آهن یکی از عناصر ضروری برای همه گیاهان عالی است که مقدار آن در خاک‏ها به طور متوسط 8/3 درصد تخمین زده می‏شود .(Lindsay, 1979) آهن در همه موجودات زنده به عنوان کوفاکتوری مهم در مسیر‌های متابولیکی زیستی نقشی تعیین‌کننده دارد (Audebert, 2006). این عنصر، در ترکیب ساختمانی مولکول‌های دارای هِم مانند: پورفیرین، سیتوکروم و مولکول‌های فاقد هِم مانند: فرّودوکسین و پروتئین‌های آهن-گوگرد وجود دارد که در واکنش‌های اکسیداسیون و احیا تنفسی و فتوسنتز نقش دارند. همچنین، آهن در سیستم‌های آنزیمی، سیتوکروم اکسیداز، کاتالاز، پراکسیداز، اکونیتاز، غیراشباع کردن اسیدهای چرب، سنتز کلروفیل و ... شرکت می‌کند. نقش اصلی آهن زمانی خودش را بهتر نشان می‌دهد که کمبود آن باعث زردی برگ‌های جوان می‌شود. کمبود آهن در مرکبات و غلات مشکل عمده تغذیه گیاه در خاک‌های آهکی محسوب می‌شود (Perez-Sanz et al., 2002). علایم کمبود آهن ابتدا در جوان‌ترین برگ‌ها به صورت زردی بین رگبرگی و سرانجام در پهنک برگ به رنگ زرد و حتی سفید بروز می‌کند (Marschner, 1995). این نشانه‌ها معمولاً می‌توانند در مراحل مختلف رشد مانند جوانه‌زنی، رشد رویشی و مرحله زایشی در برنج بروز کنند (Sahrawat, 2004; Becker and Asch, 2005). کمبود آهن با کاهش کلروفیل و آسیب به واکنش‌های اکسیداسیون و احیا به فتوسنتز آسیب می‌زند. علاوه بر این، یکی از مکانیسم‌های اصلی کاهش رشد در کمبود آهن تولید گونه‏های فعال اکسیژن (ROS) است که شامل رادیکال‏های سوپراکسید (O₂^-)، پراکسید هیدروژن (H₂O₂) و هیدروکسیل (OH^-) است (Laspina et al.,2005). افزایش میزان پراکسید هیدروژن و رادیکال‌های آزاد اکسیژن در کمبود پتاسیم در گیاه سویا (Miao et al., 2010) گزارش شده است. رادیکال‏های آزاد می‌توانند کلروفیل را اکسید و در انتقال الکترون فتوسنتزی اختلال ایجاد کنند. گیاهان برای پالایش ROS دارای مکانیسم آنزیمی شامل کاتالاز، پراکسیداز، آسکوربات پراکسیداز، سوپراکسید‏دیسموتاز و گلوتاتیون ردوکتاز و غیر‏آنزیمی شامل گلوتاتیون، آسکوربات و کاروتنوئیدها هستند .(Tiryakioglu et al., 2006) کمبود عناصر با ایجاد تنش اکسیداتیو پراکسیداسیون لیپید در گیاه را افزایش می‌دهد (Tewari et al., 2007; Miao et al., 2010). محققان متعددی تخفیف تنش اکسیداتیو ایجاد شده در اثر عوامل تنش‌زای مختلف با تغذیه سیلیکون را گزارش کرده‌اند.

سیلیکون به عنوان دومین عنصر ساختمانی پس از اکسیژن در پوسته زمین و خاک است (Richmond and Sussman, 2003) که در گیاهان به عنوان عنصری غیر‏متحرک بوده، ضروری تلقی نمی‏شود ولی بسیاری از گیاهان عالی از جمله برنج برای رشدونمو طبیعی خود به سیلیکون نیاز دارند (Richmond and Sussman, 2003؛ Ma, 2004؛ Currie and Perry, 2007). میزان سیلیکون در خاک کمتر از 1 تا 45 درصد وزن خشک خاک است، با این وجود، تنها 1/0-6/0 میلی‌مولار آن به صورت محلول است (Sommer et al., 2006)، که به شکل سیلیسیک اسید Si(OH)₄ (یا شکل یونیزه شده Si(OH)₃O^- در اسیدیته بیشتر از 9) توسط گیاهان قابل جذب است. میزان آن در گیاهان از 1/0 تا 10 درصد از وزن خشک گیاه را شامل می‏شود که تقریباً برابر با عناصر پُرمصرف است (Hodson et al., 2005). تأثیر مفید سیلیکون در گیاهان بیشتر به افزایش مقاومت گیاهان در برابر تنش‏های زیستی و غیرزیستی مربوط است (Ma and Yamaji, 2006; Liang et al., 2007). سیلیکون از طریق ایجاد کمپلکس و مهار انتقال فلزات سنگین از ریشه به بخش هوایی، بخش‏بندی یون‏های فلزی در درون گیاه و تحریک سیستم آنتی‏اکسیدان در گیاهان، سمّیت برخی از فلزات سنگین را در گیاهان کاهش می‏دهد (Neumann and Zur Nieden, 2001
Shi et al., 2005a, 2005b)؛ Gong et al., 2005. اثر تخفیفی سیلیکون در گیاهان در برابر تنش‏های غیر‏زیستی اغلب با تغییر فعالیت آنزیم‏های اکسیداتیو همراه است، هرچند مکانیسم‌های درگیر در این عمل چندان شناخته شده نیست (Liang et al., 2007; Miao et al., 2010). سیلیکون با تغییر در فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان نقش مهمی در افزایش تحمل شوری (Zhu et al., 2004; Al-Aghabary et al., 2005)، خشکی (Gong et al., 2005)، سمّیت منگنز (Shi et al., 2005b)، سمّیت بور (Gunes et al., 2007) و سمّیت کادمیوم(Vaculik et al., 2009; Shi et al., 2010) ایفا می‏کند، تاکنون پژوهش چندانی در ارتباط با نقش تغذیه سیلیکون در کمبود عناصر ضروری از جمله آهن صورت نگرفته است و تنها نقش مفید این عنصر در کمبود پتاسیم در گیاه سویا گزارش شده است (Miao et al., 2010).

برنج (Oryza sativa L.) از مهم‌ترین محصولات زراعی در جهان است که غذای اصلی 40 درصد جمعیت دنیا را تشکیل می‌دهد. این محصول دو سوم کالری مورد نیاز برای حدود دو میلیارد نفر را در آسیا تأمین می‌کند و منبع اصلی پروتئین برای این جمعیت است. با توجه به اینکه برنج گیاه انباشته کننده سیلیکون محسوب می‌شود، به عنوان گیاه مدل در جذب و انتقال و تغذیه سیلیکون استفاده می‌شود (Mitani and Ma, 2005). با توجه به اهمّیت روز افزون برنج به عنوان ماده غذایی ارزشمند در جیره غذایی انسان، تحقیق در مورد کمبود آهن که در مزارع برنج باعث کاهش عملکرد محصول می‏شود، اهمّیت زیادی دارد. تغذیه سیلیکون ممکن است در کاهش آسیب‌های کمبود آهن در گیاه برنج مؤثر باشد. بنابراین، در این پژوهش گیاه برنج در شرایط کمبود آهن در فقدان و حضور سیلیکون کاشته، عواملی مانند میزان کلروفیل، کاروتنوئیدها، پراکسیداسیون لیپید، پراکسید هیدروژن و فعالیت برخی آنزیم‌های آنتی‏اکسیدان ارزیابی شد تا درک بهتری از راه‌های آسیب و مسیرهای احتمالی افزایش تحمل به کمبود آهن با تغذیه سیلیکون فراهم شود.

مواد و روش‌ها

کشت گیاهان

بذرهای گیاه برنج رقم طارم (O. sativa L.) از مرکز تحقیقات برنج آمل تهیه و با استفاده از الکل و هیپوکلریت سدیم ضدعفونی شد. بذرها برای جوانه‌زنی در داخل حوله کاغذی مرطوب در اتاقک کشت قرار گرفتند. پس از گذشت 4 روز بذرها جوانه زده، به گلدان‌های حاوی شن غربال و کاملاً شسته شده منتقل شدند. هر 4 گلدان در یک تشتک قرار داده و با 8 لیتر محلول غذایی غرقاب شدند. سطح و کف گلدان‌ها با فواصل 2 سانتی‌متری سوراخ شد تا تبادل محلول غذایی بین تشت و گلدان تسهیل شود. محلول مورد استفاده برای کشت، یوشیدا (Yoshida et al., 1976) بود که بر اساس تیمارهای آهن و سیلیکون تعدیل شد. طرح آزمایش بلوک‌های کامل تصادفی و در قالب فاکتوریل بود. عامل آهن در سه سطح صفر، 2 و 10 (شاهد) میلی‏گرم در لیتر به صورت Fe-EDTA و عامل سیلیکون در دو سطح صفر و 5/1 میلی‏مولار به صورت Na₂SiO₃ به گیاه داده شد. تیماردهی از هفته دوم کشت شروع شد. اسیدیته محلول غذایی تشتک‎ها به صورت روزانه بین 5/5 تا 6 تنظیم شد و در پایان هر هفته، محلول درون تشتک‌ها تعویض شد. در طول دوره آزمایش بیشینه و کمینه دمای روز و شب به ترتیب 32 و 19 درجه سانتیگراد و میانگین رطوبت نسبی 74 درصد بود. گیاهان پس از سه هفته تیماردهی برای بررسی رشد و تجزیه بیوشیمیایی برداشت شدند.

عناصر سیلیکون و آهن

غلظت آهن با دستگاه جذب اتمی مدل Shimadzu AA 7000 پس از استخراج بافت‌های گیاهی با نیتریک ‌اسید و پرکلریک اسیدتعیین شد. استخراج یون سیلیسیوم با روش Elliot و Synder (1991) و اندازه‏گیری با روش رنگ‌سنجی Narayanaswamy و Prakash (2009) انجام شد.

اندازه‫گیری پراکسیداسیون لیپید، پراکسید هیدروژن،کلروفیل و کاروتنوئید

اندازه‌گیری مقدار مالون‏دی‌آلدهید (MDA) به عنوان شاخص پراکسیداسیون لیپید باروش Heath و Packer (1968) انجام شد. عصاره گیاهان توسط 2 میلی‌لیتر تری کلرواستیک اسید 1/0 درصد استخراج شد. برای اندازه‌گیری از معرف تیوباربیتوریک اسید/تری کلرو استیک اسید (TBA/TCA) شامل TBA 25/0 درصد در TCA 10 درصد در دمای 95 درجه سانتیگراد استفاده شد. جذب محلول به دست آمده به روش فتومتریک و در سه طول موج 440، 532 و 600 نانومتر ثبت شد. عمل استخراج پراکسید هیدروژن بر طبق روش Chen و همکاران (2000) توسط بافر فسفات 50 میلی‌مولار با اسیدیته 5/6 حاوی هیدروکسیل‏آمین 1 میلی‌مولار در دمای 4 درجه سانتیگراد انجام شد. اندازه‌گیری پراکسید هیدروژن با استفاده از معرف کلرید تیتانیوم (کلرید تیتانیوم 1/0 درصد (حجم/حجم) حل شده در سولفوریک اسید 20 درصد)، در طول موج 410 نانومتر انجام شد. ضریب خاموشی برای محاسبه مقدار کمپلکس تیتانیوم-پراکسید هیدرژن 28/0 (µmol^-1cm^-1) است. برای سنجش میزان کلروفیل و کاروتنوئید از روش Lichtenthaler (1987) استفاده شد.

فعالیت آنزیم‌های کاتالاز، پراکسیداز محلول و دیواره‏ای، پلی فنل اکسیداز و آسکوربات پراکسیداز

عصاره آنزیمی لازم برای اندازه‌گیری فعالیت آنزیم‌های کاتالاز، پراکسیداز محلول و دیواره‏ای و پلی‌فنل اکسیداز با استفاده از بافر فسفات 100 میلی‌مولار با اسیدیته 8/6 از بافت تر گیاهان استخراج شد (Liu and Huang, 2000). فعالیت آنزیم‏ها از روش اسپکتروفتومتری و با دستگاه (Shimidzo UV-160) اندازه‌گیری شد. فعالیت آنزیم کاتالاز و پراکسیداز با استفاده از روش Kar و Mishra (1976) انجام شد. فعالیت این آنزیم در مد سینتیک و در طول موج 240 نانومتر اندازه‌گیری شد. 3 میلی‌لیتر مخلوط واکنش شامل بافر فسفات 50 میلی‌مولار با اسیدیته 8/6، آب اکسیژنه 15 میلی‏مولار و 100 میکرولیتر عصاره آنزیمی بود. با اضافه کردن عصاره به محیط واکنش تجزیه H₂O₂ توسط آنزیم شروع می‏شود. برای اندازه‏گیری فعالیت آنزیم پراکسیداز محلول و دیواره‏ای، مخلوط واکنش شامل بافر فسفات 25 میلی‌مولار با اسیدیته 8/6، گایاکول20 میلی‌مولار، آب اکسیژنه 40 میلی‌مولار و10 میکرولیتر عصاره آنزیمی بود. فعالیت این آنزیم در مد سینتیک و در طول موج 470 نانومتر اندازه‌گیری شد. برای اندازه‌گیری آنزیم پلی فنل اکسیداز مخلوط واکنش شامل بافر فسفات 25 میلی‌مولار با اسیدیته 8/6، پیروگالل 10 میلی‌مولار و 100 میکرو‌لیتر عصاره آنزیمی استفاده شد (Resende et al., 2002). استخراج آنزیم آسکوربات پراکسیداز با استفاده از بافر فسفات 250 میلی‌مولار با اسیدیته 7 از روش Nakano و Asada (1981) بود. 2 میلی‌لیتر مخلوط واکنش برای اندازه‏گیری آسکوربات پراکسیداز شامل بافر فسفات 250 میلی‌مولار با اسیدیته 7، EDTA 1/0 میلی‌مولار، آسکوربات 5/0 مولار و H2O2 2/1 میلی‌مولار بود. عمل اندازه‌گیری در طول موج 290 نانومتر انجام شد.

تحلیل آماری

محاسبه داده‏ها و رسم نمودارها در نرم‌افزار Excel و Sas انجام شد. همه داده‌ها با تجزیه واریانس یک عاملی و دو عاملی تجزیه شدند. مقایسه میانگین‌ها با آزمون دانکن انجام شد.

نتایج

رشد

در غیاب سیلیکون، بیشترین میزان وزن تر ریشه و بخش هوایی گیاه در تیمار 10 میلی‌گرم در لیتر آهن و کمترین میزان آن در تیمار صفر مشاهده شد. کاهش میزان آهن از 10 میلی‌گرم در لیتر به 2 و صفر میلی‌گرم در لیتر به کاهش معنی‌دار وزن تر ریشه و بخش هوایی گیاه منجر شد. کاربرد سیلیکون در تیمار‏های 2 و 10 میلی‏گرم در لیتر آهن به افزایش وزن تر ریشه و بخش ‏هوایی نسبت به گیاه فاقد سیلیکون منجر شد، در حالی که حضور آن در تیمار صفر تأثیر معنی‏د‏اری بر وزن تر نداشت. تفاوت معنی‏داری در تعداد برگ بین تیمار‏های صفر، 2 و 10 میلی‏گرم در لیتر آهن مشاهده نشد، با این وجود، کاهش معنی‌دار تعداد پنجه در تیمار‏های صفر و 2 میلی‌گرم در لیتر آهن نسبت به تیمار 10 میلی‌گرم در لیتر آهن مشاهده شد. حضور سیلیکون در تمام تیمارها به افزایش تعداد پنجه و برگ نسبت به گیاه فاقد سیلیکون منجر شد (شکل 1).

میزان عناصر سیلیکون و آهن

تفاوت معنی‏داری بین تیمارهای صفر، 2 و 10 میلی‌گرم در لیتر آهن در میزان سیلیکون ریشه و بخش هوایی گیاه مشاهده نشد، با این حال، حضور سیلیکون باعث افزایش معنی‏دار میزان سیلیکون در تمام تیمار‏های آهن بخش‏ هوایی گیاه نسبت به گیاه فاقد سیلیکون شد (شکل 2-الف و ب).

کاهش میزان آهن در تیمارهای صفر و 2 میلی‌گرم در لیتر آهن به کاهش میزان آهن در ریشه و بخش ‏هوایی گیاه نسبت به تیمار 10 میلی‌گرم در لیتر آهن منجر شد. این کاهش در بخش هوایی مشهودتر بود. حضور سیلیکون تنها در تیمار 2 میلی‌گرم در لیتر آهن باعث افزایش معنی‌دار میزان آهن در ریشه و بخش هوایی گیاه نسبت به گیاهان رشد یافته در محیط فاقد سیلیکون شد (شکل 2-پ و ت).

کمبود آهن در تیمارهای صفر و 2 میلی‏گرم در لیتر به ترتیب باعث افزایش میزان پراکسید هیدروژن در ریشه و بخش هوایی شد. حضور سیلیکون در تیمارهای 2 و 10 میلی‏گرم در لیتر آهن باعث کاهش و در تیمار صفر میلی‏گرم در لیتر آهن باعث افزایش میزان پراکسید هیدروژن ریشه و بخش هوایی گیاه شد (شکل 3- الف و ب).

کمبود آهن در تیمار صفر میلی‌گرم در لیتر به افزایش پراکسیداسیون لیپید ریشه نسبت به تیمار 10 میلی‌گرم در لیتر آهن منجر شد. حضور سیلیکون در تمام تیمارها میزان پراکسیداسیون لیپید ریشه و بخش هوایی را به مقدار درخور توجهی کاهش داد (شکل 3-پ و ت).

با کاهش میزان آهن در تیمار صفر میلی‌گرم در لیتر فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز ریشه و بخش‏هوایی کاهش معنی‏داری را نسبت به تیمار 10 میلی‌گرم در لیتر آهن نشان داد. حضور سیلیکون به کاهش فعالیت این آنزیم در تیمار یاد شده منجر شد، با این حال، در تیمار 10 میلی‌گرم در لیتر آهن فعالیت این آنزیم را در بخش هوایی افزایش داد (شکل 4-الف و ب).

فعالیت آنزیم پلی فنل اکسیداز با کاهش میزان آهن در تیمار صفر میلی‌گرم در لیتر آهن ریشه و بخش هوایی و تیمار 2 میلی‌گرم در لیتر آهن بخش هوایی کاهش معنی‌داری را نسبت به تیمار 10 میلی‌گرم در لیتر آهن نشان داد. حضور سیلیکون در تیمار صفر میلی‌گرم در لیتر آهن ریشه باعث افزایش و در تیمار 2 میلی‏گرم در لیتر آهن ریشه باعث کاهش فعالیت آنزیم پلی فنل اکسیداز شد (شکل 4-پ و ت).

فعالیت آنزیم کاتالاز در بخش هوایی، با کاهش میزان آهن در تیمارهای صفر و 2 میلی‌گرم در لیتر آهن نسبت به تیمار 10 میلی‏گرم در لیتر آهن کاهش یافت، در حالی که در ریشه تفاوت معنی‌داری بین تیمارهای صفر، 2 و 10 میلی‌گرم در لیتر آهن مشاهده نشد. حضور سیلیکون در ریشه تأثیر معنی‌داری در فعالیت این آنزیم نشان نداد، با این حال، در بخش هوایی به افزایش معنی‏دار فعالیت این آنزیم در تیمارهای 2 و 10 میلی‏گرم در لیتر آهن منجر شد (شکل 5-الف و ب).

کاهش فعالیت آنزیم‌های پراکسیداز محلول و دیواره‌ای با کاهش میزان آهن در تیمارهای صفر و 2 میلی‏گرم در لیتر آهن نسبت به تیمار 10 میلی‏گرم در لیتر آهن مشاهده شد. حضور سیلیکون در تیمارهای صفر و 2 میلی‏گرم در لیتر آهن ریشه و در تیمار صفر میلی‏گرم در لیتر آهن بخش هوایی به افزایش فعالیت آنزیم پراکسیداز دیواره‌ای نسبت به گیاه فاقد سیلیکون منجر شد، ولی فعالیت آنزیم پراکسیداز محلول در همه تیمارها در ریشه و بخش هوایی در حضور سیلیکون افزایش معنی‌داری را نشان داد (شکل 5-پ تا ج).

کاهش میزان آهن در تیمارهای صفر و 2 میلی‏گرم در لیتر به کاهش معنی‏داری در میزان کلروفیل a، b، کل و کاروتنوئید نسبت به تیمار 10 میلی‏گرم در لیتر منجر شد. حضور سیلیکون در تیمارهای 2 و 10 میلی‏گرم در لیتر آهن به افزایش و در تیمار صفر میلی‏گرم در لیتر آهن به تشدید کاهش کلروفیل a، b، کل و کاروتنوئید منجر شد (شکل 6). نسبت کلروفیل a/b در فقدان آهن زیاد بود، در حالی که این نسبت در تیمارهای 2 و 10 میلی‏گرم در لیتر آهن افزایش یافت. سیلیکون تنها در تیمار 2 میلی‏گرم در لیتر آهن کاهش این نسبت را باعث شد.

شکل 1- مقایسه تأثیر تیمارهای آهن و سیلیکون بر صفات رشد الف و ب) وزن تر؛ پ) تعداد برگ؛ ت) تعداد پنجه.

شکل 2- مقایسه تأثیر تیمارهای آهن و سیلیکون بر الف و ب ) میزان سیلیکون؛ پ و ت) میزان آهن.

شکل 3- مقایسه تأثیر تیمارهای آهن و سیلیکون بر الف و ب) میزان پراکسید هیدروژن؛ پ و ت) میزان مالون‌دی‌آلدئید.

شکل 4- مقایسه تأثیر تیمارهای آهن و سیلیکون بر الف و ب) فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز؛ پ و ت) فعالیت آنزیم پلی ‏فنل اکسیداز.