بررسی کمّی و کیفی ترکیبات فنلی در پوست سیب، رقم گالا

میوه سیب منبع غنی از ترکیبات فنلی است. ترکیبات فنلی از مهمترین متابولیت‌های ثانویه در گیاهان هستند که بیوسنتز آنها در پوست میوه سیب و سایر بافت‌های گیاهی، از طریق دو مسیر شیکمیک اسید و استات- موالونات تحت تأثیر مرحله نموی گیاه و فاکتورهای بیرونی انجام می‌گیرد (Santiago et al., 2000; Takos et al., 2006). ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی اغلب در پوست میوه سیب تجمع یافته، و عمده‌ترین آنها اسید‌های فنلی، فلاونول‌ها، کوئرستین گلیکوزید، دی هیدرو چالکون‌ها، فلاونول و آنتوسیانین هستند (Awad et al., 2001b; Takos et al., 2006) ترکیبات فنلی در گیاهان دارای فعالیت‌های متعددی، از قبیل تنظیم فعالیت‌های نموی و واکنش‌های دفاعی گیاهان در مقابل عوامل زنده و غیر زنده هستند (Khanizadeh et al., 2007; Santiago et al., 2000; Pothavorn, 2008).
روش‌های متعددی برای مطالعه ترکیبات فنلی در گیاهان وجود دارد که عمده‌‌‌ترین آنها آنالیز کمّی و کیفی ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی با استفاده از روش‌های جداسازی و تعیین ساختار، از قبیل کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا، طیف سنجی جرمی، طیف سنج رزونانس مغناطیس هسته‌ای (NMR) و کروماتوگرافی لایه‌نازک هستند. بعلاوه، برای آشکارسازی و مکان‌یابی معمولاً از روش‌های متعارف میکروسکوپی (‌میکروسکوپ‌ نوری، الکترونی، فلورسنس و کونفوکال) استفاده می‌شود (Bae et al., 2006; Rudall and Gaddick, 1994).
Rudall و Gaddick (1994) بیان نمودند که ساده‌ترین و مؤثرترین تکنیک مطالعه حضور اسیدهای فنلی (مشتقات فرولیک اسید) در دیواره‌های سلولی گیاهان تک لپه، استفاده از میکروسکوپ فلورسنس ماوراء‌بنفش است. مطالعات HPLC انجام شده روی ترکیبات فنلی گوشت و پوست ارقام مختلف سیب توسط Khanizadeh و همکاران (2007) نشان‌دهندة وجود تفاوت‌هایی در میزان تجمع ترکیبات پُلی‌فنلی در بخش‌های مختلف میوه بود. بر اساس این بررسی، بیشترین تجمع ترکیبات فنلی (روتین، فلاونول گلیکوزید، فلاونول) در پوست میوه وجود داشت. با توجه به اینکه شناسایی ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی در طی فصل رشد به کمک روش‌های کروماتوگرافی مشکل است، لذا در تحقیق حاضر سعی شده است با استفاده از فنون میکروسکوپی (فلورسنس و نوربازتابشی) و کروماتوگرافی (HPLC) روند تغییرات ترکیبات فنلی در پوست میوه سیب مورد بررسی قرار گیرد. انتظار می‌رود که با آگاهی از روند تغییرات ترکیبات فوق بتوان ویژگی‌های کیفی میوه را در مقیاس عملی با اعمال روش‌های مدیریتی صحیح به‌زراعی و مدیریت باغ افزایش داد.

مواد و روش‌ها
مواد گیاهی: میوه سیب، رقم گالا از درختان پیوندی روی پایه مالینگ مرتون 106 موجود در شهرستان بستان‌آباد واقع در آذربایجان شرقی تهیه شد. نمونه‌گیری برای مطالعات مورد نظر از سه مرحله اصلی رشد میوه، شامل: 1- مرحله فندقی؛ 2- مرحله میانی نمو میوه (80 روز بعد از تمام-گل) و 3- مرحله برداشت تجاری میوه انجام شد. نمونه‌گیری به صورت تصادفی از چهار جهت درخت انجام شد. نمونه‌ها بعد از جمع‌آوری بلافاصله به آزمایشگاه منتقل شدند و گرد و غبار موجود در سطح میوه به کمک آب مقطر شسته و سپس پوست میوه‌ها با حوله تمیز خشک شد. پوست میوه‌ها با چاقوی تیز به صورت خیلی نازک جدا و خشک شد. نمونه‌های خشک شده بعد از آسیاب کردن برای مطالعه فیتوشمیایی استفاده شدند.
استخراج ترکیبات پُلی‌فنلی و فلاونوئیدی: به منظور استخراج ترکیبات فلاونوئیدی (آنتوسیانین و فلاونول) و اسیدهای فنلی روی یک گرم از پوست میوه خشک شده، ده میلی‌لیتر حلال هگزان افزوده شده و به مدت بیست دقیقه در حمام فراصوت (Ultra Sonic Bath, Power Sonic, 505, Korea) در دمای آزمایشگاه عصاره‌گیری شد. سپس عصاره هگزانی به وسیله تبخیر در خلأ (Heidolph, Germany) خشک شد. روی عصاره خشک شده مرحله قبلی 100 میلی‌لیتر مخلوط متانول: آب (1:1) افزوده شد و سپس به مدت 20 دقیقه در حمام فراصوت قرار گرفت. عصاره‌های حاصل صاف شده، سپس به مدت ده دقیقه در 13000 دور در دقیقه سانتریفوژ (Beckman, J-25 USA) شدند. 20 میکرولیتر از عصاره حاصل برای شناسایی ترکیبات فنلی به وسیله HPLC تجزیه‌ای استفاده قرارگردید.
کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا (HPLC): استخراج و شناسایی ترکیبات فلاونوئیدی و اسید‌های فنلی با استفاده از روش تغییر یافته Lata و همکاران (2009) و Khanizadeh و همکاران (2007) انجام شد. روش مورد استفاده امکان شناسایی ترکیبات ذکر شده را در زمان کوتاه (30 دقیقه) فراهم می‌آورد. جداسازی به وسیله سیستم HPLC تجزیه‌ای (Cecil, English) مجهز به پمپ دوگانه (Cecil, 4100)، حذف‌کننده حباب‌های هوا (Cecil) و آشکارکننده ماوراء‌بنفش (Cecil, 4201 UV/Vis) انجام شد. جداسازی ترکیبات فنلی با استفاده از ستون فاز معکوس (C18) (به طول 250 میلی‌متر و با قطر داخلی 5/4 میلی‌متر با اندازه ذرات 5 میکرومتر) که به وسیله ستون محافظ (C18) )به طول 5 میلی‌متر با قطر داخلی 4 میلی‌متر با اندازه ذرات 5 میکرومتر) محافظت می‌شد، انجام شد. شناسایی ترکیبات فلاونوئیدی و اسید‌های فنلی در طول موج 280 نانومتر انجام شد. برای شناسایی فلاونول‌ها، آنتوسیانین و اسیدهای فنلی از فاز متحرک حاوی 2% استیک اسید در آب (پمپ A) و متانول (پمپ B) استفاده شد. شیب خطی غلظت به کاربرده شده برای حلال متانول حاوی استیک اسید از 10% B شروع شد و سپس در طی 20 دقیقه به 100% رسید. در فاصله زمانی 20 تا 25 دقیقه در این حالت باقی ماند. سپس در طی 2 دقیقه دوباره به حالت اول خود؛ یعنی 10% B رسید، و تا زمان 30 دقیقه در این حالت باقی ماند.
شناسایی و کمّیت‌یابی ترکیبات پُلی‌فنلی و فلاونوئیدی: برای شناسایی ترکیبات فلاونوئیدی (آنتوسیانین و فلاونول) و اسیدهای فنلی از مقایسه زمان بازداری (Retention Time) پیک‌های مربوط به ترکیبات استاندارد با ترکیبات حاصل از عصاره‌ پوست استفاده شد. برای به دست آوردن زمان بازداری ترکیبات فلاونوئیدی و اسیدهای فنلی، ترکیبات استاندارد با غلظت 2/0 میلی‌گرم در یک میلی‌لیتر متانول تهیه گردیدند. سپس برای شناسایی ترکیبات فلاونوئیدی و اسیدهای فنلی عصاره‌ها و حصول به زمان بازداری استانداردها، 20 میکرولیتر از عصاره‌ و استانداردها به طور جداگانه به دستگاه HPLC آنالتیکال تزریق شدند. در مواردی که اندازه پیک استاندارد در مقایسه با پیک‌های مجهول بزرگتر بود، محلول استاندارد 1:5 تا 1:10 رقیق گردید و سپس به دستگاه تزریق شد تا اندازه منحنی‌های مجهول و استاندارد قابل مقایسه باشد. تعیین کمّیت ترکیبات فلاونوئیدی و اسیدهای فنلی با استفاده از روش اندازه‌گیری سطح زیرمنحنی و مقایسه با استانداردهای مربوطه انجام گرفت. زمان‌ بازداری ترکیبات استاندارد مورد استفاده برای کمّیت‌یابی ترکیبات پُلی‌فنلی و فلاونوئیدی به ترتیب زیر بود: پارا- کوماریک اسید ´´23/´13 گالیک اسید ´´51/´6، فرولیک اسید ´´53/´13، کافئیک اسید ´´57/11َ ، ترانس-2- هیدروکسی سینامیک اسید´´27/15َ، اپی‌کتچین 11َ، کتچین´´38/َ9، و سیانیدین-3- گالاکتوزید´´13/11َ.

ترکیبات استاندارد و حلال‌های مورد استفاده: پاراکوماریک اسید، - (-) اپی‌کتچین، سیانیدین-3- گالاکتوزید و گالیک اسید از شرکت Sigma خریداری شدند. کافئیک اسید، فرولیک اسید، ترانس-2- هیدروکسی سینامیک اسید و (+) کتچین از شرکت Sigma Aldrich تهیه شدند. استونیتریل، ان- هگزان و فرمیک اسید از شرکت Merck و متانول از شرکت Caledon خریداری شد.
در این آزمایش، تجزیه واریانس داده‌های حاصل از تیمارها (مراحل نموی میوه) و صفات (ترکیبات) که در دو تکرار (دو بار تزریق) به دست آمده بودند، از طریق تجزیه و تحلیل یک طرفه انجام گردید. مقایسه میانگین‌ها به روش آزمون چند دامنه‌ای دانکن در سطح احتمال 5% صورت گرفت. برای این منظور، از بسته نرم‌افزاری SPSS استفاده شد.

آزمایش‌های میکروسکوپی
آماده‌سازی نمونه‌ها برای مطالعات هیستولوژیک
حذف واکس نمونه‌ها: حذف واکس به منظور مشاهده بهتر نمونه‌ها در زیر میکروسکوپ با استفاده از روش Gniwotta و همکاران (2005) انجام شد. سپس نمونه‌های به اندازه 5/0 × 5/0 سانتی‌متر با استفاده از تیغه تیز از قسمت میانی پوست میوه مطابق روش Bae و همکاران (2006) تهیه شدند.
مشاهده آنتوسیانین‌ها: نمونه‌های تهیه شده به روش ذکر شده در بالادر داخل پتری‌دیش حاوی آب مقطر قرار گرفت. آنتوسیانین با استفاده از روش میکروسکوپ نوربازتابشی مشاهده شد.

مواد رنگ‌آمیزی
رنگ‌آمیزی با دی فنیل بوریک اسید 2- آمونیا اتیل استر (NA) برای مشاهده فلاونول‌ها و اسیدهای فنلی: رنگ‌آمیزی نمونه‌ها مطابق روش Kladnik و همکاران (2004) انجام شد؛ با این تفاوت که در تحقیق انجام شده از نمونه‌های تازه گیاهی به عوض نمونه‌های آبگیری شده استفاده شد.
رنگ‌آمیزی بافت‌ها با کلرید آهن برای مشاهده تانن‌ها: از کلرید آهن برای رنگ‌آمیزی تانن‌ها مطابق روش Rangari (2007) استفاده شد.
میکروسکوپ فلورسنس: برای مکان‌یابی و توزیع آنتوسیانین‌ها و سایر ترکیبات فنلی در پوست میوه سیب از فنون نوین میکروسکپی بر پایه بهبود عمق میدان (Dadpour et al., 2008) بهره‌گیری شد. در این روش می‌توان در کنار بهبود عمق میدان دید میکروسکوپی، کانال‌های چندگانه فلورسنس را در یک تصویر هم‌آوری نمود و از این راه داده‌های کاملی را به دست آورد. در این راستا، پس از انجام رنگ‌آمیزی، نمونه در یک پتری‌دیش پلاستیکی سیاه رنگ که با آب مقطر (به منظور جلوگیری از چروکیدگی) پُر شده بود، جایگیری گردید. از میکروسکوپ فلورسنس اولمپوس BX51 در چهار پرتو برانگیخته 370، 470، 510-550 و 560-610 نانومتر بهره‌گیری شد. برداشت تصویر با دوربین خنک شونده بسیار حساس (توانایی جداسازی 16 میلیون رنگ در نور کم) انجام پذیرفت و در قالب‌بندی TIFF در حالت RGB (12 بیت به ازای هر کانال) ذخیره شد. فرآوری و پردازش تصویرهای برداشت شده با نرم‌افزار ImageJ صورت گرفت.

نتایج
نتایج حاصل از مطالعه HPLC
آنتوسیانین‌ها: نتایج نشان‌دهنده وجود تفاوت‌های کمی در میزان آنتوسیانین در طی فصل رشد در پوست سیب رقم گالا بود. حداکثر تجمع آنتوسیانین‌ها در پوست سیب در مرحله برداشت تجاری میوه مشاهده شد (شکل 1) (P≤0.05). افزایش تدریجی در میزان آنتوسیانین پوست سیب گالا بویژه در مرحله میانی نمو میوه (80 روز بعد از تمام گل) شاید در ارتباط با شرایط آب و هوایی منطقه بستان‌آباد باشد. باتوجه به داده‌های هواشناسی (داده‌ها نشان داده نشده است) مشخص شده است که از مرداد ماه به بعد در منطقه بستان‌آباد متوسط دمایی شبانه 18 درجه سانتی‌گراد و دمای روزانه 24 -30 درجه سانتی‌گراد بود که محدوده دمایی مناسبی برای بیوسنتز آنتوسیانین‌ها است.
فلاونول‌ها یا تانن‌ها: نتایج نشان داد که با نمو میوه بر میزان فلاونول‌ها در پوست میوه افزوده شد، اما درست قبل از رسیدن میوه میزان فلاونول‌ها در پوست میوه کاهش یافت. بیشترین میزان فلاونول‌ها در مرحله میانی نمو میوه مشاهده شد (P≤0.05). در این مرحله فلاونول‌ها (کتچین و اپی‌کتچین) 50 % از کل ترکیبات فنلی را شامل بود. کاهش در میزان فلاونول‌ها در مرحله برداشت تجاری میوه در ارتباط با کاهش شدید در محتوای اپی‌کتچین بود، که میزان آن در مرحله برداشت میوه نسبت به مرحله فندقی تا 3 برابر کاهش نشان داد (شکل 1). میزان کتچین در مرحله میانی نمو میوه بیشتر از مراحل فندقی و برداشت میوه بود (شکل 1). اپی‌کتچین و گالیک اسید (اسید فنلی) از پیش‌سازهای مهم تانن‌های متراکم هستند که تغییر مقدار ترکیبات فوق به نوسان‌هایی در میزان تانن‌های متراکم مربوط است.
اسیدهای فنلی: نتایج نشان‌دهنده وجود تغییراتی در میزان اسیدهای فنلی (P≤0.05) موجود در پوست میوه بود (شکل 2). اسیدهای فنلی در مرحله فندقی میوه 5%، در مرحله میانی نمو میوه 3% و در مرحله برداشت میوه 4% از کل ترکیبات فنلی را شامل می‌شدند. میزان گالیک اسید به ترتیب در مرحله فندقی و میانی نمو میوه 6 و 13% و در مرحله برداشت میوه 2 % از اسیدهای فنلی کل را به خود اختصاص می‌داد. میزان کافئیک اسید در پوست گالا در مرحله برداشت، بیشتر از میزان آن در مرحله فندقی بود و کمترین میزان آن در مرحله میانی رشد مشاهده گردید (شکل 2). ترانس-2- هیدروکسی سینامیک اسید فراوانترین اسید فنلی مشاهده شده در پوست سیب گالا به غیر از مرحله میانی نمو میوه بود (شکل 2) که میزان آن در مرحله فندقی میوه 8/5 % و در مرحله برداشت میوه 37 % از کل اسیدهای فنلی هر مرحله را شامل می‌شد. میزان فرولیک اسید در مرحله میانی رشد میوه بیشتر از مراحل ابتدایی و نهایی نمو میوه بود (شکل 2).


شکل 1- تغییرات آنتوسیانین و فلاونول‌های (کتچین و اپی‌کتچین) موجود در پوست سیب گالا در طی فصل رشد. حروف موجود در ستون‌ها نشان‌دهنده اختلاف معنی‌دار بین مراحل مختلف نموی برای هر ترکیب در سطح احتمال 5% بر مبنای آزمون دانکن است.

شکل 2- تغییرات اسیدهای فنلی موجود در پوست سیب گالا در طی فصل رشد. حروف موجود در ستون‌ها نشان‌دهنده اختلاف معنی‌دار بین مراحل نموی مختلف برای هر ترکیب در سطح احتمال 5% بر مبنای آزمون دانکن است.

نتایج حاصل از مطالعات میکروسکوپی
تصاویر میکروسکوپی نشان‌دهنده افزایش تدریجی میزان آنتوسیانین‌در طی فصل رشد در پوست سیب گالا بود. حداکثر تجمع آنتوسیانین در مرحله برداشت میوه در پوست سیب دیده شد (شکل 3- ستون 1 ردیف 3). در مرحله فندقی (شکل 3- ستون 1 ردیف 1) و میانی نمو میوه (ستون 1 ردیف 2) تجمع آنتوسیانین‌ در داخل سلول مشاهده ‌شد، اما به تدریج با نمو میوه، آنتوسیانین در واکوئل‌های سلول‌های مستقر در خوشه‌های سلولی تمرکز یافت (ستون 1 ردیف 3). تصاویر میکروسکوپی نشان‌دهنده تغییراتی در میزان ترکیبات فلاونوئیدی و اسیدهای فنلی موجود در پوست سیب گالا در طی فصل رشد بود. همان گونه که شکل3 (ستون 2 ردیف 2) نشان می‌دهد، بیشترین تجمع فلاونول‌ها (فلورسنس آبی) در مرحله میانی نمو میوه دیده شد و به طرف مرحله برداشت میوه کاهش جزئی در تجمع فلاونوئیدها مشاهده گردید. در این مرحله از رشد میوه از تجمع اسیدهای فنلی در پوست میوه نسبت به مرحله فندقی نمو میوه کاسته شد (شکل 3- ستون 3 ردیف 2).
مقایسه فلورسنس حاصل از نمونه‌های پوست و استاندارهای ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی رنگ‌آمیزی شده با NA نشان داد که در مرحله فندقی میوه (شکل 3- ستون 2 ردیف 1) فلورسنس نارنجی مایل به صورتی به دلیل حضور آنتوسیانین در پوست میوه بوده و فلورسنس سبز-‌‌ آبی مشاهده شده به دلیل حضور اسیدهای فنلی، مخصوصاً پاراکوماریک اسید، فرولیک اسید، گالیک اسید (از پیش‌ساز‌های تانن)، ترانس - 2 - هیدروکسی سینامیک اسید و کافئیک اسید بود. در اواسط فصل رشد اثری از آنتوسیانین در سلول مشاهده نشد (شکل 3- ستون 2 ردیف 2). در این مرحله بر تجمع فرولیک اسید و گالیک اسید نسبت به مرحله فندقی میوه افزوده شد. بعلاوه، کاهش شدید در تجمع برخی اسیدهای فنلی، از قبیل کافئیک اسید، ترانس -2 - هیدروکسی سینامیک اسید و پاراکوماریک اسید نسبت به مرحله فندقی میوه دیده شده و بیشترین میزان فلورسنس آبی-‌ سبز مشاهده شده در این مرحله به دلیل حضور کتچین (فلاونول‌ها) در سلول بود (ستون 2 ردیف 2). در مرحله برداشت میوه، بر میزان اسیدهای فنلی، مخصوصاً کافئیک اسید ( فلورسنس آبی روشن) و ترانس - 2 - هیدروکسی‌سینامیک اسید (فلورسنس سبز روشن) نسبت به مرحله میانی رشد میوه افزوده شد، اما از تجمع فرولیک اسید، گالیک اسید و پاراکوماریک اسید کاسته شد (شکل 3- ستون 3 ردیف 2). فلورسنس آبی مشاهده شده در مرحله فندقی میوه نشان‌دهنده تجمع تانن‌های قابل هیدرولیز (کتچین، اپی‌کتچین و گالیک اسید) در اطراف دیواره‌های سلولی و داخل سلول بود (شکل 3- ستون 3 ردیف 1). اپی‌کتچین از پیش‌سازهای مهم تانن‌های متراکم در سلول‌های گیاهی است و حداکثر تجمع این ترکیب در سلول‌های گیاهی در مرحله فندقی (فلورسنس آبی مشاهده شده در شکل 3 ستون 3 ردیف 1) و میانی نمو میوه سیب (فلورسنس سبز مشاهده شده در شکل 3 (ستون3 ردیف 2) مشاهده شد و به تدریج با نمو میوه از تجمع تانن‌های قابل هیدرولیز کاسته و بر تجمع تانن‌های متراکم افزوده شد. فلورسنس سبز مشاهده شده در اطراف دیواره‌های سلولی و در داخل سلول، دلیل بر افزایش این مواد در سلول‌های پوست سیب بود (شکل 3- ستون 3 ردیف 2). فلورسنس سبز مشاهده شده در مرحله برداشت میوه نشان‌دهنده کاهش تجمع تانن‌های متراکم (مخصوصاً کاهش شدید در تجمع اپی‌کتچین در پوست میوه نسبت به مرحله فندقی میوه) و استقرار آنها در دیواره‌های سلولی پوست سیب بود (شکل3- ستون 3 ردیف 3).

ستون (3) ستون (2) ستون (1)
رذیف 1 (مرحله فندقی نمو میوه)
ردیف 2 (مرحله میانی نمو میوه)
ردیف 3 (مرحله برداشت میوه)
شکل 3- روند تغییرات ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی در سه مرحله نموی در پوست میوه؛ سیب رقم گالا

ستون 1- روند تغییرات آنتوسیانین در طی فصل رشد: ردیف 1- تجمع آنتوسیانین در سلول‌های منفرد پوست میوه، ردیف 2- افزایش تدریجی در میزان آنتوسیانین نسبت به مرحله اول رشد میوه؛ ردیف 3- افزایش شدید در میزان آنتوسیانین‌ها و استقرار آنها در سلول‌های موجود در خوشه‌های سلولی.
ستون 2- روند تغییرات ترکیبات فلاونوئیدی و اسیدهای فنلی رنگ‌آمیزی شده با NA، ردیف
1- فلورسنس نارنجی مایل به صورتی نشان‌دهنده حضور آنتوسیانین‌ها و فلورسنس سبز- آبی به دلیل حضور اسیدهای فنلی در پوست میوه است؛ ردیف 2- فلورسنس آبی- سبز نشان‌دهنده حضور فلاونول‌ها در پوست میوه؛ ردیف 3- فلورسنس آبی و سبز روشن نشانه حضور اسیدهای فنلی در مرحله برداشت تجاری میوه.
ستون 3- روند تغییرات ترکیبات فلاونولی رنگ‌آمیزی شده با FeCl3، ردیف 1- فلورسنس آبی نشان‌دهنده حضور تانن‌های قابل هیدرولیز در پوست میوه؛ ردیف
2- فلورسنس سبز در اطراف دیواره‌های سلولی پوست میوه به دلیل حضور تانن‌های متراکم در پوست میوه؛ ردیف 3- فلورسنس سبز نشان‌دهنده وجود تانن‌های متراکم در پوست میوه در مرحله برداشت تجاری میوه است.

بحث
آنتوسیانین‌‌ها: نتایج حاصل از آزمایش‌های HPLC و میکروسکوپی نشان‌دهنده وجود روند تدریجی در افزایش میزان آنتوسیانین‌ها در طی فصل رشد در پوست سیب گالا بود. حداکثر تجمع آنتوسیانین در مرحله برداشت میوه در سلول‌های اپیدرمی سیب مشاهده شد که با یافته‌های Lister و همکاران (1994)، Santiago و همکاران (2000) و Alemanno و همکاران (2003) در این خصوص مطابقت دارد. افزایش تدریجی در میزان آنتوسیانین‌های پوست (مخصوصا در مرحله میانی نمو میوه) در طی فصل رشد، شاید در ارتباط با شرایط آب و هوایی منطقه بستان‌آباد باشد. نتایج حاصل از این آزمایش با نتایج حاصل از آزمایش‌های Reay و Lancaster (2001) و Yuri و همکاران (2009) در خصوص اثر اختلاف دمایی در بیوسنتز آنتوسیانین مطابقت دارد. Takos و همکاران (2006) بیان نمودند که دو مرحله در بیوسنتز آنتوسیانین‌ها وجود دارد: 1- در مراحل اولیه نمو میوه (18 تا 48 روز بعد از تمام‌گل)؛ 2- در هنگام رسیدن میوه (134 روز بعد از تمام‌گل). کاهش در میزان آنتوسیانین‌ها در مراحل میانی نمو میوه به دلیل رقیق شدن این ترکیبات بر اثر رشد سریع میوه است، اما در تحقیق حاضر (نتایج حاصل از آزمایش‌های میکروسکوپی و HPLC) کاهش در میزان آنتوسیانین در مرحله میانی نمو میوه دیده نشد که شاید دلیل آن، وجود شرایط محیطی مناسب برای بیوسنتز آنتوسیانین (شب‌های خنک و روز‌های گرم همراه با تابش بالا) در طی اواسط فصل رشد در منطقه مذکور باشد.
فلاونول‌ها یا تانن‌های متراکم: تانن‌های متراکم سیب اکثراً پلیمر پروآنتوسیانیدین‌ها هستند (Takos et al., 2006). در پوست سیب سیس و ترانس فلاوان-3- اول‌ها همان کتچین و اپی‌کتچین‌ها هستند که به عنوان واحد‌های آغازشگر بیوسنتز تانن‌های متراکم عمل می‌کنند (Awad et al., 2001a). بررسی‌های انجام شده توسط Rangari (2007) نشان داد که دو گروه از تانن‌ها با کلریدآهن واکنش نشان می‌دهند: 1- تانن‌های قابل هیدرولیز که محلول در آب هستند و بر اثر رنگ‌آمیزی با کلریدآهن به رنگ آبی دیده شدند؛ 2- تانن‌های متراکم که بر اثر رنگ‌آمیزی با کلرید آهن به رنگ سبز دیده شدند. چنین به نظر می‌رسد که استقرار تانن‌های متراکم در مرحله برداشت میوه سیب گالا به دلیل رسوب این ترکیبات بر اثر ایجاد پیوند با پروتئین‌های موجود در دیواره‌های سلولی باشد که با یافته‌های Takos و همکاران (2006) و Fournand و همکاران (2006) مطابقت دارد. تصاویر میکروسکوپی شکل 3 (ستون 3 ردیف‌های 1 و 2) نشان داد که در مرحله فندقی و میانی نمو میوه، سیب ترکیبات تاننی موجود در داخل سلول فرم مشخصی نداشته، در داخل سیتوپلاسم سلول و اطراف دیواه‌های سلولی پراکنده‌اند. Alemanno و همکاران (2003) در بررسی‌های خود روی گل‌های کاکائو بیان نمودند که ترکیبات تاننی به صورت بی‌شکل و یا کروی در تمام بافت‌های اپیدرمی و پارانشیمی گیاهان مورد مطالعه دیده شدند.
نتایج حاصل از آزمایش‌های (میکروسکوپی و HPLC) انجام شده نشان داد که با نمو میوه بر میزان فلاونول‌ها در پوست میوه افزوده شد، اما درست قبل از رسیدن میوه میزان فلاونول‌ها در پوست میوه کاهش شدیدی نشان داد. نتایج حاصل از آزمایش حاضر با یافته‌های Takos و همکاران (2006) در خصوص کاهش میزان تانن‌های متراکم در سیب رقم Crisp redیافته‌هایLister و همکاران (1994) در سیب رقم Granny Smith مطابقت دارد. کاهش در میزان تانن‌های متراکم به دلیل رقیق شدن این ترکیبات بر اثر رشد میوه و افزایش در میزان آنتوسیانین استFournand et al., 2006; Takos et al., 2006; Hanlin and Downey, 2009).
اسیدهای فنلی: نتایج مطالعات میکروسکوپی و HPLC نشان داد که بیشترین میزان اسیدهای فنلی در مرحله ابتدایی نمو میوه سیب دیده شد و با پیشرفت فصل رشد، از میزان اسیدهای فنلی موجود در پوست میوه کاسته شد. در مرحله برداشت میوه افزایش دوباره در میزان اسیدهای فنلی مشاهده گردید. Awad و همکاران (a2001) بیان نمودند که در سیب ارقام Elstar و Jonagold مقدار اسیدهای فنلی در اوایل فصل بالا بوده و در مرحله رسیدن میوه مقدار ترکیبات فوق ثابت بود. فلورسنس نارنجی مایل به صورتی مشاهده شده در شکل 3 (ستون 2 ردیف 1) به دلیل حضور آنتوسیانین در پوست میوه بود که با فلورسنس مشاهده شده در گیاه جو توسط Hoerner و Weissenbock (2003) مطابقت دارد. فلورسنس سبز - آبی مشاهده شده به دلیل حضور اسیدهای فنلی (پاراکوماریک اسید، فرولیک اسید و کافئیک اسید) بود. چنین به نظر می‌رسد که فرولیک اسید و پاراکوماریک اسید از ترکیبات فنلی متصل به دیواره‌های سلولی بوده، پیش‌ماده بیوسنتز لیگنین باشند (Rudall and Gaddick, 1994; Pothavorn, 2008).
فلورسنس آبی مشاهده شده در نمونه‌های گیاهی Johnsonia lupulina بدون رنگ‌آمیزی (قرار دادن نمونه در آب خالص) و رنگ‌آمیزی شده با هیدروکسیدآمونیوم نشان‌دهنده حضور فرولیک اسید متصل به دیواره‌های سلولی است (Rudall and Gaddick, 1994; Hoerner and Weissenbock, 2003). از طرف دیگر، فلورسنس (آبی - سبز) مشاهده شده در مرحله میانی نمو، میوه احتمالاً به دلیل حضور کتچین (فلاونول) در سلول است که با یافته‌های Wuyts (2006) در مورد ریشه موز مطابقت دارد.

نتیجه‌گیری کلی
در این مطالعه سعی شد تا مکان‌یابی بافتی و الگوی تجمع برخی ترکیبات فنلی در مراحل مختلف نمو میوه سیب گالا با استفاده از روش‌های میکروسکوپی (نوربازتابشی و فلورسنس) و کروماتوگرافی بررسی شود. استفاده از روش‌های میکروسکوپی فوق در تلفیق با روش‌های کروماتوگرافی روشی مطمئن در شناسایی ترکیبات فنلی نسبت به استفاده منفرد از روش‌های کروماتوگرافی بود. برای مطالعه موفقیت‌آمیز ترکیبات فنلی گیاهان ابتدا باید مکان قرارگیری آنها در بافت‌های گیاهی بررسی گردد که دست‌یابی به این مهم بااستفاده از روش‌های میکروسکوپی مقدور است. روش‌های میکروسکوپی در تعیین کمّیت ترکیبات فنلی موجود در گیاهان ناتوانند و لذا برای رفع این مشکل باید از روش‌های کروماتوگرافی توام با روش‌های میکروسکوپی بهره جست. از آنجایی که ترکیبات فنلی نقش مهمی در ویژگی‌های چشایی (رنگ، طعم و مزه) میوه‌های تازه برداشت شده دارند و بیوسنتز این ترکیبات، مخصوصاً آنتوسیانین ‌در مرحله برداشت میوه از دیدگاه تجاری در سیب حایز اهمیت است، لذا شناخت دقیق این ترکیبات و مکان‌یابی آنها در طی فصل رشد به مدیریت دقیق باغ‌ها کمک خواهد کرد تا با ایجاد تغییراتی در مدیریت باغ (هرس، آبیاری، کود دهی، کیسه‌گذاری میوه‌ها، استفاده از پایه‌های مناسب، استفاده از پوشش‌های انعکاسی نور و ...) بتوان بیوسنتز این ترکیبات را در میوه‌ها افزایش داد.

سپاسگزاری
از آقای نامور به دلیل همکاری در تهیه نمونه‌های مورد نیاز، از خانم دکتر اثنی‌عشری و خانم دکتر بامداد به جهت همکاری در آنالیز نمونه‌ها، و از آقای دکتر مطلبی آذر که تجزیه آماری این آزمایش را تقبل نمودند، بی نهایت تشکر می‌گردد. از معاونت پژوهشی دانشگاه تبریز به دلیل تأمین بخشی از هزینه‌های آزمایش حاضر کمال تشکر به عمل می-آید