باززایی گیاه از کالوس‌های حاصل از جنین رسیده ذرت (Zea mays L.)

ذرت (Zea mays L.)، یکی از مهم‌ترین منابع غذایی انسان و دام در جهان محسوب می‌شود و سطح زیر کشت بالایی از مزارع دنیا را به خود اختصاص داده است. به علت افزایش جمعیت و محدودیت سطح زیر کشت محصولات زراعی وهمچنین، تنش‌های زنده (آفات و بیماری‌ها) و غیر زنده (خشکی، شوری و سرما) تقاضا برای بهبود کیفیت و کمیّت این محصول مهم زراعی افزایش یافته، بنابراین، دستیابی به روش‌های سریع اصلاح ژنتیکی امری اجتناب ناپذیر است. گیاهان ذرت تراریخته مقاوم به آفات و بیماری‌ها سال‌هاست که به مرحله تجاری رسیده و بخش وسیعی از مزارع دنیا را به خود اختصاص داده‌اند (James, 2010). تولید گیاهان تراریخته ذرت معمولاً با استفاده از دو روش تفنگ ژنی (بمباران ذرّه‌ای) و اگروباکتریوم صورت می‌گیرد، اما پیش‌نیاز دستیابی به تراریختی ذرت تهیه روش باززایی و ریز نمونه مناسب آن است.

باززایی گیاهان از کشت بافت ذرت نخستین بار توسط Green و Philips (1974) با استفاده از جنین نارس گزارش شد. باززایی موفق گیاه از کالوس‌های حاصل از پرچم (Ting et al., 1981)، پوشه (Suprasanna et al., 1986)، گل‌آذین نارس (Pareddy and Petolino, 1990)، کاکُل نارس (Songsted et al., 1992)، قطعات برگی (Santos et al., 1984; Ahmadabadi et al., 2007)، نوک ساقه (O’Connor-Sanchez et al., 2002) و مریستم نوک ساقه (Zhang and Lemaux, 2002) گزارش شده است. کالوس‌های حاصل از جنین‌های نارس نسبت به سایر ریز نمونه‌ها کارآیی بیشتری در باززایی دارند.

در این تحقیق، سیستم باززایی دیگری مبتنی بر تشکیل کالوس‌های جنین‌زا، از جنین رسیده ذرت بررسی شده است. باززایی گیاهان از جنین رسیده، پیش از این در غلات مختلف مانند برنج (Rueb et al., 1994)، جو (Akula et al., 1999) و چاودار (Ward and Jordan, 2001) انجام شده است. استفاده از جنین رسیده حاصل از بذرهای خشک مزایای متعددی دارد که از جمله می‌توان به سهولت کار و قابل دسترس بودن آن در طول سال اشاره کرد. نخستین بار Green و همکاران (1974) گزارش کردند که جنین‌های رسیده ذرت را می‌توان برای تشکیل کالوس به کار برد، اما موفق به باززایی آن نشدند. از آن پس، پیشرفت‌های زیادی در زمینه کشت بافت گیاه ذرت صورت گرفته است. با این وجود، کارآیی باززایی کالوس‌های حاصل از جنین رسیده تا حدودی نسبتاً پایین است و جنین‌های رسیده نسبت به جنین‌های نارس در کشت بافت بسیار سرسخت هستند. این موضوع را می‌توان در گزارش‌های ارایه شده توسط محققان مشاهده کرد. Wang (1987) موفق شد تا از جنین رسیده دو لاین B73 و Mo17 به طور موفقیت‌آمیزی گیاه باززایی نماید، اما روش استفاده شده توسط آنها وابسته به ژنوتیپ بوده، فرکانس باززایی 4 تا 5 درصد گزارش شد. Huang و Wei (2004) موفق شدند که در 7 لاین ذرت مورد آزمایش، میزان باززایی بین 8/19 تا 4/32 درصد به دست آورند. در گزارشی دیگر، Wu و Wang (2006) میزان باززایی مشابهی (7/25 تا 1/33 درصد) را برای لاین‌های A188 و B73 به دست آوردند. Zhao و همکاران (2008) موفق شدند میزان باززایی حدود 5/37 درصد را با استفاده از جنین رسیده ذرت رقم Dan به دست آورند. بر اساس نتایج حاصل از این تحقیقات مشخص شد که میزان باززایی جنین‌های رسیده در گیاه ذرت به عوامل مختلفی از جمله ژنوتیپ و شرایط مزرعه (مانند خاک، حاصل‌خیزی، بارش و دما که رشد گیاهِ دهنده و در نهایت کارآیی باززایی را تحت تأثیر قرار می‌دهد) بستگی دارد. بنابراین، با توجه به مشکلات مربوط به استفاده از جنین نارس (مانند محدودیت دسترسی به فصل کشت ذرت یا شرایط گلخانه‌ای مناسب برای رشد ذرت در طول سال) دستیابی به قطعات جداکشت جایگزین که محدودیت زمانی و مکانی نداشته باشد، می‌تواند گام مهمی برای موفقیت در انتقال ژن به ذرت محسوب شود. به همین دلیل، در پژوهش حاضر تلاش شد روش کارا و مؤثری برای کشت بافت و باززایی گیاه ذرت با استفاده از جنین رسیده ارایه شود. با استفاده از این روش می‌توان ار بذرهای خشک شده ذرت در طول سال به عنوان قطعه جداکشت در فرآیندهای وابسته به کشت بافت این گیاه استفاده نمود.

مواد و روش‌ها

کشت بافت جنین رسیده

به منظور بهینه‌سازی کشت بافت جنین رسیده ذرت از 5 لاین اینبرد K126، L105، B73، Mo17 و S61 تهیه شده از بخش ذرت مؤسسه اصلاح و تهیه نهال و بذر استفاده شد. بذرهای رسیده ذرت با اتانول70 درصد به مدت 2 دقیقه و پس از آن با هیپوکلریت سدیم (NaClO) 5 درصد و توین20 به میزان 1 میلی‌لیتر در لیتر، به مدت 20 دقیقه ضدعفونی گردید. پس از 6 بار آبشویی با آب مقطر استریل، بذرهای ضدعفونی شده در یک ارلن استریل حاوی 4 میلی‌گرم بر لیتر
2,4-D به مدت 48 ساعت نگهداری (تیمار) شدند. پس از آن، جنین از بذر تورم یافته با کمک تیغ اسکالپل از ناحیه محور جنینی در راستای طولی بذر دو نیم شده خارج گردید. سپس در ناحیه گره اسکوتلار، قسمت ریشه‌چه از جنین دو نیم شده حذف شد. هر یک از نیمه‌ها (از گره اسکوتلار به بالا) به محیط کالوس‌زایی انتقال داده شد.

کالوس‌زایی

برای القای کالوس اولیه، ریز نمونه‌ها (جنین‌های رسیده) به محیط کالوس‌زایی منتقل ‌شدند. محیط‌های کشت در اتاق کشت تاریک در دمای 27 درجه سانتیگراد نگهداری گردید. پس از سه هفته، کالوس‌های تشکیل شده شمارش گردید.

محیط کالوس‌زایی حاوی نمک‌های N₆، ویتامین‌های B₅، 4 میلی‌گرم در لیتر 2,4-D، 2 میلی‌گرم در لیتر گلایسین، 690 میلی‌گرم در لیتر L پرولین، 1 میلی‌گرم در لیتر کازوئین، 30 گرم در لیتر سوکروز با اسیدیته 8/5 و 8 گرم در لیتر آگار بود (Armstrong and Green, 1985).

القای جنین‌زایی

کالوس‌های تشکیل شده به محیط کشت القای جنین منتقل شدند. کشت‌ها در تاریکی در دمای 27 درجه سانتیگراد نگهداری شدند (Armstrong and Green, 1985). واکشت نمونه‌ها به فاصله دو هفته در محیط یاد شده صورت گرفت. کالوس‌های جنین‌زا پس از 4 هفته شمارش شد.

محیط‌کشت القای جنین، مشابه محیط کشت کالوس‌زایی بود، با این تفاوت که مواد تنظیم‌کننده دیگری علاوه بر 2,4-D نیز به آن اضافه شد. در این مرحله، 2 میلی‌گرم در لیتر 2,4-D و تیمارهای مختلفی از بنزیل آدنین (BA) و تیدیازرون (TDZ) با غلظت‌های صفر، 2/0 و 5/0 میلی‌گرم در لیتر و نیترات نقره نیز به غلظت‌های صفر و 10 میلی‌گرم در لیتر استفاده شد. تنظیم‌کننده‌های BA و TDZ، همچنین، نیترات نقره پس از اتوکلاو به وسیله فیلتر 2/0 میکرومتری استریل شده به محیط‌کشت اضافه شدند Duncan and Widholm, 1988)؛ (Lair et al., 2001.

باززایی

پس از گذشت 4 هفته، کالوس‌های جنین‌زا به محیط کشت باززایی منتقل شدند. کالوس‌های جنین‌زا در این مرحله، از محیط تاریکی به نور با شدت 7000 لوکس و دوره نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی انتقال داده شدند. در این محیط‌کشت، واکشت به فاصله دو هفته انجام گرفت. پس از 4 هفته کالوس‌های باززا شده شمارش گردید (Huang and Wei, 2004).

محیط باززایی شامل نمک‌های N₆ و ویتامین‌های B₅، گلایسین 2 میلی‌گرم در لیتر، سوکروز 30 گرم در لیتر با اسیدیته 8/5 و آگار 8 گرم در لیتر اتوکلاو شده، سپس غلظت‌های صفر، 2/0 و 5/0 میلی‌گرم در لیتر BA و TDZ با فیلتر استریل شده به محیط‌کشت اضافه شد (Zhao et al., 2008).

القای ریشه‌زایی

پس از رشد اندام‌های هوایی در محیط‌کشت باززایی در حد 2 سانتی‌متر، به منظور القای ریشه‌زایی، کالوس‌های باززایی شده به محیط ریشه‌زایی تحت شرایط نور با شدت 7000 لوکس و دوره نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی انتقال داده شدند.

محیط ریشه‌زایی حاوی MS رقیق (نصف غلظت معمول) و 6/0 میلی‌گرم در لیتر ایندول 3 بوتیریک اسید (IBA)، 15 گرم در لیتر سوکروز با اسیدیته 8/5 و 6 گرم در لیتر آگار بود (Huang and Wei, 2004).

انتقال ریز نمونه‌های باززا شده ریشه‌دار به خاک

پس از باززایی کامل کالوس‌ها، گیاهچه‌ها به خاک سبک استریل (حاوی نسبت‌های مساوی خاک برگ و خاک زراعی) انتقال داده شد. برای ایجاد سازگاری گیاه در گلدان، کیسه نایلونی روی هر گلدان کشیده شد و گیاه به نخستین مراحل سازگاری به محیط طبیعی وارد شد. به منظور تغذیه و آبیاری از محلول دو در هزار فوسامکو 4 (Fusamco 4) استفاده شد. پس از گذشت سه هفته که به تدریج هر هفته به اندازه روزنه‌های پوشش نایلونی افزوده شد، پوشش برداشته شد.

طرح آزمایش

به منظور بررسی بهینه‌سازی و افزایش میزان باززایی جنین‌های رسیده، آزمایش در قالب طرح کاملاً تصادفی فاکتوریل 4 فاکتوره (لاین‌های ذرت، ترکیبات و غلظت‌های هورمونی و نیترات نقره) با سه تکرار، هر تکرار حدود 600 ریز نمونه انجام شد. سه هفته پس از استخراج جنین، تعداد کالوس‌ها، 4 هفته پس از انتقال به محیط جنین‌زایی، تعداد کالوس‌های جنین‌زا و 4 هفته پس از انتقال به محیط باززایی، تعداد کالوس‌های باززا بررسی شد. برای انجام تجزیه و تحلیل آماری داده‌ها از نرم‌افزارهای MSTATC و Excel استفاده شد. مقایسه میانگین با آزمون چند دامنه‌ای دانکن در سطح احتمال 5 درصد و برخی از موارد 1/0 صورت گرفت.

نتایج

کالوس‌زایی

با انتخاب بذرهای سالم و دارای قوه نامیه بالا از 5 لاین اینبرد K126، L105، B73، Mo17 و S61 بیش از 93 درصد ریز نمونه‌های تمام لاین‌ها کالوس تولید کردند (جدول 1). تورم اسکوتلوم پس از 2 تا 5 روز و ظهور کالوس‌های اولیه سُست و به رنگ سفید مایل به زرد (2 تا 3 میلی‌متر مربع)، در دو تا سه هفته پس از استخراج جنین مشاهده شد (شکل 1).

جنین‌زایی

با انتقال کالوس‌های اولیه به محیط جنین‌زایی با حضور غلظت‌های مختلف تنظیم‌کننده‌های رشد
6- بنزیل آمینو پورین و تیدیازورون همراه با 2,4-D و جنین‌زایی در آنها به دو شکل متفاوت بود، بعضی از آنها شکل سُست، شیشه‌ای با طیفی از رنگ‌های زرد تا قهوه‌ای (غیر جنین‌زا) (شکل 1) و بعضی به صورت فشرده، نامرتب و کروی به رنگ زرد روشن (جنین‌زای تیپ I) تا سفید مات، گرزی شکل و فشرده (جنین‌زای تیپ II) (شکل 2) بودند. در جدول 2 میانگین درصد جنین‌زایی در لاین‌های ذرت به تفکیک در ترکیبات مختلف تنظیم‌کننده مقایسه شده است. تعداد و درصد ریز نمونه‌های اولیه، کالوس‌های اولیه، کالوس‌های جنین‌زا از جنین رسیده 5 لاین مورد آزمایش در تیمار 2/0 میلی‌گرم در لیتر TDZ و 10 میلی‌گرم در لیتر AgNO₃ در جدول 1 آورده شده است. نتایج تجزیه واریانس، بیانگر معنی‌دار بودن اثر نوع و غلظت تنظیم‌کننده‌های رشد، AgNO₃، اثرات متقابل لاین و نوع تنظیم‌کننده رشد، لاین و غلظت تنظیم‌کننده رشد، نوع و غلظت تنظیم‌کننده رشد در سطح 1 درصد بود. آثار متقابل غلظت تنظیم‌کننده رشد و AgNO₃، لاین و نوع تنظیم‌کننده رشد و AgNO₃ در سطح 5 درصد و آثار متقابل لاین و غلظت تنظیم‌کننده رشد و AgNO₃ در سطح 5 درصد معنی‌دار بود. آثار متقابل لاین و AgNO₃، نوع تنظیم‌کننده رشد و AgNO₃، لاین و نوع تنظیم‌کننده رشد و AgNO₃، نوع و غلظت تنظیم‌کننده رشد، و آثار متقابل 4 عامل مورد بررسی معنی‌دار نبود. اثر نوع و غلظت تنظیم‌کننده‌های رشد در سطح 1 درصد معنی‌دار است.

باززایی

قابلیت باززایی به موازات جنین‌زایی در کالوس‌ها پیش رفت، اگرچه درصدی از جنین‌ها به باززایی نرسیدند. ترکیب محیط‌کشت باززایی با محیط‌کشت جنین‌زایی تفاوتی نداشت که این از مزایای تحقیق حاضر است. اندام‌های هوایی پس از دو هفته ظاهر شدند. شکل 2 القای باززایی را در کالوس را نشان می‌دهد.

بهترین نتایج در تیمار حاوی 2/0 میلی‌گرم در لیتر TDZ و 10 میلی‌گرم در لیترAgNO₃  بود و در دامنه 18-40 درصد بیشترین و کمترین باززایی به ترتیب در S61 و L105 دیده شد. در جدول‌های 2 و 3 مقایسه میانگین درصد جنین‌زایی همراه با باززایی لاین‌ها به تفکیک در ترکیبات مختلف تنظیم‌کننده با آزمون چند دامنه‌ای دانکن در سطح احتمال 5 درصد آورده شده است. تعداد و درصد ریز نمونه‌های اولیه، کالوس‌های اولیه، کالوس‌های باززا شده از جنین رسیده 5 لاین مورد آزمایش در تیمار 2/0 میلی‌گرم در لیتر TDZ و 10 میلی‌گرم در لیتر AgNO₃ در جدول 1 آورده شده است. نتایج تجزیه واریانس حاکی از معنی‌دار بودن اثر نوع و غلظت تنظیم‌کننده‌های رشد، AgNO₃، آثار متقابل لاین و غلظت تنظیم‌کننده رشد، نوع و غلظت تنظیم‌کننده رشد در سطح 1 درصد بود. آثار متقابل غلظت تنظیم‌کننده رشد و AgNO₃، لاین و نوع تنظیم‌کننده رشد، لاین و نوع تنظیم‌کننده رشد و AgNO₃ در سطح 5 درصد و آثار متقابل لاین و غلظت تنظیم‌کننده رشد و AgNO₃، لاین و AgNO₃، نوع تنظیم‌کننده رشد و AgNO₃، لاین و نوع تنظیم‌کننده رشد و AgNO₃، نوع و غلظت تنظیم‌کننده رشد، و آثار متقابل 4 عامل مورد بررسی معنی‌دار نبود.

اثر AgNO₃ (نیترات نقره) بر جنین‌زایی و باززایی

AgNO₃، به عنوان ممانعت‌کننده اثر اتیلن، بر تقسیم و تمایز سلولی مؤثر است. در این بررسی، حضور مؤثر AgNO₃ بر جنین‌زایی و باززایی تأیید شد، اگرچه در بررسی آثار متقابل AgNO₃ با سایر عوامل اختلاف معنی‌دار مشاهده نشد. در جدول‌های 2 و 3 مقایسه عملکرد (تولید کالوس‌های باززا) در تیمارهای مختلف TDZ، BA و AgNO₃ در لاین‌های MO17، L105 و S61 گویای اثر حضور AgNO₃ است.

ریشه‌زایی

فرآیند ریشه‌زایی در تعدادی از ریز نمونه‌ها در طی مراحل جنین‌زایی و باززایی شکل گرفته بود. به منظور تقویت ریشه‌زایی و طی مراحل سازگاری و انتقال به خاک، از محیط رقیق (نصف غلظت معمول محیط MS) استفاده شد (شکل 2).

شکل 1- کالوس‌زایی و جنین‌زایی در کشت بافت جنین رسیده ذرت. الف) مراحل اولیه کشت جنین رسیده ذرت (راست) 48 ساعت پس از کشت (چپ) 20 روز پس از کشت در محیط کالوس‌زایی. ب) کالوس‌های اولیه حاصل از رشد جنین رسیده ذرت که با رشد محور جنینی همراه است (در تیمار حاوی 2/0 میلی‌گرم در لیتر TDZ و 10 میلی‌گرم در لیترAgNO₃).
ج) کالوس غیر جنین‌زا در محیط جنین‌زایی (45 روزه).
د) کالوس جنین‌زا تیپ II در محیط جنین‌زایی (45 روزه) در تیمار حاوی 2/0 میلی‌گرم در لیتر TDZ و 10 میلی‌گرم در لیترAgNO₃).

شکل 2- مراحل باززایی جنین‌های ذرت. الف) باززایی در کالوس‌های حاصل از جنین رسیده در محیط باززایی در تیمار حاوی2/0 میلی‌گرم در لیتر TDZ و 10 میلی‌گرم در لیتر AgNO₃. ب( انتقال کالوس‌های باززا شده ذرت به محیط ریشه‌زایی. ج) انتقال گیاهان باززا شده و ریشه‌دار به گلدان و ظهور اندام‌های گل.

داده‌های جدول‌های 2 و 3 بر اساس طرح آزمایشی کاملاً تصادفی، با فاکتوریل 4 فاکتوری (لاین‌های ذرت، ترکیبات و غلظت‌های تنظیم‌کننده‌ها و نیترات نقره) با سه تکرار، در هر تکرار حدود50 ریز نمونه انجام گرفت. درصد کالوس‌های جنین‌زا و باززا بر اساس درصد تعداد کالوس‌های یاد شده در هر تیمار بر تعداد کالوس‌های اولیه در آن تیمار محاسبه شده است.
انتقال گیاهچه‌ها به خاک

گیاهان باززاشده از ریز نمونه‌ها در محیط‌کشت به خاک استریل انتقال داده شدند و برای سازگاری در زیر پوشش سلوفانی شفاف در اتاقک رشد (فیتوترون) به مدت سه هفته قرار گرفتند. پس از این مدت، پوشش سلفونی برداشته شد و گیاهان به رشد در اتاقک رشد ادامه دادند و اندام‌های گل در آنها شکل گرفت (شکل 2).

جدول 1- تعداد و درصد ریز نمونه‌های اولیه، کالوس‌های اولیه، کالوس‌های جنین‌زا و باززاشده از جنین رسیده 5 لاین ذرت مورد آزمایش در تیمار 2/0 میلی‌گرم در لیتر تیدیازرون و 10 میلی‌گرم در لیتر نیترات نقره.

جدول 2- مقایسه میانگین درصد جنین‌زایی لاین‌های ذرت در ترکیبات مختلف تنظیم‌کننده با آزمون چند دامنه‌ای دانکن در سطح احتمال 5 درصد. رده‌بندی (A-E) مقایسه درصدهای مزبور با آزمون چند دامنه‌ای دانکن در سطح احتمال 5 درصد است.

جدول 3- مقایسه میانگین درصد باززایی لاین‌های ذرت در ترکیبات مختلف تنظیم‌کننده با آزمون چند دامنه‌ای دانکن در سطح احتمال 5 درصد. رده‌بندی (A-E) مقایسه درصدها با آزمون چند دامنه‌ای دانکن در سطح احتمال 5 درصد است.

بحث

در بسیاری از مطالعات کشت بافت و انتقال ژن، از جنین‌های نارس ذرت به عنوان ریز نمونه استفاده شده است (Lu et al., 1982; Quan et al., 2004; Oneto et al., 2010)، اما تهیه جنین نارس در طول سال و آن هم با شرایط نموی مناسب مشکل است. برعکس، جنین‌های رسیده به راحتی و به مقدار زیاد در طول سال در دسترس هستند. با این وجود، جنین‌های رسیده نسبت به جنین‌های نارس سرسختی بیشتری در کشت بافت از خود نشان داده، میزان باززایی در آنها پایین است (Zhao et al, 2008).

تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی نقش بسیار مهمی در تشکیل کالوس دارند و تأثیر آنها بر باززایی گیاهان در کشت کالوس ذرت بررسی شده است (Bhaskaran and Smith, 1990). به طور کلی، محیط القا و تکثیر کالوس نیازمند مقادیر بالای اکسین (مانند 2,4-D) است. معمولاً دامنه غلظت 5/4-6/13 میکرومولار برای تشکیل کالوس‌های جنین‌زا در کشت بافت غلات مناسب است. طبق گزارش‌های قبلی اکسین 2,4-D عاملی تعیین‌کننده برای القای کالوس در جنین‌های نارس ذرت است (Armstrong and Green, 1985; Bohorova et al., 1999). در مطالعه حاضر، غلظت
4 میلی‌گرم در لیتر اکسین 2,4-D به عنوان مقدار ثابت برای همه تیمارها انتخاب شد.

معمولاً کالوس‌های جنین‌زا برای تبدیل به گیاه کامل به محیط‌های عاری از هورمون منتقل می‌شوند (Armstrong and Green, 1985)، یکی از دلایل این است که جنین‌های سوماتیک توانایی تبدیل شدن به گیاه کامل را کسب کرده، سرنوشت آنها قبلاً تعیین شده است. با این وجود، در برخی از مطالعات وجود سیتوکینین برای نمو و تبدیل جنین به گیاه کامل، عامل محرک شناخته شده است (Duncan and Widholm, 1988; Dahleen and Bregitzer, 2002). استفاده از سیتوکینین در ترکیب با اکسین برای شروع جنین‌زایی سوماتیک در کشت کالوس غلات گزارش شده است (Gaspar et al., 1996; Zhao et al., 2008). بنزیل آدنین برای القای شاخه مؤثرتر از کینتین است. Chaudhury و Qu (2000) گزارش دادند که در علف برمودا (Bermuda grass) استفاده از غلظت‌های پایین سینوکینین (044/0 میکرومولار بنزیل آدنین) در محیط القای کالوس حاوی اکسین، تشکیل کالوس‌های جنین‌زا را افرایش می‌دهد. گزارش شده است که افزودن 44/0 میکرومولار بنزین آدنین به محیط‌کشت برای تشکیل کالوس‌های جنین‌زا ضروری است و میزان باززایی در جو را افزایش می‌دهد (Cho et al., 1998). Huang و Wei (2004) گزارش دادند که غلظت‌های پایین بنزیل آدنین (89/0 میکرومولار) در محیط واکشت کالوس که حاوی 2,4-D است، فرکانس تشکیل کالوس‌های جنین‌زا را افزایش می‌دهد. همچنین، مشخص شده است که افزودن 22/2 میکرومولار بنزیل آدنین همراه با 64/4 میکرومولار کینتین نسبت به محیط‌های فاقد هورمون رشد گیاهی برای القای شاخه در ذرت مؤثرتر است (Zhao et al., 2008). تمامی این مطالعات نشان داده‌اند که افزودن سیتوکینین به محیط‌کشت حاوی اکسین (2,4-D) برای تشکیل کالوس جنین‌زا ضروری است.

در مطالعه حاضر، جنین‌زایی کالوس‌ها در محیط‌کشت فاقد تنظیم‌کننده رشد ( BAیا TDZ) بسیار پایین بود، تفاوت چشمگیر میزان القای جنین‌زایی در کالوس‌های اولیه در تیمارهای واجد و فاقد تنظیم‌کننده رشد، تأکیدی بر نقش تعیین کننده تنظیم‌کننده‌های رشد یاد شده در القای جنین‌زایی است. برای تحریک تقسیم سلولی و به دنبال آن جنین‌زایی و باززایی، از سیتوکینین‌هایی مانند BA وTDZ استفاده شد. نتایج حاصل از اثر غلظت‌های مختلف (0، 2/0 و 5/0 میلی‌گرم در لیتر) تنظیم‌کننده رشد BA بر جنین رسیده ذرت نشان داد که بهترین پاسخ کالوس‌زایی و باززایی در همه لاین‌های مورد بررسی در تیمار 2/0 میلی‌گرم در لیتر BA است. این نتایج با گزارش ارایه شده توسط Huang و Wei (2004) مطابقت دارد.

نخستین بار به تیدیازورن (TDZ) به عنوان یک تنظیم‌کننده رشد در کشت بافت و باززایی جنین‌های سوماتیک گیاهان خشبی توجه شد (Huetteman and Preece, 1993; Li et al., 1998). پس از آن، این هورمون به عنوان تحریک کننده رشد کالوس در سیستم‌های کشت بافت گیاهی مطرح شد (Murthy and Murch, 1998). آثار انواع سیتوکنین‌ها مورد استفاده در کشت بافت (بنزیل آدنین، کینتین، زآتین و تیدیازرون) در روند باززایی گیاهانی چون نیشکر (Saccharum spp.) و عدس (Lens culinaris) بررسی و بهترین تیمار تنظیم‌کننده رشد TDZ و BA با غلظت‌های متفاوت بوده است (Chengalrayan and Gallo-Meagher, 2001; Fratini and Ruiz, 2002). اثر TDZ در ذرت (Zea mays L.) تاکنون گزارش نشده است. نتایج این بررسی نشان داد که غلظت 2/0 میلی‌گرم در لیتر TDZ در ترکیب با AgNO₃ بیشترین تأثیر را در میزان باززایی همه لاین‌های مورد مطالعه دارد. کارآیی تیمار TDZ و BA در جنین‌زایی و باززایی تفاوت معنی‌داری داشت. به نظر می‌رسد TDZ می‌تواند جایگزین مناسبی برای بنزیل آدنین باشد.

نیترات نقره از طریق رقابت در ایجاد پیوند با جایگاه اتصال اتیلن از عمل آن جلوگیری می‌کند (Ezura et al., 2000) و بنابراین باعث تحریک تشکیل جنین‌های نوع II و افزایش باززایی می‌شود (Songstad et al., 1991; Caryalho et al., 1997). آثار مثبت AgNO₃ روی ژنوتیپ‌های مختلف ذرت (Vain and Dunl, 1989) و گندم (Fernandez et al., 1999) گزارش شده است.

در این پژوهش، اثر AgNO₃ بر باززایی بررسی شد. اگرچه نتایج حاصل از به کارگیری دو تیمار فاقد و حاوی 10 میلی‌گرم در لیتر AgNO₃ در تقابل اثر دیگر عوامل مورد بررسی از نظر آماری معنی‌دار نبود (البته اثر غلظت تنظیم‌کننده‌های رشد و AgNO₃ در جنین‌زایی و باززایی در سطح 5 درصد و اثر لاین‌های مختلف و غلظت تنظیم‌کننده‌های رشد و AgNO₃ در جنین‌زایی در سطح 5 درصد معنی‌دار بودند)، به طورکلی حضور AgNO₃ در باززایی اثر مثبت داشت. این نتایج با نتیجه دیگران نیز مطابقت دارد (Caryalho et al., 1997; Huang and wei, 2004). به نظر می‌رسد شکل مصرف AgNO₃ در حصول نتیجه مؤثر است و کاربرد AgNO₃ به این صورت (ترکیب فعال یونی) اثرات نامناسبی در محیط‌کشت و به دنبال آن ریز نمونه دارد و احتمالاً همین امر، سبب بروز چنین نتیجه‌ای در آثار متقابل عوامل با عامل AgNO₃ شده است. به عبارت دیگر، نتیجه AgNO₃ در طی آزمایش حاضر به صورت برآیندی از آثار مثبت و منفی نمود یافته است (Santana-Buzzy et al., 2006).

همان گونه که ذکر شد، فرآیند انتقال ژن به منظور افزایش کمیّت و کیفیت محصول، نیازمند فراهم آوردن امکان باززایی گیاه با بازده بالا از طریق کشت بافت گیاهی است. در بین ریز نمونه‌هایی که به منظور کشت بافت ذرت به کار رفته‌اند، باززایی حاصل از
کشت بافت جنین نارس ذرت از پتانسیل بالاتری برخوردار است. بیشتر موفقیّت‌ها در انتقال ژن ذرت در دنیا با استفاده از کشت بافت این ریز نمونه محقق شده است (Jimenez and Bangerth, 2001).

به منظور یافتن جایگزینی برای ریز نمونه جنین نارس برای حذف محدودیت زمانی قابل در دسترس بودن ریز نمونه و کاهش دوره عملیات انتقال ژن، تولید گیاهان تراریخته ذرت از طریق باززایی اندام‌های انتهایی با روش تفنگ ژنی گزارش شده است (Wang, 1987؛ Zhang and Lamaux, 2002؛ O’Connor-Sanchez et al., 2002؛ (Huang and Wei, 2004.

در این تحقیق، با به کارگیری تیدیازورن، میزان باززایی لاین‌ها به 26-40 درصد در تیمار حاوی 2/0 میلی‌گرم در لیتر TDZ و 10 میلی‌گرم در لیتر AgNO₃ رسید. به کارگیری TDZ تاکنون به منظور باززایی در ذرت گزارش نشده بود. پاسخ قابل توجه همه لاین‌ها به باززایی از درجه اهمیّت بالایی برخوردار است. اگرچه میزان باززایی در جنین رسیده نسبت به اندام انتهایی و مریستم انتهایی بسیار پایین است، اما حُسن کاربرد جنین رسیده به اندام انتهایی، کوتاهی فرآیند باززایی است و به این علت تلاش برای افزایش میزان باززایی جنین رسیده ادامه دارد. ازآنجا که طول دوره جنین‌زایی و باززایی در جنین رسیده ذرت نسبت به جنین نارس و مریستم انتهایی کوتاه‌تر است، در نتیجه از میزان تنوع سوماتیک کمتری (به عنوان یک ضعف در به کارگیری کالوس‌ها برای انتقال ژن) برخوردار است و این به عنوان مزیت به کارگیری جنین رسیده در تولید ارقام تراریخته تلقی می‌شود (Bajaj, 1990). از آنجا که اساس تولید گیاهان تراریخته بر مبنای انتخاب ژنوتیپ‌های ارجح و انتقال ژن به آنهاست، بروز تنوع سوماتیک به معنای به وجود آمدن جهش‌های نامطلوب و کاهش ارزش ژنتیکی انتخاب ارجح اولیه است. از این رو، با کاهش طول دوره تبدیل کالوس به گیاه از میزان تنوع سوماتیک تا حد امکان کاسته می‌شود، در نتیجه، به کارگیری جنین رسیده به عنوان ریز نمونه اولیه از اهمیّت بالایی برخوردار است. حصول نتیجه حاضر به علاوه از این نظر که در طی مراحل کالوس‌زایی، جنین‌زایی و باززایی از یک محیط پایه (N₆) استفاده شده و تنوع در به کارگیری محیط‌کشت وجود ندارد، از نظر کاربردی حایز اهمیّت است. علاوه بر این، پاسخ‌دهی همه ژنوتیپ‌های مورد آزمایش به عوامل مورد بررسی در طی باززایی نیز در خور توجه است (Songstad et al., 1991; Shou et al., 2004).