بررسی تغییرات پروتئینی در برگ گیاه Lycopersicon esculentum cv. Isfahani تحت تنش شوری با استفاده از تکنیک الکتروفورز دو بعدی

سازگاری گیاهان نسبت به تنش‌های محیطی به وسیله شبکه‌های مولکولی آبشاری کنترل می‌شود. این مکانیسم‌های پاسخ‌دهنده نسبت به تنش، برای برقراری مجدد هومئوستازی و حفاظت و ترمیم پروتئین‌ها و غشاهای آسیب دیده فعال می‌شوند (Wang et al., 2003). در مقایسه با مقاومت گیاهان نسبت به تنش‌های زیستی که اغلب عوامل تک ژنی هستند، پاسخ‌های پیچیده ژنتیکی نسبت به تنش‌های غیر زیستی چند ژنی هستند، بنابراین، برای کنترل و مهندسی مشکل‌تر هستند. راهکارهای مهندسی گیاهان برای مقاومت نسبت به تنش‌های غیر زیستی بر بیان ژن‌هایی که در مسیر‌های سیگنالی و تنظیمی درگیرند، یا ژن‌هایی که پروتئین‌های مقاومت نسبت به تنش را کد می‌کنند، یا آنزیم‌های موجود در مسیر‌هایی که به سنتز متابولیت‌های ساختاری و عملکردی منجر می‌شوند، تکیه دارند (Vinocur and Altman, 2005).

در طی شناسایی پروتئین‌های مرتبط با تنش شوری در گیاه توتون ، یک پروتئین 26 کیلو دالتونی به نام اسموتین شناسایی گردیده است (Singh et al., 1987). در گیاه جو، دو پلی پپتید 26 کیلو دالتونی به نام جرمین شناسایی شده است که این دو پروتئین در پاسخ نسبت به تنش شوری افزایش یافتند.

Lopez و همکاران در سال 1994 نیز یک پروتئین 22 کیلو دالتونی را در پاسخ نسبت به تنش شوری در گیاه تربچه پیدا نمودند. در گیاه Eleusine coracona ، Uma و همکاران در سال 1995 پروتئین‌های 23، 24 و 54 کیلو دالتونی را در تنش شوری و خشکی مشاهده نمودند. همچنین Yamada و همکاران در سال 2002 طی تحقیقاتی در مورد بررسی مکانیسم‌های مقاومت نسبت به تنش شوری در یک گیاه مانگرو به نام Bruguiera sexangula، پروتئین مخصوصی به نام آلن اکسید سیکلاز (AOS) را پیدا کردند که در ارتباط با افزایش مقاومت گیاهان نسبت به تنش شوری بود. آنها این پروتئین را مانگرین نامیدند. به طور مشابه، بیان پروتئین مانگرین در لاین‌های سلولی ساکارومیسس سرویزیه و گیاه توتون نیز مقاومت نسبت به تنش شوری در این گونه‌ها را افزایش می‌دهد.

همچنین در ارتباط با نقش آنتی اکسیدان‌های مختلف در مقاومت نسبت به شوری گیاه گوجه‌فرنگی، Mittova و همکاران در سال 2002 دریافتند که گوجه‌فرنگی‌های با مقاومت بیشتر نسبت به شوری مثلL. pennellii در مقایسه با گونه زراعی گوجه‌فرنگی افزایش بیشتری در آنزیم‌هایی مثل SOD (سوپر اکسید دیسموتاز) و APX (آسکوربات پراکسیداز) داشتند. مکانیسم مقاومت نسبت به شوری در گیاه وقتی که پاسخ گیاه، نسبت به تغییر غلظت نمک محیط‌کشت و شرایط محیطی که گیاه در آن رشد کرده است تغییرکند، پیچیده‌تر می‌گردد.

پروتئومیکس شامل مطالعه تغییرات ساختمانی و فراوانی پروتئین‌ها در پاسخ نسبت به حالات نموی و تنش‌های محیطی است. بنابراین، می‌توان در مورد پروتئومیکس تنش شوری یا تنش خشکی با انتظار فهم این موضوع که چگونه سلول‌ها و موجودات زنده نسبت به این تنش‌ها در سطح پروتئین پاسخ می‌دهند، صحبت نمود. با استفاده از این روش می‌توان هزاران پروتئین متفاوت را جداسازی و اطلاعاتی مثل نقطه ایزوالکتریک پروتئین، وزن مولکولی و مقدار هر پروتئین را تعیین نمود. این تکنیک تنها روش توانمندی است که قادر به شناسایی و تعیین تغییرات پس از ترجمه ژنوم است همچنین ابزار مناسبی برای مطالعه بیان ژن‌های پاسخ‌دهنده نسبت به تنش‌ها است (Zivy and de (Vienne, 2000.

بررسی‌های پروتئومیکس در ریشه گیاه برنج نشان داد که تنش شوری موجب تغییراتی کیفی در پروتئین‌ها می‌گردد. از جمله این تغییرات، تغییر در یک پروتئین 22 کیلو دالتونی بود که تحت تنش شوری افزایش بیان پیدا نمود. این پروتئین از پروتئین‌های پاسخ‌دهنده نسبت به تنش است، یا در طی رسیدن میوه سنتز می‌شوند. پروتئین دیگری که با آسکوربات پراکسیداز همولوژی دارد نیز تحت تنش در ریشه برنج افزایش بیان پیدا نمود. این پروتئین، تبدیل H₂O₂ به آب و اکسیژن را راه‌اندازی می‌کند و موجب حفاظت سلول‌ها در مقابل گونه اکسیژن فعال (Reactive Oxygen Species) می‌گردد. احتمالاً گونه‌های مقاوم نسبت به تنش شوری، با توانایی تجمع بیشترآنزیم‌های آنتی‌اکسیدانت عمل می‌نمایند. در تخمک‌های کتان کشت‌شده در شرایط کشت در شیشه، مقاومت نسبت به تنش شوری با میزان بالاتر سطح آسکوربات پراکسیداز و گلوتاتیون ردوکتاز همراه است و ظرفیت افزایش سوپر اکسید دیسموتاز بیشتر می‌شود. بیان بیش از حد ژن آسکوربات پراکسیداز پراکسیزومی‌گیاه آرابیدوپسیس در گیاه تنباکو حفاظت علیه تنش اکسیداتیو را در این گیاه افزایش می‌دهد (Rajguru et al., 1999).

آنزیم دیگری که در اثر تنش شوری در ریشه گیاه برنج تغییر می‌نماید Caffeoyl-Coa O Methyltransferase است که نقشی اساسی در سنتز واحد‌های لیگنین guaiacyl مثل حمایت از گوهر مایه‌ها برای سنتز واحد‌های syringyl لیگنین دارد که در تنش شوری در ریشه رقم مقاوم نسبت به تنش شوری برنج افزایش بیان یافته است. احتمالاً تغییرات در چوبی شدن، در حفاظت گیاهان در برابر تنش‌های غیرزیستی مهم است (Ye et al., 2001).

در این تحقیق، تغییرات الگوی الکتروفورزی برگ گیاه گوجه‌فرنگی رقم اصفهانی به منظور بررسی تغییرات پروتئینی برگ این گیاه تحت تنش شوری با استفاده از روش SDS PAGE والکتروفورز دوبعدی 2DE بررسی گردیده است.

مواد و روش‌ها

استخراج پروتئین‌های محلول برای انجام الکتروفورز

برای استخراج پروتئین‌های محلول، قطعات برگ گیاهان گوجه‌فرنگی که به مدت 29 روز در محیط‌کشت‌های بدون نمک NaCl و محیط‌کشت‌های دارای 40، 80، 120 و 160 میلی‌مولار نمک NaCl رشد کرده بودند به طور جداگانه با کمک ازت مایع کاملاً به صورت پودر در آمدند. سپس بافت نرم شده به لوله‌های سانتریفیوژ منتقل و به نسبت 1 گرم بافت به 3 سی‌سی بافر استخراج (Tris- HCl, 50 mM; PMSF, 1mM; EDTA, 2mM; Mercaptoethanol, 1mM; pH (7.2 به لوله‌ها افزوده گردید. سپس لوله‌های حاوی محلول به مدت 4-3 ساعت در دمای ˚^C 4 روی شیکر با دور rpm 50 قرار داده شد و پس از آن به مدت 25 دقیقه در rpm 14000 و˚^C 4 سانتریفیوژ گردید. پس از آن روشناور مربوطه جمع‌آوری و به وسیله استون سرد (1حجم نمونه به 3 حجم استون) رسوب داده شد دو در دمای˚^C 20- فریزر به مدت 20 دقیقه نگهداری شد و پس از آن مجدداً به مدت 15 دقیقه با rpm14000 در˚^C 4 سانتریفیوژ گردید. در این مرحله روشناور به آرامی خالی گردید و رسوب حاصله در دمای اتاق کاملاً خشک شد و پس از آن به این رسوب مقدار کمی از بافر استخراج (حدوداً 300 میکرو‌لیتر) افزوده شده، با دقت رسوب موجود حل گردید و مجدداً به مدت 5 دقیقه با rpm14000 در˚^C 4 سانتریفیوژ گردید. از این روشناور برای بررسی تغییرات پروتئین‌ها به روش SDS-PAGE استفاده شد (Kim et al., 2001).

تهیه ژل، آماده‌سازی عصاره‌های پروتئینی و انجام الکتروفورز

در این تحقیق از ژل جدا کننده 12 درصد و ژل توده کننده 5 درصد استفاده گردید. برای آماده‌‌سازی عصاره‌های پروتئینی، به 12 میکرو لیتر از هر یک از عصاره‌های پروتئینی 3 میکرولیتر از بافر نمونه

(Tris-HCl, 1M; Glycerol, 25%, SDS 10%; Bromophenol blue, 1%; 2 mercaptoethanol, (0.5 ml; pH 6.8 افزوده گردید و عصاره‌ها به مدت 10 دقیقه در بن ماری با درجه حرارت˚^C100 حرارت داده شد. سپس نمونه‌ها در چاهک‌ها تزریق گردید. در مدت زمان انجام الکتروفورز ولتاژ دستگاه در ساعت اول روی 50 ولت و در ساعت دوم به بعد روی 100 ولت تنظیم گردید (Hames and Rickwood, 1990).

تثبیت پروتئین‌ها، رنگ‌آمیزی و رنگ‌بری از ژل

ابتدا ژل به مدت 30 دقیقه در محلول تثبیت کننده (30 درصد متانول، 7 درصد اسید استیک) قرار داده شد. سپس ژل به مدت 20 دقیقه در محلول رنگ (40 درصد متانول، 10 درصد اسید استیک گلاسیال و04/0 گرم کوماسی بریلیانت بلو) قرار داده شد تا زمینه ژل به طور کامل رنگ گرفت. برای رنگبری از ژل از محلول رنگ بر (15 درصد متانول و 10 درصد اسید استیک گلاسیال) به مدت یک ساعت بر روی شیکر استفاده گردید (Reed et al, 1998). سپس برای حفظ نتایج با کمک جعبه روشن و دوربین دیجیتال از ژل‌ها عکس گرفته شد.

الکتروفورز پروتئین‌ها به روش الکتروفورز دو بعدی

برای بررسی تغییر نوع پروتئین‌ها یا افزایش و کاهش بیان آنها از الکتروفورز دو بعدی استفاده گردید. این آنالیز بر روی برگ گیاهان گوجه‌فرنگی رقم اصفهانی رشد کرده در 0، 80 و 160 میلی‌مولار نمک NaCl استفاده گردید. این آزمایش در 5-3 تکرار در هر غلظت نمک انجام گرفت.

استخراج پروتئین برای الکتروفورز دو بعدی

استخراج پروتئین برای انجام الکتروفورز دو بعدی با روش Tsugita and Kamo (1999) انجام گرفت؛ به این صورت که ابتدا برگ‌های جوان گیاهانی که یک ماه از تاریخ کشت بذر آنها می‌گذشت (3-1 از رأس) با کمک ازت مایع کاملا به صورت پودر در آمدند، سپس در محلول استون سرد دارای (w/v)10% تری‌کلرواستیک اسید (TCA) و  (w/v)07/0 بتا مرکاپتواتانول در˚^C 80- به مدت 6 ساعت انکوبه شدند. سپس به مدت 30 دقیقه با اولترا سانتریفیوژ با دور  rpm 30000 در˚^C 4 سانتریفیوژ گردید و پس از دور ریختن روشناور، رسوب حاصله در محلول 07/0 درصد بتا مرکاپتو اتانول در استون دارای mM PMSF  1 و mM EDTA 2 حل شد و به مدت یک ساعت در فریزر˚^C20- انکوبه گردید و پس از آن به مدت 30 دقیقه با rpm 30000 و در دمای˚^C 4 سانتریفیوژ گردید. این عمل حدود 5-4 بار؛ یعنی تا زمانی که روشناور کاملا شفاف و بی‌رنگ گردید، تکرار شد و پس از آن پس از خالی کردن کامل روشناور رسوب حاصله در دمای اتاق لیوفیلیز گردید. سپس 5 میلی‌گرم از پودر لیوفیلیزه شده در 2/0 میلی‌لیتر محلول 9/9 مولار اوره، 2 مولار Thurea،CHAPS (Zwitterionic detergent)  4%،  mM DTT (Dithiothreitol)100 ، دو درصد آمفولین با محدوده pH 4 تا 7 به صورت سوسپانسیون درآمد و در دمای اتاق به مدت یک ساعت انکوبه گردید و پس از آن با rpm 30000 در˚^C20 به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ گردید. سپس روشناور حاصله برای سنجش کمی پروتئین‌ها به روش برادفورد  Bradford (1978) و سنجش کیفی به روش الکتروفورز دو بعدی استفاده گردید.

انجام الکتروفورزدوبعدی

مرحله اول الکتروفورز Iso Electro Focusing(IEF)

300 میکروگرم پروتئین از هر نمونه با مقدار لازم از Rehydration buffer مخلوط شد و به مدت 10 دقیقه در دستگاه سونیکاتور با دمای˚^C 25 قرار داده شد تا موجب حلالیت بهتر پروتئین‌ها گردد. سپس نوار‌های مخصوص IEF  (IPG)را در جای مخصوص قرار داده شد و مواد آماده شده در سراسر نوار پخش گردید. سپس روی هر نوار با 3 میلی‌لیتر Mineral oil پوشانده شد و نوار‌ها به ترتیب در دستگاه مخصوص Run کردن ژل‌هاIPGphor instrument (Amersham Pharmacia Biotech, (UK چیده شدند و پس ازآن به دستگاه به صورت زیر برنامه داده شد:

1- Rehydration          7 h

2- Step-n-hold           30V/5h

3- Step-n-hold           200V/30 min

4- Gradiant                500V/1 min

5- Gradiant                8000V/45 min

6- Step-n-hold           8000V/9h

7- Step-n-hold           8000V/8h

پس از اتمام Run شدن ژل‌ها، بعد دوم الکتروفورز، انجام گردید.

بعد دوم الکتروفورز SDS- PAGE

برای انجام بعد دوم الکتروفورز پروتئین‌ها از ژل اکریلامید 30% استفاده گردید و طبق برنامه زیر عمل Running انجام گرفت:

Running program

Step 1                      5 W/1 plate/ 1 h

Step 2                      10 W/1 plate/ 2 h

Step 3                      120 W/ ∞

تا زمان Run شدن کامل ژل‌ها دما در˚^C 20 تنظیم گردید (Laemmli, 1970). رنگ‌آمیزی ژل‌ها نیز به روش نیترات نقره انجام گرفت (Lee et al., 2007).

نتایج

الکتروفورز (SDS-PAGE) پروتئین‌ها

برای بررسی تغییرات الگوی پروتئین‌های محلول از غلظت‌های 0، 40، 80، 120 و 180 میلی‌مولار نمک NaCl استفاده گردید و پروتئین‌های گیاهان کنترل و تحت تنش شوری همزمان در 3 جداکشت برگ، ساقه و ریشه گیاهان به طور همزمان بررسی گردید. در هر 3 جداکشت، الگوی پروتئین‌های گیاهان تحت تنش با گیاهان کنترل تفاوت داشت. برای مثال، در جداکشت برگ با افزایش غلظت نمک در محیط‌کشت بیان پروتئین‌های حدود 40، 91 و 110 کیلو دالتون کاهش یافت، در حالی که در جداکشت ساقه بیان پروتئین‌های حدود 20، 26 و 50 کیلو دالتون افزایش پیدا نمود. در ریشه نیز بیان دو پروتئین با وزن مولکولی حدود 30 و 75 کیلو دالتون افزایش یافت (شکل 1).

نتایج حاصل از الکتروفورز دو بعدی (2-DE) پروتئین‌ها

برای بررسی دقیق‌تر تغییرات پروتئینی برگ گیاهان تحت تنش غلظت‌های 80 و 160 میلی‌مولار نمک NaCl از الکتروفورز دو بعدی استفاده گردید. به منظور مجزا نمودن پاسخ گیاهان نسبت به تنش شوری از تغییرات نموی گیاهان در تجمع پروتئین‌ها و به حداقل رساندن خطای آزمایش، برگ‌های گیاهان کنترل و تیمار شده در یک زمان برداشت شده و آزمایش گردیدند. در آزمایش‌های الکتروفورز دو بعدی، اختلافاتی در شدت نقاط پروتئینی بین گیاهان کنترل و تحت تنش شوری مشاهده گردید. از بین بیش از 200 لکه پروتئینی بررسی شده، 18 لکه به وسیله تنش تغییر نمودند. این لکه‌های تغییر یافته در اثر تنش در سه گروه جای گرفتند: 1- لکه‌های پروتئینی که بیان آنها در گیاهان تحت تنش شوری افزایش یافته بود؛ 2- لکه‌های پروتئینی که در گیاهان تحت تنش شوری به وجود آمده بودند و 3- لکه‌های پروتئینی که در گیاهان تحت تنش شوری بیان آن‌ها کاهش یافته یا ناپدید شده بودند (شکل 3).

شکل 1- الگوی الکتروفورزی پروتئین‌های برگ (A)، ساقه  (B)و ریشه (C) رقم اصفهانی گیاه گوجه‌فرنگی در غلظت‌های مختلف NaCl.(mM) (در 160 میلی‌مولار نمک ریشه تولید نشد).M  پروتئین مارکر

شکل 3- جزئیات تغییرات پروتئینی برگ گوجه‌فرنگی رقم اصفهانی گیاهان در غلظت‌های صفر، 80 و 160 میلی‌مولار نمک NaCl به دست آمده از الکتروفورز دو بعدی (2-DE): A) لکه‌های پروتئینی که بیان آنها در گیاهان تحت تنش شوری افزایش یافته است.؛ B) لکه‌های پروتئینی که در گیاهان تحت تنش شوری پدیدار شده‌اند.؛ C) لکه‌های پروتئینی که بیان آنها در گیاهان تحت تنش شوری کاهش یافته و یا ناپدید گشته‌اند.

لکه‌های پروتئینی با شماره‌های 1، 2، 6، 7، 8، 11، 16 و 18 در گروه 1، لکه‌های پروتئینی با شماره‌های 3، 4، 5، 13، 14، 15 و 17 در گروه 2 و لکه‌های پروتئینی 9، 10 و 12 در گروه 3 جای گرفتند. نقاط ایزوالکتریک و وزن مولکولی هر لکه پروتئینی نیز تعیین گردید (شکل 2 و جدول 1). احتمالاً بسیاری از این پروتئین‌ها به طور اختصاصی در ارتباط با تنش شوری هستند که اثبات دقیق این موضوع نیازمند بررسی‌های بیشتر بعدی است.

شکل 2- تغییرات الگوی پروتئین‌های محلول در الکتروفورز دو بعدی (2-DE) برگ گوجه‌فرنگی رقم اصفهانی در گیاهان کنترل (A)، گیاهان رشد کرده در 80 میلی‌مولار نمک NaCl(B)، و 160 میلی‌مولار (C) به مدت 29 روز. در IEF، 150-100 میکروگرم پروتئین روی نوارهای به طول 24 سانتی متر به طور خطی و با 10-3 pH= لود گردید. SDS-PAGE نیز با استفاده از ژل‌های 5/12 درصد انجام گرفت. نقاط پروتئینی توسط رنگ‌آمیزی نیترات نقره آشکار گردید. نقاط پروتئینی متمایز در ژل‌های مختلف به وسیله فلش مشخص شده است.

جدول 1- نقطه ایزوالکتریک و وزن مولکولی لکه‌های پروتئینی حاصل از الکتروفورز دو بعدی پروتئین‌های برگ گیاه گوجه‌فرنگی که تحت تنش شوری تغییر نموده‌اند.