تغییر در ترکیبات فنلی و فعالیت آنزیم‌های فنیل آلانین آمونیالیاز و تیروزین آمونیالیاز توسط پیش‌تیمار اتانول آمین در گیاه Nicotiana rustica تحت شرایط تنش شوری کشت در شیشه

تنش شوری به عنوان عامل اصلی محدود کننده نمو و محصول‌دهی گیاه به ویژه گیاهان زراعی قلمداد می‌شود و باعث کاهش قابلیت دسترسی به آب، تجمع یون سدیم و عدم توازن یونی شده، به مهار رشد گیاه و در نهایت به آسیب سلولی و مولکولی گیاه منجر می‌شود (Silva-Ortega et al., 2008). مقاومت به شوری در گیاه صفتی پیچیده است و سازوکارهای بسیاری را در بر می‌گیرد که درک آنها برای ایجاد راهکارهای مناسب جهت مهندسی ژنتیک گیاهان زراعی مفید خواهد بود. ثابت شده است که تنش‌های محیطی به کاهش یا افزایش مقدار ترکیبات فنلی که گروه بزرگی از متابولیت‌های ثانویه هستند، منجر می‌شود (Król et al., 2014). این ترکیبات می‌توانند گونه‌های اکسیژن فعال (ROS) را خنثی نموده، با فلزاتی که واکنش‌های اکسیژناسیون را کاتالیز می‌کنند ترکیباتی را تشکیل دهند و از فعالیت آنزیم‌های اکسیدکننده جلوگیری نمایند. فنل‌ها گروه بزرگی از ترکیبات را تشکیل می‌دهند که می‌توان آنها را به پنج زیرگروه شامل: کومارین‌ها، لیگنین‌ها، فلاونوئیدها، فنولیک اسیدها و تانن‌ها تقسیم‌بندی نمود (Gumul et al., 2007). فلاونوئیدها فراوان‌ترین ترکیب از پلی‌فنل‌ها در رژیم غذایی انسان است که ساختار پایه‌ای آنها از هسته فلاون با 15 اتم کربن که در سه حلقه نظم یافته‌اند، تشکیل شده است (Dai and Mumper, 2010). آنتوسیانین‌ها در فعالیت آنتی‌اکسیدانی فلاونوئیدها شرکت می‌کنند و به گستردگی در میوه‌ها و سبزیجات یافت می‌شوند (Lapidot et al., 1999). در مسیر بیوسنتز ترکیبات فنلی، دو آنزیم: فنیل آلانین آمونیالیاز (PAL) و تیروزین آمونیالیاز (TAL) جزو مهم‌ترین آنزیم‌ها شناخته می‌شوند (Beaudoin-Eagan and Thorpe, 1985). Hoagland و Duke (1981) گزارش دادند که این آنزیم‌ها از طریق دآمیناسیون فنیل آلانین و تیروزین به ترتیب برای تولید t-سینامیک اسید و P-کوماریک اسید و با آزاد کردن آمونیوم عمل می‌کنند و از این طریق پیش‌ساز ترکیبات فنلی تولید خواهد شد. فعالیت TAL در بین گیاهان دو لپه به خوبی شناخته نشده است با وجود این، Beaudoin-Eagan و Thorpe در سال 1985 فعالیت این آنزیم را طی القای نوساقه از کالوس تنباکو به وضوح نشان دادند. همچنین آنها تفاوت فعالیت آنزیم TAL و PAL را در گیاه تنباکو (Nicotiana tabacum) اثبات نمودند.

در گیاهان چندین آمین بیوژنیک مهم وجود دارد که از نظر ریخت‌زایی و تنش-فیزیولوژی دارای اهمیت هستند. اتانول آمین یکی از این ترکیبات است که در جنین‌زایی، رشد و نمو اندام‌ها و تشکیل غشاهای درون سلولی نقش مهمی ایفا می‌نماید (Mascher et al., 2005a). به خوبی مشخص شده است هنگامی که گیاه در معرض تنش (مانند خشکی، شوری، فلزات سنگین، پاراکوات و نظایر آن) قرار می‌گیرد غشاهای زیستی سلول آسیب می‌بیند و در نتیجه فسفولیپیدهای غشا شکسته شده و اتانول آمین از آنها آزاد می‌شود. افزایش سطح آمین‌ها به علت قرار گرفتن در معرض تنش واکنش هشدار دهنده‌ای را القا می‌نماید تا سازوکارهای مقابله با تنش فعال شوند. پیشنهاد شده است که اتانول آمین با منشأ خارجی می‌تواند نقش سیگنالی برای راه‌اندازی مقاومت به تنش و نیز پایدارکننده غشا داشته باشد (Mascher et al., 2005a). در آلمان غربی مطالعات متعددی در مزرعه با شرایط اقلیمی و در خاک‌های مختلف روی اثر اتانول آمین بر میزان و کیفیت محصول جو، گندم، جو دوسر و سیب‌زمینی انجام گرفته است. نتایج این مطالعات نشان داد که در شرایط تنش محیطی میزان محصول تا 20 درصد افزایش می‌یابد (Mascher et al., 2005a). همچنین، Rajaeian و همکاران (2011) گزارش دادند که در گیاه ذرت تحت تنش پاراکوآت افزایش فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان نظیر گایاکول پراکسیداز و کاتالاز در پاسخ به پیش‌تیمار اتانول آمین به سمّیت‌زدایی بهتر ROS منجر می‌گردد. در مطالعه‌ای دیگر، Rajaeian و Ehsanpour (2015) نشان دادند که در گیاه تنباکو پیش‌تیمار شده با اتانول آمین که در معرض تنش شوری قرار داشت، فعالیت آنزیم‌های آسکوربات پراکسیداز، سوپر اکسید دیسموتاز و کاتالاز و نیز مقدار کاروتنوئید همگی به افزایش ظرفیت آنتی‌اکسیدانی این گیاه منجر شد. همان طور که گفته شد اگر چه اثر مثبت اتانول آمین بر افزایش مقاومت در برابر برخی تنش‌ها پیش از این گزارش شده است، با وجود این، دامنه اطلاعات در این زمینه بسیار محدود است و هدف از پژوهش حاضر نیز مطالعه اثر پیش‌تیمار اتانول آمین بر برخی از ترکیبات فنلی و فعالیت آنزیم‌های TAL و PAL به عنوان مهم‌ترین آنزیم‌های درگیر در مسیر بیوسنتز این ترکیبات در شرایط کشت در شیشه است. داده‌های پژوهش حاضر می‌تواند در درک بهتر نحوه عملکرد اتانول آمین در گیاه برای مقابله با تنش شوری از طریق تغییرات مسیر ترکیبات فنلی دارای اهمیت باشد.

مواد و روش‌ها.

بذر گیاه تنباکو (Nicotiana rustica) از شرکت پاکان بذر اصفهان تهیه شد. ابتدا بذرها به مدت 20 دقیقه با هیپوکلریت سدیم 15 درصد حجمی، سپس به مدت 3 دقیقه با محلول اتانول 70 درصد ضدعفونی و در پایان، با آب مقطر استریل سه مرتبه شستشو داده شدند. در مرحله بعد، بذرهای استریل روی محیط‌کشت MS (Murashige and Skoog, 1962) کشت شدند. پس از چهار هفته به محیط‌کشت حاوی گیاهچه‌های رشد یافته محلول اتانول آمین افزوده شد به نحوی که غلظت‌های صفر، 70، 130، 270 و 530 میکرومولار اتانول آمین حاصل شد. این گیاهچه‌ها پس از دو روز به محیط‌کشت بهینه شده با غلظت نمک (NaCl) یعنی 200 میلی‌مولار منتقل شدند. کلیه کشت‌ها در اتاق کشت با دمای 25 درجه سانتیگراد با اختلاف 1 تا 2 درجه، فتوپریود نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی و شدت نور حدود 30 میکرومول فوتون بر متر مربع بر ثانیه رشد داده شدند. پس از 3 هفته میزان مالون‌دی‌آلدهید (MDA)، فنل کل، فلاونوئید، آنتوسیانین‌ها و فعالیت آنزیم‌های PAL و TAL اندازه‌گیری شد.

اندازه‌گیری مالون‌دی‌آلدهید (MDA): میزان پراکسیداسیون لیپیدهای سلول با اندازه‌گیری MDA تعیین شد. تقریباً 1 گرم برگ تازه گیاه در محلول 10 درصد حجمی TCA (تری کلرو استیک اسید) همگن و به مدت 20 دقیقه با نیروی g 15000 سانتریفیوژ شد. به 1 میلی‌لیتر از محلول رویی 1 میلی‌لیتر از محلول تیوباربیتوریک اسید (TBA) 5/0 درصد در TCA 20 درصد افزوده شد. محلول حاصل به مدت 30 دقیقه در دمای 96 درجه سانتیگراد قرار گرفت، سپس به سرعت روی یخ سرد گردید. جذب این محلول پس از سانتریفیوژ به مدت 5 دقیقه در g 10000 در طول موج 532 و 600 نانومتر خوانده شد. غلظت MDA بر اساس روش Health و Packer (1968) با ضریب خاموشی 155 میلی‌مولار بر سانتی‌متر محاسبه گردید.

اندازه‌گیری فلاونوئید کل: میزان فلاونوئید با روش رنگ‌سنجی با استفاده از کلرید آلومینیوم صورت گرفت (Chang et al., 2002). 5/0 میلی‌لیتر از عصاره گیاهی (1 گرم بافت برگ در 10 میلی‌لیتر متانول) با 5/1 میلی‌لیتر متانول، 1/0 میلی‌لیتر کلرید آلومینیوم، 1/0 میلی‌لیتر از محلول 1 مولار استات پتاسیم و 8/2 میلی‌لیتر آب مقطر مخلوط و به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق نگهداری شد. پس از آن، جذب آن در 415 نانومتر خوانده شد.

اندازه‌گیری آنتوسیانین‌ها: ابتدا از برگ‌های تنباکو عصاره متانولی تهیه شد (نسبت 99 به 1 متانول و کلریدریک اسید در 4 درجه سانتیگراد). سپس، جذب نمونه‌ها در 530 و 657 نانومتر خوانده و میزان آنتوسیانین‌ها از رابطه 1 محاسبه شد (Laby et al., 2000).

رابطه 1:

اندازه‌گیری فعالیت آنزیم TAL: حدود 1 گرم بافت تازه برگ تنباکو در دمای 4 درجه سانتیگراد با 3 میلی‌لیتر بافر تریس (05/0 مولار تریس-کلریدریک اسید با اسیدیته 4/8) حاوی 15 میلی‌مولار 2- مرکاپتو اتانول به صورت همگن درآمد. میزان پروتئین عصاره با استفاده از کوماسی بلو با روش Bradford (1976) اندازه‌گیری شد. فعالیت آنزیم TAL با تشکیل
p-coumarate توسط اسپکتروفتومتر (مدل UV-160A، شرکت Shimadzu، ژاپن) در طول موج 333 نانومتر اندازه‌گیری شد. مخلوط واکنش شامل: 5/5 میکرومولار L- تیروزین، 500 میکرو مولار بافر تریس با اسیدیته برابر 1/8 و 100 میکرولیتر عصاره آنزیمی برگ در حجم نهایی 1 میلی‌لیتر بود. پس از 70 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد واکنش تبدیل تیروزین به کوماریک اسید با اضافه نمودن 05/0 میلی‌لیتر 5 کلریدریک اسید نرمال متوقف شد (Beaudoin-Eagan and Thorpe, 1985).

اندازه‌گیری فعالیت آنزیم PAL: 100 میلی‌گرم بافت تازه برگ با 2 میلی‌لیتر بافر استخراج (50 میلی‌مولار تریس-کلریدریک اسید با اسیدیته 5/8) حاوی 15 میلی‌مولار بتا-مرکاپتو اتانول همگن شد. سپس به مدت 5 دقیقه با نیروی g 4000 در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شد. در نهایت، برای اندازه‌گیری فعالیت آنزیم PAL از محلول رویی به عنوان عصاره آنزیمی استفاده شد. برای تخمین فعالیت آنزیم 1 میلی‌لیتر محلول واکنش شامل بافر واکنش (500 میکرومولار تریس-کلریدریک اسید با اسیدیته 8) حاوی 6 میکرومول فنیل آلانین و 100 میکرولیتر عصاره آنزیمی در حجم نهایی 1 میلی‌لیتر تهیه شد. سپس، به مدت 60 دقیقه در دمای 40 درجه سانتیگراد قرار گرفت. در نهایت، به این محلول مقدار 50 میکرولیتر کلریدریک اسید با غلظت 5 نرمال اضافه شد تا واکنش تولید سینامیک اسید از فنیل آلانین متوقف شود. در پایان، فعالیت آنزیم در طول موج 290 نانومتر بر اساس میزان تولید سینامیک اسید بر حسب نانومول بر دقیقه بر میلی‌گرم پروتئین گزارش گردید(Beaudoin-Eagan and Thorpe, 1985).

اندازه‌گیری فنل کل: برای اندازه‌گیری فنل کل، 500 میلی‌گرم پودر خشک ساییده شده برگ در یک لوله آزمایش ریخته و 10 میلی‌لیتر متانول 80 درصد به آن افزوده شد، سپس سوسپانیسیون حاصل به آرامی مخلوط شد. لوله‌های آزمایش به مدت 5 دقیقه سونیکیت و به مدت 10 دقیقه با نیروی g 1500 سانتریفیوژ شد. عصاره‌گیری از مواد گیاهی دو بار انجام شد. میزان فنل کل عصاره با استفاده از فولین-سیوکالتیو اندازه‌گیری شد (Singleton et al., 1999). 5/0 میلی‌لیتر از عصاره در لوله آزمایش ریخته و 5/2 میلی‌لیتر معرف فولین سیو-کالتیو و 2 میلی‌لیتر کربنات سدیم 5/7 درصد به آن افزوده شد. محتویات لوله آزمایش مخلوط و به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق نگهداری شد، سپس جذب عصاره در طول موج 765 نانومتر خوانده شد. محتوای فنل کل به صورت هم ارزهای تانیک اسید بر حسب میلی‌گرم بر گرم وزن خشک نشان داده شد.

تحلیل آماری: کلیه آزمایش‌ها با حداقل 3 تکرار انجام و داده‌ها با آزمون Two-way ANOVA تحلیل و میانگین‌ها بر اساس آزمون دانکن در سطح P<0.05 مقایسه شد.

نتایج.

.اثر اتانول آمین بر میزان مالون‌دی‌آلدهید (MDA): در پژوهش حاضر، تنش شوری (200 میلی‌مولار نمک) موجب افزایش میزان MDA بدون پیش‌تیمار با اتانول آمین در گیاه تنباکو داد (شکل 1). در مقابل، کاهش میزان MDA بر اثر پیش‌تیمار با اتانول آمین در گیاه تحت تنش شوری مشاهده گردید. نتایج همچنین نشانگر افزایش میزان MDA در گیاه شاهد (بدون تنش شوری) در اثر پیش‌تیمار با اتانول آمین بود.

اثر اتانول آمین بر میزان فلاونوئید: نتایج نشان داد که پیش‌تیمار با اتانول آمین، مقدار فلاونوئید کل را در گیاهان تیمار شده با نمک کاهش می‌دهد، در حالی که در گیاه بدون تیمار نمک، اتانول آمین مقدار فلاونوئید کل را در تمام غلظت‌های اتانول آمین به غیراز 130 میکرومولار افزایش داد. نتایج همچنین نشان داد که در گیاه بدون پیش‌تیمار اتانول آمین، تنش شوری به افزایش مقدار فلاونوئید منجر می‌شود (شکل 2).

اثر اتانول آمین بر میزان آنتوسیانین‌ها: تغییرات مقدار آنتوسیانین‌ها در برگ‌های تنباکو که تحت تنش شوری و پیش‌تیمار با اتانول آمین قرار داشتند در شکل 3 نشان داده شده است. نتایج نشان می‌دهد که مقدار آنتوسیانین‌ها در گیاهان تحت تنش شوری که با اتانول آمین پیش‌تیمار شده‌اند به طور معنی‌داری بیشتر از گیاهان تحت تنش شوری است که با اتانول آمین پیش‌تیمار نشده‌اند، این افزایش به ویژه در غلظت 270 میکرومولار اتانول آمین به طور چشمگیری قابل مشاهده بود. همچنین، مشاهده گردید که مقدار آنتوسیانین‌ها در گیاهان بدون پیش‌تیمار با اتانول آمین با قرار گرفتن در معرض تنش شوری افزایش یافت. نتایج همچنین نشان می‌دهد که مقدار آنتوسیانین‌ها گیاهان شاهد (گیاهان بدون تنش شوری) که با اتانول آمین (در همه غلظت‌های به کار برده شده 70، 130، 270 و 530 میکرومولار) پیش‌تیمار شده‌اند، در مقایسه با گیاهان شاهد بدون پیش‌تیمار با اتانول آمین افزایش داشته است.

اثر اتانول آمین بر فعالیت آنزیم PAL: نتایج حاصل از اندازه‌گیری فعالیت آنزیم PAL (شکل 5) نشان داد که در گیاه تنباکو بدون تیمار نمک، پیش‌تیمار با اتانول آمین تغییر معنی‌داری از نظر فعالیت این آنزیم ایجاد نکرد. در حالی که اعمال پیش‌تیمار اتانول آمین در حضور تنش نمک ( 200 میلی‌مولار) در غلظت‌های 270 و 530 میکرو مولار اتانول آمین نسبت به گیاه بدون پیش‌تیمار کاهش معنی‌دار فعالیت آنزیم PAL را به همراه داشت. همچنین، نتایج نشانگر افزایش فعالیت این آنزیم در گیاه تحت تنش شوری در مقایسه با گیاه شاهد است.

اثر اتانول آمین بر فعالیت آنزیم TAL: سنجش فعالیت TAL نشان داد که پیش‌تیمار با اتانول آمین (در همه غلظت‌های به کار برده شده) به افزایش فعالیت این آنزیم در گیاهان تحت تنش شوری منجر می‌شود. همان طور که شکل 6 نشان می‌دهد در گیاهان تحت تنش شوری که با اتانول آمین پیش‌تیمار شده‌اند میزان فعالیت آنزیم TAL در مقایسه با گیاهان تحت تنش شوری که با اتانول آمین پیش‌تیمار نشده‌اند به طور معنی‌داری بیشتر است. نتایج همچنین نشان داد که در گیاهان شاهد (گیاهان بدون تیمار نمک) اتانول آمین در همه غلظت‌های به کار برده شده به غیراز غلظت 270 میکرومولار، تأثیری بر میزان فعالیت آنزیم TAL نداشته است. شکل 6 همچنین نشان می‌دهد که در گیاهان بدون پیش‌تیمار با اتانول آمین میزان فعالیت آنزیم TAL تحت تأثیر تنش شوری، افزایش نشان داد.

بحث.

نتایج پژوهش حاضر در زمینه گروهی از آنتی‌اکسیدان‌های غیرآنزیمی به نام ترکیبات فنلی و آنزیم‌های دخیل در بیوسنتز آنها به روشنی نشان می‌دهد که پیش‌تیمار اتانول آمین در گیاه Nicotiana rustica، پاسخ این گیاه در مقابل تنش شوری را تحت تأثیر قرار می دهد. در پژوهش حاضر، ابتدا میزان MDA که شاخصی از آسیب اکسیداتیو ناشی از اعمال تنش است (Kunert and Ederer, 1985) ارزیابی شد و مطابق انتظار، نتایج نشان داد که تنش شوری میزان MDA را در گیاه افزایش می‌دهد. مشابه با نتایج حاضر، Hong و همکاران (2000) نیز افزایش میزان MDA در گیاه تحت تنش شوری را نشان دادند. پژوهش حاضر همچنین نشان داد که در گیاه شاهد (گیاهی که تحت تنش شوری قرار ندارد) میزان MDA توسط پیش‌تیمار با اتانول آمین افزایش می‌یابد. مطالعه قبلی ما نیز نتایج مشابهی را در گیاه ذرت نشان داد (Rajaeian et al., 2011). همچنین مشاهده شد که میزان H₂O₂ در گیاه شاهد با پیش‌تیمار با اتانول آمین افزایش می‌یابد (Rajaeian and Ehsanpour, 2015). این مشاهدات نشان دهنده این است که اتانول آمین به عنوان نوعی عامل تنش‌زای خفیف در گیاه عمل می‌نماید. گزارش‌های دیگری نیز ویژگی القای تنش توسط اتانول آمین در گیاه شاهد را مورد توجه قرار داده‌اند (Mascher, 2005 a,b). از آنجا که تجمع اتانول آمین تحت شرایط عادی در گیاه رخ نمی‌دهد هنگامی که این ترکیب به صورت خارجی (exogene) استفاده می‌شود، می‌تواند به تجمع غیرمعمول آن در فضای خارج سلولی منجر شود، بنابراین این مقدار اضافی اتانول آمین می‌تواند سیگنال هشداردهنده‌ای برای سلول‌های گیاه باشد (Mascher, 2005b). از سوی دیگر، نتایج ما نشان داد که پیش‌تیمار گیاه با اتانول آمین در راستای نقش حفاظتی خود با کاهش میزان پراکسیداسیون لیپیدهای غشا، میزان این ترکیب (MDA) را در گیاه تحت تنش شوری کاهش می‌دهد. این نتیجه در راستای نتایج مطالعات پیشین در این زمینه بوده Mascher, 2005 a,b)؛ (Rajaeian et al., 2011 و تأییدی بر تأثیر مثبت اتانول آمین به عنوان یک پیش‌تیمار القا کننده مقاومت به تنش شوری در گیاه است. شاید بتوان چنین فرض نمود که پیش‌تیمار گیاه به مدت دو روز می‌تواند مشابه تزریق واکسن در افزایش توان سیستم ایمنی جانوری عمل نماید. به بیان دیگر، استفاده از اتانول آمین می‌تواند از طریق القای سازوکارهای مقاومتی از جمله پاسخ آنتی‌اکسیدانی گیاه را برای سازگاری با شرایط سخت تنشی بعدی آماده نماید Mascher, 2005 a,b)؛ Rajaeian et al., 2011؛ (Rajaeian and Ehsanpour, 2015. در حقیقت، مطابق با نتایج پیشین و داده‌های حاضر آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان از جمله: آسکوربات پراکسیداز، سوپر اکسید دیسموتاز و کاتالاز (Rajaeian and Ehsanpour, 2015) و ترکیبات غیرآنزیمی از جمله آنتوسیانین‌ها توان محافظت از غشا در مقابل آسیب اکسیداتیو ROS را دارند و می‌تواند به کاهش مقدار MDA منجر گردد. با وجود این، سازوکار دقیقی که اتانول آمین از طریق آن، مقاومت به تنش را القا می‌نماید هنوز به خوبی درک نشده است.

چنانچه به روشنی اثبات شده است تنش شوری می‌تواند به تولید ROS اضافی منجر گردد. برخی از گیاهان به منظور سازگاری با این شرایط مضر محیطی سنتز متابولیت‌های ثانویه گوناگون از جمله ترکیبات فنلی را القا می‌نمایند. در این راستا، به منظور آزمودن اثر پیش‌تیمار اتانول آمین روی گونه Nicotiana rustica، پاسخ‌های گیاهی، فنل کل، فلاونوئید و آنتوسیانین‌ها پس از پیش‌تیمار با اتانول آمین تحت تنش شوری، بررسی و ارزیابی شد. نتایج نشان داد که تنش شوری موجب افزایش مقدار فنل کل در گیاهان بدون پیش‌تیمار با اتانول آمین می‌گردد. این نتیجه قابل پیش‌بینی است و با نتایج گزارش شده توسط Neves و همکاران (2010) و Frary و همکاران (2010) هماهنگی دارد. گزارش شده است که تنش‌های محیطی مختلف تجمع فلاونوئیدها از جمله آنتوسیانین‌ها و همچنین ترکیبات فنولیک را تحریک می نماید (Mo et al., 1992). همچنین، نتایج موجود نشان می‌دهد که تیمارهای تنشی به طور قابل ملاحظه‌ای ترکیبات فنلی را در شاخه‌های گیاهان
Vigna sinesis و Zea mays افزایش می‌دهد (Nemat Alla et al., 2002). همچنین، پژوهش حاضر کاهش مقدار فنل کل در گیاهان تحت تنش شوری که با اتانول آمین پیش‌تیمار شده‌اند را نشان داد. کاهش مقدار فنل می‌تواند به علت کاهش فعالیت آنزیم‌های مسیر تولید آن باشد. از این رو، میزان فعالیت دو آنزیم PAL و TAL که در مسیر بیوسنتز ترکیبات فنلی آنزیم‌های اصلی هستند، مورد سنجش قرار گرفت. Mehta و همکاران (1993) گزارش نمودند که محتوای ترکیبات فنلی به طور کلی در گیاه نخود با افزایش نمک‌های کلرید و سولفات افزایش می‌یابد. تجمع ترکیبات فنولیک و آنتوسیانین‌ها در گیاهان تحت تنش، با تحریک فعالیت آنزیم‌های PAL و TAL همراه است. این نتایج، تأثیرات تنظیم‌کنندگی این آنزیم‌ها تشکیل آنتوسیانین‌ها و فنل‌ها از طریق تولید فنیل پروپانویید که فلاونوئیدها از آن سنتز می‌شوند را تأیید می‌نماید. بنابراین، هر تغییری در فعالیت آنزیم‌های PAL و TAL در تغییر شکل متابولیسم این فرآورده‌های ثانویه دخالت خواهد داشت.

میزان فعالیت آنزیم PAL با مقدار فنل کل به دست آمده نوعی هماهنگی را نشان داد. به این معنی که در گیاهان بدون پیش‌تیمار با اتانول آمین میزان فعالیت PAL تحت تأثیر تنش شوری افزایش یافته بود که در هماهنگی با افزایش فنل کل در این گروه از گیاهان بود. از سوی دیگر، در گیاهان تحت تنش شوری که با اتانول آمین پیش‌تیمار شده بودند همگام با کاهش مقدار فنل فعالیت آنزیم PAL نیز کاهش یافت که می‌تواند توجیهی برای کاهش مقدار فنل کل تحت این شرایط باشد. نتایج بررسی در مورد میزان فعالیت آنزیم TAL در مسیر سنتز ترکیبات فنلی نشان داد که در گیاهان بدون پیش‌تیمار با اتانول آمین، تنش شوری موجب افزایش فعالیت آنزیم TAL می‌گردد. این نتیجه، در راستای افزایش مقدار فنل کل در این شرایط بوده و در این رابطه گزارش‌های متعددی نیز موجود است، برای نمونه، Nemat Alla و همکاران (2002) افزایش فعالیت آنزیم TAL در Vigna sinesis و Zea mays توسط تنش شوری را گزارش دادند. همچنین، افزایش فعالیت TAL در گیاهان تحت تنش شوری پیش‌تیمار شده با اتانول آمین مشاهده گردید. در این جا، بین کاهش مقدار فنل کل و افزایش فعالیت TAL نوعی تناقض مشاهده می‌شود. Dogbo و همکاران (2012) ثابت کردند که در Cassava، TAL در مقایسه با PAL نسبت به الیسیتور سالسیلیک اسید حساس‌تر است. در مطالعه حاضر نیز شاید بتوان چنین فرض کرد که اتانول آمین همانند سالسیلیک اسید به تحریک TAL در شرایط تنشی منجر شده اما بر PAL اثر افزایشی نداشته است. مسلم است که این فرضیه به آزمایش‌های دقیق نیاز دارد تا نحوه عملکرد دقیق اتانول آمین روی این دو آنزیم روشن شود. شاید بتوان چنین تناقضی را به نقش آنزیم TAL در مسیر سنتز ترکیبات فنلی نسبت داد. به بیان دیگر، از آنجا که این آنزیم در مقایسه با PAL، یک آنزیم کمکی است، فعالیت آن تأثیر زیادی بر مقدار فنل کل ندارد و افزایش فعالیت آن لزوماً با افزایش مقدار فنل‌ها همراه نیست. در مطالعه حاضر، از میان ترکیبات فنلی، فلاونوئیدها و در بین فلاونوئیدها آنتوسیانین‌ها بررسی شدند تا به این پرسش، پاسخ داده شود که آیا علت کاهش فنل‌ها، کاهش مقدار این دو گروه آنتی‌اکسیدان قوی است یا خیر؟. نتایج نشان داد که تنش شوری به افزایش مقدار فلاونوئیدها در گیاهان بدون پیش‌تیمار با اتانول آمین منجر می‌گردد. داده‌های حاضر در مورد اثر تنش شوری بر افزایش مقدار فلاونوئید با نتایج Frary و همکاران (2010) که نشان دادند مقدار فلاونوئیدها در Solanum pennelli پس از تنش شوری افزایش می‌یابد و نتایج Mahmoudi و همکاران (2010) که نیز نشان دادند فلاونوئیدهای romaine lettuce پس از تیمار NaCL افزایش می‌یابد هماهنگی دارد. نتایج حاضر همچنین نشان داد که تنش شوری به افزایش مقدار آنتوسیانین‌ها در گیاهان بدون پیش‌تیمار با اتانول آمین منجر می‌گردد. مقدار آنتوسیانین‌ها در توت‌فرنگی تحت شرایط تنش شوری نیز توسط Keutgen و Pawelzik (2008) بررسی شده است و اثبات شد که غلظت آنتوسیانین‌ها در این گیاهان پس از تیمار NaCl افزایش می‌یابد که در هماهنگی با نتایج حاضر در گیاه تنباکو است. Kaliamoorthy و Rao در سال 1994 افزایش 40 درصدی تجمع آنتوسیانین‌ها در ذرت پس از تیمار با NaCl و KCl را گزارش دادند. نتایج حاضر نشان داد که پیش‌تیمار با اتانول آمین به افزایش مقدار آنتوسیانین‌ها و فلاونوئید در گیاه شاهد (گیاه بدون تنش شوری) منجر می‌گردد. در این رابطه، Ali و Ashraf (2011) گزارش دادند که استعمال خارجی گلایسین بتایین موجب افزایش فلاونوئیدها در گیاه ذرت در شرایط عادی و تحت تنش خشکی می‌گردد. از آنجا که اتانول آمین پیش‌ساز بیوسنتز گلایسین بتایین است (Kogan et al., 2000)، شاید بتوان چنین نتیجه گرفت که پیش‌تیمار گیاه تنباکو با اتانول آمین به افزایش مقدار گلایسین بتایین منجر شده و این ترکیب نیز به نوبه خود مقدار فلاونوئیدها را افزایش داده است. نتایج همچنین نشان داد که پیش‌تیمار گیاه تنباکو با اتانول آمین تحت تنش شوری باعث کاهش مقدار فلاونوئید و در عین حال افزایش آنتوسیانین‌ها می‌گردد. با توجه به این شواهد گمان می‌رود در این گیاهان گلایسین بتایین حاصل از متابولیسم اتانول آمین در مسیر سنتز فلاونوئیدها به طور عمده در جهت تولید آنتوسیانین‌ها وارد شده باشد. همچنین، از آنجا که نقش گلایسین بتایین به عنوان اسمولیت سازگار، حفاظت از ساختار چهارم آنزیم‌ها و حفظ تمامیت غشا در غلظت بالای نمک است (Chen and Murata, 2002)، می‌توان چنین فرض نمود که گلایسین بتایین برای غلبه بر آثار مخرب تنش شوری در گیاه تنباکو به جای افزایش محتوای فلاونوئید کل بیشتر در جهت ایفای چنین نقش‌هایی وارد شده باشد. از سوی دیگر، شاید بتوان چنین استنباط نمود که احتمالاً کاهش فلاونوئید کل گیاه و افزایش آنتوسیانین‌ها در تنش شوری تحت پیش‌تیمار با اتانول آمین مربوط به مجموعه‌ای از ترکیبات خانواده فلاونوئیدها باشد. برای مثال، بایستی در این خانواده ترکیباتی نظیر: فلاون، فلاونول، فلاونون، ایزوفلاون را نیز در نظر داشت و ممکن است علیرغم افزایش آنتوسیانین‌ها برخی از این ترکیبات کاهش یافته باشد.

در مجموع، می‌توان گفت با توجه به داده‌های زیستی و رشد و نموی حاصل از بررسی پیش‌تیمار اتانول امین (داده‌ها این بخش ارایه نشده است) رشد گیاه تنباکو در تنش شوری با پیش‌تیمار اتانول آمین بهبود معنی‌داری نشان داد و در نتیجه می‌توان گفت احتمالاً بخشی از این افزایشِ تحمل به شوری در گیاه تنباکو، می‌تواند به تغییر مسیر فنل‌ها به عنوان بخشی از سیستم آنتی‌اکسیدانی گیاه مربوط باشد. از آنجا که پژوهش حاضر نخستین گزارش در زمینه تأثیر اتانول آمین بر ترکیبات فنلی است، بررسی‌های بیشتر و جامع‌تری به منظور آشکار شدن نحوه عملکرد اتانول آمین روی این گروه از آنتی‌اکسیدان‌ها لازم به نظر می‌رسد.

سپاسگزاری..

نگارندگان مقاله از دانشگاه اصفهان و قطب تنش‌های گیاهی به خاطر حمایت از پژوهش حاضر سپاسگزاری می‌نمایند.