مطالعه تکوینی فراساختار سلول‌های کلاهک در ریشه گیاه نخود (Pisum sativum L.)

کلاهک ریشه در بخش انتهایی ریشه‌های اصلی و فرعی قرار می‌گیرد و علاوه بر محافظت فیزیکی مریستم رأسی، در پاسخ ریشه به نیروی جاذبه یا ژئوتروپیسم و همچنین، تسهیل حرکت ریشه در خاک با تولید و ترشح موسیلاژ نقش دارد (Barlow, 2003). با این که کلاهک در بیشتر گیاهان عالی اندازه کوچکی دارد و فقط از چند لایه سلولی تشکیل شده است، اما تخصص‌یابی فراساختاری و عملکردی درخور توجهی در میان سلول‌های آن دیده می‌شود.

سلول‌های حساس به نیروی جاذبه، که به نام استاتوسیت (statocyte) نیز معرفی می‌شوند، مستقیماً از سلول‌های مریستمی منشأ می‌گیرند و معمولاً در لایه‌های بالایی بخش مرکزی کلاهک یا کلوملا (columella) در زیر ناحیه مریستمی قرار دارند (Driss-Ecole et al., 2003). در این سلول‌ها هسته نسبتاً درشت در بخش فوقانی و شبکه آندوپلاسمی در بخش پیرامونی سلول (به ویژه در قطب تحتانی) قرار دارند. استاتوسیت‌ها فاقد واکوئل مرکزی هستند و ریزرشته‌ها (microfilaments) و ریزلوله‌ها (microtubules) با تراکم زیادی در بخش مرکزی و تحتانی سلول پراکنده‌اند. استاتوسیت‌ها دارای اندامک‌های نسبتاً درشتی به نام استاتولیت (statolith) هستند که به سمت نیروی جاذبه تغییر مکان می‌دهند. در گیاهان عالی آمیلوپلاست‌های غنی از نشاسته و نسبتاً درشت به عنوان استاتولیت در دریافت نیروی جاذبه دخالت دارند (Stanga et al., 2011). در برخی گیاهان پست نیز وزیکول‌ها و دانه‌های غنی از مواد معدنی به عنوان استاتولیت معرفی شده‌اند (Blancaflor and Masson, 2003). با این که نقش استاتولیت‌ها در پذیرش نیروی جاذبه کاملاً مورد پذیرش است، در مورد مکانیسم عمل آنها هنوز اتفاق نظر حاصل نشده است. به نظر می‌رسد که استاتولیت‌ها به کمک عناصر اسکلت سلولی یعنی ریزرشته‌ها و ریزلوله‌ها انتقال پیام به سایر بخش‌های سلول را بر عهده دارند ‎(Palmieri and Kiss, 2005; Nakamura et al., 2011). در این ارتباط، باز شدن کانال‌های کلسیم شبکه آندوپلاسمی و در نتیجه فعال‌سازی کالمودولین (calmodulin) به عنوان یکی از آثار حرکت استاتولیت‌ها گزارش شده است (Hayatsu et al., 2012). گزارش‌هایی نیز در زمینه فعال‌سازی پذیرنده‌های موجود در غشای پلاسمایی وجود دارد (Yoder et al., 2001).

سلول‌های ترشح کننده موسیلاژ موقعیت سطحی‌تری دارند و در لایه‌های بیرونی کلاهک قرار می‌گیرند. طی تمایزیابی، استاتوسیت‌ها با تغییرات فراساختاری قابل ملاحظه‌ای نظیر افزایش تعداد اجسام گلژی، تشکیل واکوئل مرکزی و کاهش پلاست‌ها به این سلول‌ها تبدیل می‌شوند (Iijima et al., 2008). در سلول‌های ترشحی کلاهک نقش فعال دیکتیوزوم‌ها در ترشح گرانولوکرین با تولید وزیکول‌های حاوی پلی‌ساکاریدهای موسیلاژی در اکثر ریشه‌ها، به ویژه در ریشه گیاهان تک‌لپه نظیر ذرت، گزارش شده است (Pimpl et al., 2000; Iijima et al., 2004). تبدیل استاتوسیت‌ها به سلول‌های ترشحی احتمالاً یک فرآیند تمایزی وابسته به سن و موقعیت سلول‌هاست که در آن فاصله زمانی و مکانی از ناحیه مریستمی دارای نقش است. با این حال، گزارش‌ها نشان داده‌اند که در بین گونه‌های گیاهی مراحل تمایز سلول‌های ترشحی در کلاهک دارای تفاوت‌هایی هستند (Moore and McClelen, 1985؛ Kordyum et al., 1999؛ (Rost, 2011. برای مثال، تعداد لایه‌های سلولی کلاهک، سرعت تمایز سلول‌ها و همچنین، منشأ اندامک‌های سلول‌های ترشحی در میان گونه‌های مطالعه شده متفاوت است.

برخلاف بسیاری از بافت‌های گیاهی، سلول‌های کلاهک ریشه به علت تماس فیزیکی مستقیم با ذرات خاک طول عمر کوتاهی دارند و مدت کوتاهی پس از بلوغ می‌میرند و از سطح آن جدا می‌شوند. از این رو، در بیشتر گیاهان پس از گذشت یک تا چند روز ساختار کلاهک کاملاً تجدید می‌شود. با توجه به طول عمر کوتاه سلول‌ها و از سوی دیگر تخصص‌یابی درخور توجه در لایه‌های مختلف سلولی، کلاهک ریشه برای بررسی برخی ویژگی‌های فراساختاری سلول‌ها نظیر بررسی منشأ و همچنین، تغییر و تحول رشد و نموی اندامک‌ها مناسب است. گیاهان تیره بقولات به علت دارا بودن ریشه‌چه نسبتاً درشت برای مطالعات ساختاری و فراساختاری کلاهک مناسب به نظر می‌رسند. با این حال، تاکنون مطالعات فراساختاری محدودی در زمینه منشأ اندامک‌ها در کلاهک ریشه‌های اعضای این تیره انجام شده است. از سوی دیگر، مطالعات روی بافت‌های گونه‌هایی از این تیره نظیر ماش و عدس نشان داده است که تفاوت‌هایی در تولید اندامک‌هایی نظیر واکوئل طی نمو سلول‌ها وجود دارد (Mesquita, 1969; Amelunxen and Heinze, 1984). از این رو، در پژوهش حاضر، فراساختار سلول‌های رأسی کلاهک ریشه دانه‌رُست‌های نخود به عنوان یکی از مهم‌ترین اعضای تیره بقولات مطالعه شده است. گسترش اندامک‌ها طی تمایزیابی سلول‌های ترشحی و به ویژه نحوه شکل‌گیری دستگاه واکوئلی از غشاهای شبکه آندوپلاسمی در این سلول‌ها بحث و بررسی شده است.

مواد و روش‌ها

بذرهای گیاه نخود L.) (Pisum sativum به مدت 12 ساعت در آب مقطر و پس از آن روی کاغذ صافی استریل مرطوب قرار گرفتند. پس از جوانه‌زنی بذرها در دمای آزمایشگاه، نوک ریشه‌های دانه‌رُست‌های 3 روزه به طول 2 میلی‌متر بریده شد و نمونه‌ها که دارای کلاهک در انتهای خود بودند، در درون محلول تثبیت‌کننده نخستین حاوی w/v 5/1 درصد پارافرم‌آلدئید و v/v 2 درصد گلوتارآلدئید در بافر فسفات mM 100 با اسیدیته 7 به مدت 4 ساعت غوطه‌ور شدند. قطعات ریشه تثبیت شده، 3 بار به مدت 10 دقیقه توسط بافر فسفات شستشو شدند و سپس درون تثبیت‌کننده ثانویه به مدت 2 ساعت توسط محلول تتراکسید اسمیوم v/v 1 درصد در بافر فسفات انجام شد. پس از شستشوی نمونه‌ها، آب‌گیری آنها توسط محلول‌های اتانول با غلظت‌های فزاینده (25 تا 100 درصد) انجام شد. آغشته‌سازی با استفاده از رزین لندن سفید (London Resin White: LR White) انجام شد و قالب‌گیری نمونه‌ها به مدت 22 ساعت در دمای 60 درجه سانتیگراد در شرایط خلأ ادامه یافت (Robinson et al., 1995).

تهیه برش‌های طولی با ضخامت 60 نانومتر با استفاده از میکروتوم Leica و تیغ الماس انجام شد. نمونه‌ها بر روی گریدهای نیکل دارای یک لایه فرم‌وار پوشش داده شده با کربن، جمع‌آوری شدند و رنگ‌آمیزی برش‌ها با استفاده از محلول‌های سیترات سرب و اورانیل استات w/v 2 درصد هر یک به مدت 5 دقیقه انجام شد. پس از شستشوی مکرر با آب مقطر و خشک شدن نمونه‌ها در دمای آزمایشگاه، مشاهده آنها با استفاده از میکروسکوپ الکترونی عبوری (LEO 906, Germany)(TEM) با ولتاژ kV 80 در آزمایشگاه میکروسکوپ الکترونی دانشگاه علوم پزشکی تبریز انجام شد. با توجه به این که برش‌ها به طور طولی تهیه شدند و در برگیرنده همه سلول‌های ناحیه کلاهک بودند، برای تشخیص لایه‌های مختلف کلاهک، ناحیه مریستمی به عنوان محل پیدایش سلول‌ها و پیرامونی‌ترین لایه به عنوان مسن‌ترین بخش، مد نظر قرار گرفت.

نتایج

سلول‌های کلاهک ریشه در دانه‌رُست‌های نخود از حدود 8 تا 10 لایه سلولی تشکیل شده‌اند. از لایه سوم و چهارم زیر ناحیه مریستمی، ویژگی‌های فراساختاری سلول‌های بخش مرکزی یا کلوملا قابل تشخیص است. سلول‌های این منطقه با دارا بودن ویژگی‌های مربوط به سلول‌های جوان به همراه ویژگی‌های شناخته شده مربوط به استاتوسیت‌ها مشخص می‌شوند. سلول‌ها دارای هسته‌ای درشت در قطب نزدیک یا فوقانی، دیواره‌های سلولی نازک و پلاسمودسماتای متعدد هستند. آمیلوپلاست‌های فراوان در قطب دور یا تحتانی سلول دیده می‌شوند. میتوکندری‌ها با تعداد زیاد، دیکتیوزوم‌های گلژی و غشاهای شبکه آندوپلاسمی در تمام بخش‌های سلول به چشم می‌خورند، اما به علت تراکم سیتوپلاسم در قطب دور این اندامک‌ها در این ناحیه بیشتر جلب نظر می‌کنند (شکل A1).

شکل 1- فراساختار سلول‌های کلاهک ریشه. (A یک سلول کلاهک جوان در لایه سوم ناحیه مرکزی (کلوملا) با هسته درشت در قطب فوقانی و آمیلوپلاست‌ها در قطب تحتانی؛ (B سلول مسن‌تر در لایه‌های پایینی ناحیه مرکزی (کلوملا) با نسبت نوکلئوپلاسمیک کمتر و شبکه آندوپلاسمی و دیکتیوزوم‌های در حال گسترش. Amy: آمیلوپلاست؛ CW: دیواره سلولی؛ ER: شبکه آندوپلاسمی؛ M: میتوکندری؛ N: هسته؛ Pd: پلاسمودسماتا.

با افزایش سن این سلول‌ها که با فاصله گرفتن آنها از ناحیه مریستمی و نزدیک شدن به ناحیه پیرامونی کلاهک مشخص می‌شوند، برخی ویژگی‌های دیگر در آنها ظاهر می‌شود، اندازه سلول‌ها بزرگ‌تر می‌شود و نسبت نوکلئوپلاسمی کاهش می‌یابد که نشان‌دهنده افزایش تخصص‌یابی و دور شدن از ویژگی‌های مریستمی است. اندازه آمیلوپلاست‌ها، تعداد دیکتیوزوم‌های گلژی و ضخامت دیواره سلولی به طور قابل ملاحظه‌ای افزایش می‌یابد، اما در درون آنها نیز واکوئل به چشم نمی‌خورد (شکل B1). شبکه آندوپلاسمی با ساختار توبولی-وزیکولی نیز در قطب تحتانی سلول به تدریج گسترش خود را آغاز می‌کند. تولید وزیکول‌ها در اطراف غشاهای شبکه آندوپلاسمی در میکروگراف‌های تهیه شده قابل مشاهده است. ساختارهای ترشحی اطراف شبکه آندوپلاسمی از نقطه نظر چگالی الکترونی متفاوتند و برخی دارای محتوای کاملاً روشن و برخی دیگر به طور مشابه با وزیکول‌های گلژی که در بیوسنتز دیواره دخالت می‌کنند، دارای محتوای تیره‌تر هستند (شکل A2). افزایش تعداد دیکتیوزوم‌های گلژی با وزیکول‌های فراوان در اطراف خود مشخصاً به منظور دخالت در افزایش اندازه و ضخامت دیواره سلولی صورت می‌گیرد. غشای پلاسمایی با ساختاری موّاج که گویای پیوستن وزیکول‌های ترشحی به این ساختار است، تأییدی بر این مدعاست. در برخی از قسمت‌های غشای پلاسمایی افزوده شدن مواد دیواره‌ای توسط وزیکول‌ها به طور مشخص قابل مشاهده است (شکل B2).

از لایه ششم زیر مریستم به سمت پیرامون، تغییرات بیشتری در سلول‌ها مشاهده می‌شود که در ارتباط با مسن‌تر شدن سلول‌ها و همچنین، تخصص‌یابی آنها برای ترشح است. یکی از مشخص‌ترین تغییرات سلول این است که اندامک‌های موجود در سیتوپلاسم به تدریج به نواحی پیرامونی رانده می‌شوند و یک بخش عاری از اندامک شکل می‌گیرد (شکل A3). تعداد بسیار محدودی از اندامک‌ها نظیر برخی میتوکندری‌ها و دیکتیوزوم‌ها ممکن است در این منطقه مشاهده شوند که طی مراحل بعدی تکوینی به طور کامل از این منطقه خارج می‌شوند. با پیشرفت نمو سلول‌ها به منظور ترشح، غشاهایی با لومن مشخص در بخش‌های پیرامونی منطقه عاری از اندامک آرایش پیدا می‌یابند که به نظر می‌رسد برای تشکیل واکوئل سازمان می‌یابند. این ساختارهای غشایی به تدریج به هم نزدیک می‌شوند و فضای لومن این غشاها عریض‌تر می‌شود. به این صورت با مسن‌تر شدن آنها تشکیل واکوئل درشت مرکزی به طور از نو (de novo) قابل مشاهده است. منطقه عاری از اندامک در ناحیه فوقانی سلول‌ها یعنی قطب فوقانی مشاهده می‌شود و در قطب تحتانی غشاهای شبکه آندوپلاسمی توسعه می‌یابند (شکل B3).

بررسی دقیق برخی از غشاهای اطراف منطقه عاری از اندامک، وجود ریبوزوم‌ها را روی این غشاها و در کناره‌های آنها، در محلی که لومن عریض نشده است، تأیید نمود (شکل C3). به این صورت، شبکه آندوپلاسمی را می‌توان به عنوان منشأ غشاهای آرایش یافته در اطراف منطقه عاری از اندامک در سلول‌های کلاهک نخود معرفی نمود. واکوئل تشکیل شده به تدریج به رشد خود ادامه می‌دهد و با کامل شدن رشد سلول‌ها و رسیدن به نواحی پیرامونی کلاهک بخش عمده سلول را به خود اختصاص می‌دهد (شکل 4). پس از این مرحله، که آخرین مرحله تکوینی است، سلول‌ها از کلاهک جدا می‌شوند.

شکل 2- تولید وزیکول‌های ترشحی در سلول‌های کلاهک ریشه. (A وزیکول‌های در حال تشکیل روی غشاهای شبکه آندوپلاسمی (با پیکان نشان داده شده است)؛ (B دیکتیوزوم‌های فراوان در مجاورت غشای پلاسمایی. ملحق شدن وزیکول‌های ترشحی به غشای پلاسمایی مشخص است. Amy: آمیلوپلاست؛CW : دیواره سلولی؛ ER: شبکه آندوپلاسمی؛ M: میتوکندری.

شکل 3- دخالت غشاهای منشأ گرفته از شبکه آندوپلاسمی در تشکیل واکوئل در سلول‌های ترشحی کلاهک. (A احاطه شدن منطقه عاری از اندامک توسط تعدادی از غشاها با لومن مشخص (پیکان ها)؛ (B گسترش شبکه آندوپلاسمی در بخش تحتانی سلول‌ها؛ (C ریبوزوم‌ها روی غشاهای اطراف بخش عاری از اندامک. CW: دیواره سلولی؛ ER: شبکه آندوپلاسمی؛ EZ: منطقه عاری از اندامک؛ M: میتوکندری.

شکل 4- یک سلول ناحیه پیرامونی کلاهک با واکوئل درشت مرکزی در حال رشد. CW: دیواره سلولی؛ ER: شبکه آندوپلاسمی؛ G: گلژی؛ M: میتوکندری؛ N: هسته؛ V: واکوئل.