شدند. شناسایی اولیه توسط واکنش گرم و خصوصیات ریختشناسی و بیوشیمیایی انجام شد. به منظور غربالگری ثانویه کلونیهای جداسازی شده در مرحله اول، یک بار دیگر آزمایش مقاومت به اشعه فرابنفش با دوز نهایی 25 ژول برای این سویهها انجام شد (2). بدینمنظور یک کشت شبانه از سویههای جداسازی شده آماده شد، سپس 100 میکرولیتر از باکتریهای میانه فاز لگاریتمی معادل کدورت 5/0 مک فارلند به پلیت TGY آگار تلقیح و در فاصله 14 سانتیمتری از اشعه فرابنفش قرار داده شدند (14). در مرحله غربالگری ثانویه, یک سویه مقاوم به اشعه فرابنفش غربالگری شد که به شکل MG6 نامگذاری شد.
شناسائی مولکولی باکتریهای انتخاب شده با تعیین توالی ژن SrRNA16 پس از بررسیهای بیوشیمیائی، به منظور شناسائی دقیق باکتری جداسازی شده از روش مولکولی واکنش زنجیرهای پلیمراز[4] (PCR) استفاده شد. ابتدا DNA در این باکتری با روش جوشاندن استخراج شد سپس به منظور تشخیص مولکولی از یک جفت پرایمر عمومی[5]استفاده شد. این پرایمرها به دلیل درصد مناسب بازهای G+C و همچنین، کارایی بالای آنها استفاده شد. به این منظور از یک قطعه 20 نوکلئوتیدی به عنوان پرایمر رفت[6]با نام 5´AACTGGAGGAAGGTGGGGAT3´( RW01) و یک قطعه 19 نوکلئوتیدی به عنوان پرایمر برگشت[7]با نام (DG74) 5´AGGAGGTGATCCAACCGCA3´ استفاده شد (15). با استفاده از آب دوبار تقطیر استریل فاقد نوکلئاز، حجم آن به 25 میکرولیتر رسانده شد. سپس واکنش PCR در طی 30 چرخه دمایی به شکل: دمای دناتوراسیون اولیه به مدت 5 دقیقه در 95 درجه سانتیگراد فقط در سیکل اول، دمای دناتوراسیون به مدت 45 ثانیه در 94 درجه سانتیگراد، دمای اتصال پرایمرها به مدت 30 ثانیه در 54 درجه سانتیگراد، دمای تکثیر به مدت 45 ثانیه در 72 درجه سانتیگراد در و درنهایت دمای تکثیر نهایی به مدت 5 دقیقه در 72 درجه سانتیگراد انجام شد. در نهایت یک قطعه 370 جفت بازی به وسیله PCR تکثیر و به منظور تعیین توالی به شرکت بیونیر کره جنوبی ارسال شد. نتایج حاصل از تعیین توالی، به منظور مشخص شدن جنس و گونه سویه مورد نظر با توالیهای موجود در پایگاه اطلاعاتی NCBI و EMBL مقایسه شد و قرابت بالاتر از 98 درصد به عنوان جنس و گونه باکتری مجهول درنظر گرفته شد (2).
تحلیل فیلوژنتیک به منظور تأیید نتایج بلاست، برای سویه MG6 درخت فیلوژنتیکی نیز ترسیم شد که در ابتدا 12 توالی با بیشترین شباهت با سویه MG6 انتخاب شدند. پس از همردیفسازی توالیها در نرم افزار CLC Genomic Workbench، ویرایشهای لازم بر روی توالیهای همردیف شده انجام شد (16). در مرحله بعد درخت فیلوژنتیکی با استفاده از نرم افزار MEGA5 و برپایه روش Neighbor-Joining و با بوت استرپ[8] 1000 تکرار ترسیم شد. همچنین، فاصله ژنتیکی با روش Maximum Composite Likelihood محاسبه شد (17). بررسی مقاومت به شرایط سخت در سویههای جداسازی شده سنجش میزان مقاومت به اشعه فرابنفش UV-C به کمک تکنیک فلوسایتومتری کشت شبانه ای از باکتری در محیط TGY برات تهیه و سپس از باکتریهای میانه فاز لگاریتمی معادل کدورت 5/0 مک فارلند در PBS آماده شد، سپس دو میلیلیتر از هر نمونه به یک پتریدیش استریل اضافه و به مدت 3 ساعت معادل 30 ژول بر سانتیمتر مربع، در فاصله 14 سانتیمتری از اشعه فرابنفش با طول موج 254 نانومتر قرار گرفت (2). پس از تابش اشعه محتویات هر پتریدیش در 4000 دور به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ و رسوب باکتریایی هر نمونه در 5/0 میلی لیتر PBS حل شد. در نهایت به منظور بررسی درصد بقا از دستگاه فلوسایتومتری استفاده شد. بدین منظور برای رنگ آمیزی سلولهای زنده و مرده از رنگ رودامین 123 استفاده شد (18). برای تهیه محلول ذخیره این رنگ 5 میلیگرم از این رنگ در 5 میلیلیتر اتانول حل شد. محلول رودامین 123 نسبت به نور حساس میباشد و برای جلوگیری از انجام واکنش نوری، لوله آزمایش حاوی این محلول بهوسیله فویل آلومینیومی کاملاً پوشیده و در منفی20 درجه سانتیگراد قرار داده شد. و این استوک برای هربار استفاده به نسبت 1 به 100 در PBS رقیق شد. سپس 400 میکرولیتر به 100 میکرولیتر از سوسپانسیون باکتریایی افزوده شد و به مدت 10 دقیقه در تاریکی در دمای محیط قرار داده شد در نهایت به منظور بررسی میزان بقا از تکنیک فلوسایتومتری استفاده شد (19). همچنین، برای محاسبه میزان کاهش باکتریها در برابر اشعه، شاهد بدون اشعه هم در نظر گرفته شد. لازم به ذکر است که طول موج تحریکی یا جذبی رودامین123، 560 507 تا 560 نانومتر میباشد و همچنین، طول موج نشر این رنگ در محدوده 529 تا 580 نانومتر میباشد. سنجش میزان مقاومت به خشکی به کمک تکنیک فلوسایتومتری برای سنجش مقاومت این باکتری نسبت به خشکی از میکروپلیتهای 96 چاهکه استفاده شد. برای این منظور برای تلقیح چاهکهای میکروپلیت از باکتریهای میانه فاز لگاریتمی معادل کدورت 5/0 مکفارلند استفاده شد. برای بررسی مقاومت به خشکی در هر چاهک 50 میکرولیتر سوسپانسیون باکتریایی تلقیح و به مدت چهار هفته در 30 درجه سانتیگراد قرار داده شد (20). سپس به منظور بررسی درصد بقا از دستگاه فلوسایتومتری استفاده شد. که ابتدا پس از این مدت محتویات هر چاهک میکروپلیت به طور کامل در 50 میکرولیتر PBS حل شد و سپس به کمک PBS حجم آن به 5/0 میلی لیتر رسانده شد. در این مرحله برای رنگ آمیزی سلولهای زنده و مرده از رنگ رودامین 123 استفاده شد. که از استوک رقیق شده ردامین 400 میکرولیتر به 100 میکرولیتر از سوسپانسیون باکتریایی افزوده شد، و به مدت 10 دقیقه در تاریکی در دمای محیط قرار داده شد، در نهایت به منظور بررسی درصد بقا از تکنیک فلوسایتومتری استفاده شد (19). همچنین، میزان درصد کاهش باکتری در اثرمجاورت با ماده ضدمیکروبی طبق فرمول زیر محاسبه شد.
دراین فرمول A درصد باکتریهای زنده پس از استرس خشکی و اشعه و B درصد باکتریهای زنده درنمونه شاهد میباشد. سنجش میزان مقاومت به هیدروژن پراکسید و میتومایسین C برای انجام این آزمایش از روش کدورت سنجی و دستگاه خواننده الایزا استفاده شد. برای این کار در ابتدا محلولهایی با غلظتهای مختلف هیدروژن پراکسید (1، 2، 3، 4 و 5 درصد ، بترتیب معادل 3/0، 58/0، 89/0، 18/1 و 46/1 مولار) آماده شد و سپس اسیدیته بر روی 2/7 تنظیم شد. در ابتدا به همه چاهکها 100 میکرولیتر محیط کشت تریپتیک سوی برات (TSB) افزوده شد و چاهکهای ردیف A برای اندازهگیری کدورت محیط کشتها لحاظ شد و برای بررسی کدورت حاصل از رشد باکتری کدورت ردیف A از آنها کسر شد. سپس 50 میکرولیتر از غلظتهای مختلف هیدروژن پراکسید به این ترتیب که در یک ردیف 12 تایی، در چاهک شماره 1 و 2 مقدار 50 میکرولیتر از سرم فیزیولوژی 9/0 درصد ریخته و به عنوان شاهد مثبت در نظر گرفته شد. به ترتیب در چاهکهای بعدی 50 میکرولیتر از غلظتهای مذکور هیدروژن پراکسید با دو تکرار اضافه شد. به این شکل که، ستون شماره 1 و 2 از تمام ردیفها دارای محیط کشت بدون هیدروژن پراکسید، ستون شماره 3 و 4 از تمام ردیفها دارای محیط کشت با غلظت یک درصد هیدروژن پراکسید میباشند. به همین نحو با پیشروی در هر ردیف غلظت هیدروژن پراکسید افزایش داده شد. در مرحله بعد به هر چاهک 50 میکرولیتر از سوسپانسیون باکتریایی با کدورت معادل 5/0 مک فارلند اضافه شد. پس از آن درب میکروپلیتها گذاشته و دور آنها با پارافیلم بسته شد و به مدت 30 دقیقه بر روی شیکر قرار داده شد و سپس با توجه به دمای مطلوب رشد باکتری مورد آزمایش میکروپلیتها به مدت 24 تا 48 ساعت در 30 درجه سانتیگراد گرماگذاری شدند. سپس جذب نوری چاهکها در طول موج 630 نانومتر با استفاده از دستگاه خواننده الایزا قرائت شد و رشد یا عدم رشد در آنها بررسی شد. همچنین، به منظور بررسی مقاومت به میتومایسین C پس از آماده کردن محلولهایی با غلظتهای مختلف میتومایسین C (1، 2، 4، 6 و 8 میکروگرم بر میلیلیتر) سایر مراحل مشابه روش بالا انجام شد (21). لازم به ذکر است که برای جلوگیری از تغییر غلظت هیدروژن پراکسید و میتومایسین C برای تهیه 5/0 مک فارلند باکتری از سرم فیزیولوژی استفاده نشد، بلکه از محیط TSB برات با غلظت هیدروژن پراکسید و میتومایسین C مشابه استفاده شد. بررسی اثر غلظتهای مختلف NaClو مقادیر مختلف اسیدیته بر روی رشد سویه MG6 برای انجام این آزمایش از روش کدورت سنجی و دستگاه خواننده الایزا استفاده شد. برای این کار محیط کشت تریپتیک سوی برات با غلظتهای مختلف NaCl (0 ، 5 ، 10، 15 ، 20 و 25 درصد ) و مقادیر مختلف اسیدیته (1، 3، 5، 7، 9 و 11) آماده شد و سایر مراحل کار مشابه مرحله قبلی انجام شد.
مطالعات آماری برای تجزیه و تحلیل آماری دادهها از آزمون تحلیل واریانس (GLM-unvariate) و برای مقایسه میانگینها از آزمون دانکن استفاده شد. اندازه کمتر از 05/0 به عنوان سطح معنیداری در نظر گرفته شد (22).
نتایج جداسازی، شناسایی مولکولی و فیلوژنتیکی سویه جداسازی شده MG6خاک مناطق بیابانی با توجه به اینکه در معرض نور شدید آفتاب قرار دارند نمونه مناسبی برای جداسازی باکتریهای مقاوم به اشعه فرابنفش می باشند. پس از جمع آوری نمونهها، غربالگری اولیه و در نهایت غربالگری ثانویه, یک سویه با مقاومت بالا به اشعه فرابنفش جداسازی شد که به شکل MG6 نامگذاری شد و خصوصیات اولیه سویه جدا شده با استفاده از آزمایشهای بیوشیمیایی و ویژگیهای میکروسکوپی (ریختشناسی و واکنش گرم) و ماکروسکوپی (رنگ کلونی) تعیین شد (23). که مشخص شد یک باکتری گرم مثبت با کلونیهای زرد رنگ، هوازی، میله ای شکل و بدون اسپور می باشد. در مرحله بعد به منظور شناسایی مولکولی سویه مورد نظر یک قطعه 370 جفت بازی توسط واکنش PCR تکثیر و تعیین توالی شد. سپس به منظور شناسایی جنس و گونه سویه مورد نظر، نتایج حاصل از تعیین توالی با سایر توالیهای موجود در بانک ژنی بلاست شد و درنهایت به منظور شناسایی دقیق تر این سویه درخت فیلوژنی هم برای این سویه ترسیم شد (شکل 1). مقیاس مربوط به درخت فیلوژنی بیانگر تعداد جایگزینی نوکلئوتیدی در هر جایگاه مقایسه شده می باشد. در نهایت، توالی ژن S rRNA16 برای این سویه باکتریایی که از لحاظ مولکولی و فیلوژنتیکی با باکتری Microbacteriumresistens بیشترین شباهت (7/99 درصد) را نشان داد، با شماره دسترسی JX666609 در بانک ژنی NCBI ثبت نهایی شد.
شکل 1- درخت فیلوژنی مربوط به سویه جداسازی شده MG6 با استفاده از نرم افزار MEGA5 و براساس روش Neighbor-Joining (مقیاس بیانگر 5 جایگزینی در هر 1000 نوکلئوتید می باشد.)
بررسی اثر غلظتهای مختلف نمک NaCl و مقادیر مختلف اسیدیته بر روی رشد سویه MG6پس از بررسی اثر غلظتهای مختلف نمک کلرید سدیم بر روی رشد این سویه نتایج نشان داد که این سویه مقاومت بسیار بالایی به نمک NaCl نشان میدهد به طوریکه حتی غلظت 25 درصد نمک هم باعث مهار رشد این سویه نشد. همچنین، طبق نتایج بدست آمده بهینه رشد این سویه در غلظت 5 درصد نمک مشاهده شد (شکل 2). همچنین، ملاحظه شد که این سویه در مقادیر اسیدیته 3 تا 11 قادر به رشد میباشد به طوریکه بهینه رشد را اسیدیته 5 نشان میدهد. از طرفی اسیدیته1 باعث مهار رشد این سویه شد.
شکل 2- بررسی اثر غلظتهای مختلف نمک NaCl و مقادیر مختلف اسیدیته بر روی رشد سویه MG6
تحلیل میزان بقا پس از تابش اشعه فرابنفش و اثر تنش خشکی به کمک تکنیک فلوسایتومتری پس از بررسی اثر 25 ژول اشعه فرابنفش بر روی باکتری جداسازی شده در این پژوهش، بر طبق نتایج بدست آمده سویه R1 و MG6 به عنوان مقاومترین سویه نسبت به اشعه فرابنفش شناخته شدند. به طوریکه نوک قله مربوط به شدت فلوروسنس در همه سویهها در محدوده100 تا 1000 قرار دارد که بیانگر تعداد بیشتر سلولهای مثبت یا زنده در مقایسه با نمونه شاهد در این دو سویه میباشد (شکل3، A, D, G). درحالی که در مورد سویه اشرشیا کلای نوک قله مربوط به شدت فلوروسنس در محدوده بین 10 تا 100 قرار دارد که بیانگر کاهش بالای تعداد سلولهای زنده می باشد (شکل 3، B, E, H). از طرفی دیگر با توجه به اینکه میزان کاهش بقا در سویه R1، 2 درصد بود. بنابراین، میتوان نتیجه گرفت که 98 درصد سلولها زنده ماندهاند که این میزان برحسب شاخص D، معادل D98 خواهد بود. همچنین، میزان مقاومت در سویه MG6 و سویه اشرشیاکلی برحسب شاخص D به ترتیب: D88 و D52 تعیین شد (شکل 4). طبق نتایج بهدست آمده سویه MG6 مقاومت بسیار بالایی را در برابر تابش فرابنفش در مقایسه با سویه اشرشیاکلی نشان داد. اما در مقایسه با سویه R1 میزان مقاومت به طور جزئی کاهش یافت. همچنین، پس از بررسی اثر تنش خشکی (28 روز در 30 درجه) بر روی سویه جداسازی شده در این پژوهش، نتایج نشان داد که سویه MG6 در مقایسه با سویه R1 مقاومت کمتری نسبت به تنش خشکی نشان داد و سویه اشرشیاکلی کمترین میزان مقاومت به خشکی را داشت. به طوری که نتایج حاصل از تحلیل میزان بقا به کمک فلوسایتومتری در مورد سویه شاهد R1 نشان داد که نوک قله مربوط به شدت فلورسنس پس از تنش خشکی در محدودهی 10 تا100 قرار دارد که بیانگر کاهش تقریبا 10 برابری، تعداد سلولهای مثبت یا زنده می باشد درحالی که نوک قله مربوط به نمودار شدت فلورسنس در مورد نمونه تیمار شده باخشکی در دو سویه MG6 و اشرشیا کلای در محدودهی 10 قرار دارد (شکل3، C, F, I). که بیانگر کاهش صد برابری شدت فلورسنس سلولهای زنده در مقایسه با نمونه شاهد میباشد.همچنین، میزان بقا برحسب شاخص D در سه سویه R1، MG6 و اشرشیا کلای به ترتیب معادل D52، D6 و D1 خواهد بود (شکل 4). مطالعات اخیر نشان داده است که در سویههای مقاوم به اشعه ارتباط نزدیکی بین مقاومت به اشعه و خشکی وجود دارد بنابراین، مقاومت به خشکی نیز در سویه MG6 بررسی شد. اما برطبق نتایج بدست آمده سویه MG6 با توجه به اینکه مقاومت بسیاربالایی در برابر اشعه فرابنفش نشان داد اما مقاومت کمتری را نسبت به تنش خشکی در مقایسه با سویه R1 نشان داد. که این ممکن است به این علت باشد که بین سیستمهای درگیر در مقاومت به اشعه و خشکی در سویه R1 ارتباط نزدیکی وجود دارد. درحالیکه سویه MG6 با توجه به اینکه مقاومت بالاتری در برابر اشعه داشت، اما با وجود این به شدت نسبت به خشکی حساسیت نشان داد.
شکل 3- بررسی شدت فلوروسنس پس از 25 ژول اشعه فرابنفش و 28 روز تنش خشکی بر روی سویه MG6 در مقایسه با دو سویه شاهد مقاوم DeinococcusradioduransR1 و شاهد حساس E. coli به کمک تکنیک فلوسایتومتری شکل 4- بررسی درصد بقا پس از 25 ژول اشعه فرابنفش و 28 روز تنش خشکی بر روی سویه MG6 در مقایسه با سویههای شاهد DeinococcusradioduransR1 و E. coli به کمک تکنیک فلوسایتومتری
بررسی میزان مقاومت به هیدروژن پراکسید و میتومایسن Cپس از بررسی اثر غلظتهای مختلف هیدروژن پراکسید بر روی رشد باکتریجداسازی شده، نتایج این طور نشان داد که در جذب نوری بین باکتریهای شاهد و تیمار شده با هیدروژن پراکسید تفاوت معنیدار وجود دارد (شکل 5). به طوری که باکتریهای تیمار شده با هیدروژن پراکسید جذب نوری کمتری نسبت به شاهد نشان میدهند. همچنین، جذب نوری در غلظتهای مختلف هیدروژن پراکسید و نیز در باکتریهای مختلف متفاوت است. به طوریکه نتایج حاصل از آزمون تحلیل واریانس نشان داد، که هم غلظت هیدروژن پراکسید و هم نوع باکتری در میانگین جذب نوری موثر میباشد و برهمکنش متقابل بین غلظتهای مختلف هیدروژن پراکسید و باکتریهای مختلف نیز معنیدار است
شکل 5-میزان مقاومت به غلظتهای مختلف هیدروژن پراکسید در سویه MG6 در مقایسه با DeinococcusradioduransR1
شکل 6-بررسی مقاومت به غلظتهای مختلف میتومایسن C در سویه MG6 در مقایسه با Deinococcus radiodurans R1
بحث و نتیجهگیریبر طبق نتایج بدست آمده باکتریهایی که مقاومت بالایی در برابر اشعه فرابنفش و خشکی نشان میدهند قادر به تحمل مقادیر بالای نمک نمیباشند. از طرف دیگر باکتریهایی که مقاومت متوسطی به اشعه فرابنفش و خشکی نشان می دهند قادر به تحمل مقادیر بالای نمک میباشند که این نتایج با نتایج بدست آمده توسط شوکلا و همکاران[ix] همخوانی داشت (14). در واقع میتوان گفت بین سیستمهای درگیر در مقاومت به اشعه و خشکی و تحمل نمک ارتباطی وجود ندارد. اما با وجود این هالوباکتریوم یک آرکئای نمک دوست است که در غلظت بالای نمک نزدیک به حد اشباع رشد میکند و قادر به تحمل دوز بالای اشعه گاما (D10 پس از 5 کیلوگری) میباشد و میزان بقا پس از 20 روز خشکی، D25 میباشد (20). رودامین 123 یک رنگ فلورسنت کاتیونی است که میتواند درون باکتریهای زنده نفوذ کند (به علت بار منفی سطح درونی غشا) و درون سلول تجمع یابد. در این حالت سلولهای زنده که رنگ درون آنها تجمع یافته دارای جذب در محدوده 525 نانومتر هستند و میتوان درصد آنها را با استفاده از روش فلوسیتومتری تعیین نمود. در سال 2010 زهنگ و همکاران[x] یک سویه جدید از میکروباکتریوم رادیودورانس[xi] را جداسازی و شناسایی کردند که مقاومت در خور توجهی در برابر اشعه فرابنفش نشان میداد (24). در تحقیقی دیگر که بر روی سویه میکروباکتریوم ماریتیپیکوم[xii] انجام شد، این سویه به عنوان یک سویه مقاوم به اشعه گاما معرفی شد (25-27). در مطالعه دیگری که توسط عثمان و همکاران بر روی باکتریهای مقاوم به اشعه انجام شد، مشاهده شد که پس از 200 ژول بر متر مربع از اشعه فرابنفش بر روی باکتریهای اسفینگوموناس تریوپری[xiii] و بریوندیموناس دایمینوتا[xiv] میزان بقا 6 برابر کاهش یافت، درحالیکه باکتریهای میکروباکتریوم اسکلیفری[xv] و اگزیگوباکتریوم استیلیکوم در برابر همین میزان اشعه 3 برابر کاهش در میزان بقا نشان دادند. همچنین، نتایج نشان داد که میکروباکتریوم اسکلیفری، میکروباکتریوم آربوریکنس[xvi] و اگزیگوباکتریوم استیلیکوم پس از 1000 ژول اشعه فرابنفش هم توانایی بقا دارند. (28). شوکلا و همکاران[xvii] در تحقیقی که در سال 2007 بر روی باکتریهای مقاوم به اشعه انجام دادند، دریافتند، باکتریهایی که به 15 روز خشکی مقاومت بالایی نشان دادهاند به غلظت 5 میلیمولار هیدروژن پراکسید نیز در مقایسه با سویههای حساس مقاومت بالاتری نشان میدهند (14). در سال 2002 تسوجی و همکاران[xviii] دریافتند که پیش تیمار با غلظتهای پایین فلزات سنگین از قبیل جیوه، سرب و کادمیم به مقاومت به غلظتهای بالاتر هیدروژن پراکسید منجر میشود (29). همچنین، باتوت و همکاران[xix] در سال 2006 در تحقیقی که بر روی تغییرات فیزیولوژیکی غشا پس از تیمار با هیدروژن پراکسید انجام دادند به این نتیجه رسیدند، که یکی از عوامل موثر در مقاومت باکتریهای مختلف به استرس اکسیداتیو اختلاف در ویژگیهای غشا در باکتریهای مختلف میباشد (18). نتایج این تحقیق نشان می دهد که باکتری
پیوستها انحراف معیار میانگینها در نمودارهای مربوط به رشد سویهها در شرایط سخت مورد آزمایش
[1]. MitomycinC [2]. Reactive oxygen species (ROS) [3]. Double-strand DNA breaks (DSBs) [4]. Polymerase chain reaction [5]. Universal [6]. Forward [7]. Reverse [8]. Bootstrap [ix]. Shukla et al. [x]. Zhang et al. [xi]. Microbacterium radiodurans [xii]. Microbacterium maritypicum [xiii]. Sphingomonas trueperi [xiv]. Brevundimonas diminuta [xv]. Microbacterium schleiferi [xvi]. Microbacterium arborescens [xvii]. Shukla et al. [xviii]. Tsuji et al. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
مراجع | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
References (1) Venkateswaran A, McFarlan SC, Ghosal D, Minton KW, Vasilenko A, Makarova K, et al. Physiologic determinants of radiation resistance in Deinococcus radiodurans. Appl Environ Microbiol. 2000; 66 (6) :2620-6. (2) Asgarani E, Soudi MR, Borzooee F, Dabbagh R. Radio-resistance in psychrotrophic Kocuria sp. ASB 107 isolated from Ab-e-Siah radioactive spring. J Environ Radioact. 2012; 113: 171-6. (3) Slade D, Radman M. Oxidative stress resistance in Deinococcus radiodurans. Microbiol Mol Biol Rev. 2011; 75 (1) :133-91. (4) Agostini HJ, Carroll JD, Minton KW. Identification and characterization of uvrA, a DNA repair gene of Deinococcus radiodurans. J Bacteriol. 1996; 178 (23) : 6759-65. (5) Kilburn RE, Bellamy WD, Terni SA. Studies on a radiation-resistant pigmented Sarcina sp. Radiat Res. 1958;9 (2): 207-15. (6) Arrage AA, Phelps TJ, Benoit RE, White DC. Survival of subsurface microorganisms exposed to UV radiation and hydrogen peroxide. Appl Environ Microbiol. 1993; 59 (11): 3545-50. (7) Krisko A, Radman M. Protein damage and death by radiation in Escherichia coli and Deinococcus radiodurans. Proc Natl Acad Sci. 2010; 107 (32): 14373-7 (8) Daly MJ, Gaidamakova EK, Matrosova VY, Vasilenko A, Zhai M, Leapman RD, et al. Protein oxidation implicated as the primary determinant of bacterial radioresistance. PLoS Biol. 2007; 5(4) :e92. (9) Slade D, Radman M. Oxidative stress resistance in Deinococcus radiodurans. Microbiol Mol Biol Rev. 2011; 75(1): 133-91. (10) Di Capua C, Bortolotti A, Farías ME, Cortez N. UV‐resistant Acinetobacter sp. isolates from Andean wetlands display high catalase activity. FEMS Microbiol Lett. 2011; 317(2): 181-9. (11) Mann JE. Recent advances in the development of Deinococcus spp. for use in bioremediation of mixed radioactive waste. 2009; MMG 449 Basic Biotech. 5 (1): 60-65.
(12) Brooks BW, and R. G. E. Murray. Nomenclature for “Micrococcus radiodurans” and other radiation-resistant cocci: Deinococcaceae fam. nov. and Deinococcus gen. nov., including five species. Int J Syst Bacteriol. 1981; 31:353–360. (13) Chen M-Y, Wu S-H, Lin G-H, Lu C-P, Lin Y-T, Chang W-C, et al. Rubrobacter taiwanensis sp. nov., a novel thermophilic, radiation-resistant species isolated from hot springs. Int J Syst Evol Microbiol. 2004;54 (5): 1849-55. (14) Shukla M, Chaturvedi R, Tamhane D, Vyas P, Archana G, Apte S, et al. Multiple-stress tolerance of ionizing radiation-resistant bacterial isolates obtained from various habitats: correlation between stresses. Curr Microbiol. 2007; 54(2): 142-8. (15) Dutta S, Narang A, Chakraborty A, Ray P. Diagnosis of neonatal sepsis using universal primer polymerase chain reaction before and after starting antibiotic drug therapy. Arch Ped & Adol Med. 2009; 163 (1): 6. (16) Gholami M, Emtiazi G. Designing a new molecular marker for detection of heavy metal resistance genes in bacteria. Gene 3rd millennium. 2012;10 (2) :5. (17) Saitou N, Nei M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mor Biol Evol. 1987; 4 (4): 406-25. (18) Baatout S, De Boever P, Mergeay M. Physiological changes induced in four bacterial strains following oxidative stress. Appl Biochem Microbiol. 2006; 42(4): 369-77. (19) Sarafnejad A, Siavoshi F, Safaralizadeh R, Masarat S, Khosravi F, Malekzadeh R, et al. Assessment of Helicobacter pylori Viability by Flow Cytometry. Iran J Public Health. 2007; 36(1): 50-54. (20) Kottemann M, Kish A, Iloanusi C, Bjork S, DiRuggiero J. Physiological responses of the halophilic archaeon Halobacterium sp. strain NRC1 to desiccation and gamma irradiation. Extremophiles. 2005; 9(3): 219-27. (21) Holowachuk SA, Bal'a MF, Buddington RK. A kinetic microplate method for quantifying the antibacterial properties of biological fluids. J Microbiol Meth. 2003;55 (2): 441-6. (22) Kim D, Song H, Lim S, Yun H, Chung J. Effects of gamma irradiation on the radiation-resistant bacteria and polyphenol oxidase activity in fresh kale juice. Radiat Phys Chem. 2007; 76 (7): 1213-7. (23) Holt JG, Krieg NR, Sneath PHA, Staley JT, Williams ST. Bergey’s manual of determinative bacteriology. Williams and Wilkins, Baltimore. 1994: 39-63. (24) Zhang W, Zhu H, Yuan M, Yao Q, Tang R, Lin M, et al. Microbacterium radiodurans sp. nov., a UV radiation-resistant bacterium isolated from soil. Int J Syst Evol Microbiol. 2010; 60 (11): 2665-70. (25) Williams PD, Eichstadt SL, Kokjohn TA, Martin EL. Effects of ultraviolet radiation on the Gram-positive marine bacterium Microbacterium maritypicum. Curr Microbiol. 2007; 55(1): 1-7. (26) Singh O, Gabani P. Extremophiles: radiation resistance microbial reserves and therapeutic implications. J Appl Microbiol. 2011; 110 (4): 851-61. (27) Kotelnikova SV, MacDonald R, Martine E, editors. Unusual resistance of marine Vibrio from Grenada to solar UV radiation. Caribbean Academy of Sciences 2008 Conference proceedings book; 2008. (28) Osman S, Peeters Z, La Duc MT, Mancinelli R, Ehrenfreund P, Venkateswaran K. Effect of shadowing on survival of bacteria under conditions simulating the martian atmosphere and UV radiation. Appl Environ Microbiol. 2008; 74 (4) :959-70. (29) Tsuji N, Hirayanagi N, Okada M, Miyasaka H, Hirata K, Zenk MH, et al. Enhancement of tolerance to heavy metals and oxidative stress in Dunaliella tertiolecta by Zn-induced phytochelatin synthesis. Biochem Biophys Res Commun. 2002; 293 (1): 653-9. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
آمار تعداد مشاهده مقاله: 2,847 تعداد دریافت فایل اصل مقاله: 727 |