آیا جمعیت‌های کپورماهی دندان‌دار معمولی در جنوب ایران، امکان تشکیل واحدهای عملکردی تاکسونومیک (Operational Taxonomic Units, OUTs) را دارند؟

مقدمه.

به طور کلی، مطالعه علل تغییرات و تمایزهای ریختی بین جمعیت‌ها در طبیعت امری دشوار است Gilmartin, 1974)؛ (Stillwell et al., 2007. در کنار تأثیر عوامل ژنتیکی در بروز گوناگونی‌های محیطی در موجودات، تغییرات محیطی (در قالب انعطاف‌پذیری‌های ریختی (phenotypic plasticity))، نیز در ایجاد تنوع و گوناگونی‌های طبیعی نقش مهمی را ایفا می‌کنند Svanbäck and Eklöv, 2006)؛ Stillwell et al., 2007). انعطاف‌پذیری ریختی شامل تغییرات فنوتیپی القا شده توسط عوامل محیطی بر افراد یک گونه در طول دوره زندگی آن موجود است (Stearns, 1989). با وجود این، در اغلب موارد گوناگونی‌های ریختی بین جمعیت‌های یک گونه متأثر از هر دو عوامل محیطی و ژنتیکی همزمان است Valen, 1973)؛ (Gholami et al., 2015. یک صفت ریختی (morphological character) زمانی می‌تواند تکامل پیدا کند که حداقل بخشی از آن از طریق ویژگی‌های ژنتیکی کنترل شود (Stearns, 1989).

ماهیان به خاطر سازش‌پذیری‌های متنوعی که برای اشغال نمودن زیستگاه‌های مختلف از خود نشان می‌دهند، گزینه‌های مناسبی برای مطالعه علت‌های تغییرات و تمایزهای ریختی بین جمعیت‌ها و گونه‌ها هستند. از میان گروه‌های مختلف ماهیان، کپورماهیان دندان‌دار (Cyprinodontids) به خاطر اندازه کوچک، نحوه و الگوی پراکنش، دامنه بالای تحمل اکولوژیکی و در نتیجه سازگاری محیطی بالا، به طور گسترده برای مطالعه روندهای تکاملی و تکوینی مطالعه می‌شوند (Ferrito et al., 2007). جنس Aphanius Nardo, 1827 تنها عضو از خانواده کپورماهیان دندان‌دار در نواحی مدیترانه، شمال آفریقا و خلیج فارس است که در زیستگاه‌های ساحلی (آب‌های لب شور) و آب‌های داخلی (به ویژه زیستگاه‌های داخلی ترکیه و ایران) پراکنده شده است (Wildekamp et al., 1999).

تاکنون 14 گونه از جنس Aphaniusاز حوضه‌های ایران توصیف شده‌ است Teimori et al., 2012a)؛ Gholami et al., 2014؛ (Esmaeili et al., 2014. از این تعداد، گونه Aphanius dispar (Rüppell, 1829) پراکنش گسترده‌ای در حوضه‌های جنوبی ایران دارد به طوری که در اغلب زیستگاه‌های طبیعی این حوضه‌ها از جمله رودخانه‌های لب شور و چشمه‌های آب گرم و گوگردی یافت می‌گردد (Teimori et al., 2012a, 2014). در مطالعه‌ای که توسط Teimori و همکاران (c2012) انجام شد، مشخص گردید که گوناگونی فنوتیپی قابل توجهی در بین جمعیت‌های گونه
A. dispar در حوضه جنوبی ایران وجود دارد. نکته مهم در رابطه با گوناگونی‌های مشاهده شده این است که مشخص شود که آیا وجود شکل‌های مختلف فنوتیپی در جمعیت‌های موجود، ناشی از تأثیر عوامل محیطی در زیستگاه‌های جدا افتاده است یا ناشی از واگرایی‌های ژنتیکی احتمالی طولانی مدت؟. به بیان دیگر، آیا جمعیت‌های با فنوتیپ متفاوت، امکان تشکیل واحدهای عملکردی تاکسونومیک (Operational Taxonomic Units, OUTs) را دارند؟ در پژوهش حاضر، با افزودن داده‌های مولکولی ژنوم میتوکندریایی، تحلیل ویژگی‌های فنوتیپی ماهیان و نیز تحلیل ویژگی‌های ریختی سنگریزه شنوایی (اتولیت) تلاش شده است تا این پرسش‌ها مورد مطالعه و بحث قرار گیرند.

مواد و روش‌ها.

.تحلیل‌ ریختی ماهیان و استخراج سنگریزه شنوایی: برای انجام مطالعه حاضر، با استفاده از تور دستی (ساچوک) نمونه‌های ماهیان از حوضه‌های بوشهر (13 ماده و 15 نر)، مکران (27 ماده و 28 نر) و هرمزگان (35 و 36 نر) جمع‌آوری و مطالعه شد (شکل 1). برای جلوگیری از چروکیده شدن، ابتدا نمونه‌ها به مدت 10 دقیقه در الکل 5 درصد و سپس به الکل 96 درصد منتقل شدند. سپس برای مطالعات مورفومتریک، استخراج اتولیت و استخراج DNA به آزمایشگاه انتقال داده شدند. ویژگی‌های ریختی ماهیان (اندازشی و شمارشی) به ترتیب با کولیس (دقت 05/0) اندازه‌گیری و با میکروسکوپ تشریحی شمارش شد. بدین ترتیب، تعداد 7 صفت شمارشی و تعداد 27 صفت اندازشی پس از استانداردسازی (تمام صفات اندازشی نسبت به طول استاندارد، طول سر، فاصله ی جلویی مخرج و طول باله سینه‌ای) بررسی و تحلیل شد.

شکل 1- موقعیت جغرافیایی پراکنش جمعیت‌های مطالعه شده از گونه کپورماهی دندان‌دار معمولی در جنوب ایران. (A حوضه مکران در جنوب‌شرق ایران، (B حوضه هرمزگان و (C حوضه خلیج فارس

به منظور استخراج اتولیت، جمجمه ماهیان شکافته و اتولیت‌های گوش داخلی در سمت راست و چپ سر ماهی با تیغ جراحی ظریف برداشته و در محلول هیدروکسید پتاسیم 1 درصد قرار داده شدند. سپس، اتولیت‌ها با استفاده از آب مقطر شستشو و تمیز شده و برای عکس‌برداری با میکروسکوپ تشریح و نیز با میکروسکوپ الکترونی به صورت خشک نگهداری شدند. با استفاده از روش استاندارد معرفی شده توسط Reichenbacher و همکاران (2007)، ویژگی‌های ریخت‌سنجی اتولیت‌های سمت چپ اندازه‌گیری و با نرم‌افزار PAST (Palaeontological Statistics) نسخه 81/1 (Hammer et al., 2001) آنالیز شد. به خاطر وجود دوشکلی جنسی که در کپورماهیان دندان‌دار، تحلیل ریخت‌سنجی برای جنس‌های نر و ماده به طور جداگانه انجام گرفت. آنالیز واریانس یک طرفه (ANOVA, Duncan post hoc test, p<0.05) و نیز آنالیز چند متغیره (canonical discriminate analysis) برای مقایسه ریختی جمعیت‌های حوضه‌ها استفاده شد.

همچنین، ریخت‌شناسی اتولیت‌ها با استفاده از عکس‌های میکروسکوپی ریخت‌شناسی مقایسه و مطالعه شدند. ویژگی‌های ریخت‌سنجی و ترمینولوژی اتولیت ساژیتا در شکل 2 نشان داده شده است.

شکل 2- (A ترمینولوژی و (B ویژگی‌های ریخت‌سنجی اندازه‌گیری شده در سنگریزه شنوایی ساژیتا. ترمینولوژی سنگریزه شنوایی اقتباس از Nolf (1985) و ریخت‌سنجی اقتباس از Reichenbacher و همکاران (2007)

.استخراج DNA، تعیین توالی و آنالیز مولکولی: استخراج DNA از بافت ناحیه ساقه دمی ماهیان با استفاده از کیت استخراج تجاری DNA با روش استاندارد انجام شد (DNeasy Tissue Kit, Qiagen). برای تکثیر ناحیه ژن سیتوکروم b Cyt b)) موجود در DNA میتوکندریایی (mtDNA)، واکنش زنجیرهای پلیمراز (PCR) با استفاده از آغازگرهای اختصاصی: L1090 به توالی:
(5AAACTGGGATTAGATACCCCACTA3) و H1782 .(TTACATCTTTCCCTTGCGGTAC3)
(Hrbek and Larson, 1999) با دستگاه PCR (مدل Mastercycler nexus، شرکت eppendorf، آلمان) انجام شد. حجم هر واکنش PCR، 25 میکرولیتر شامل 1 تا 2 میکرولیتر DNA هدف، 8/10 میکرولیتر ddH₂O، 5 میلی‌مولار بافر، 3 میلی‌مولار Mgcl₂، 2 میلی‌مولار BSA، 2 میلی‌مولار dNTPs، 1 میکرولیتر پرایمر و 2/0 میکرولیتر Tag DNA polymerase. برنامه چرخه‌های حرارتی به ترتیب شامل: واسرشت شدن آغازین (denaturation) در دمای 94 درجه سانتیگراد به مدت 120 ثانیه، 35 سیکل واسرشته شدن در دمای 35 درجه به مدت 45 ثانیه، مرحله اتصال (annealing) در دمای 58 درجه سانتیگراد به مدت 60 ثانیه و مرحله گسترش (extention) به مدت 90 ثانیه در دمای 72 درجه سانتیگراد و مرحله گسترش نهایی به مدت 10 دقیقه در دمای 72 درجه سانتیگراد تنظیم شد. پس از تعیین توالی، داده‌های حاصل در نرم‌افزار Geneious R6 تصحیح و با سایر توالی‌های مشابه موجود در بانک جهانی ژن (NCBI) همتراز شد و برای رسم درخت فیلوژنی مورد استفاده قرار گرفتند. درخت فیلوژنی از روش بیشینه احتمال (maximum likelihood) با استفاده از نرم‌افزار RaxML نسخه 5/2/7 (Stamatakis, 2006) در مدل تکاملی GTR و بوت‌استرپ سریع (2000 تکرار) انجام شد.

نتایج.

.مقایسه ویژگی‌های شمارشی و اندازشی ماهیان: آنالیز واریانس یک طرفه نشان داد که سه ویژگی از 27 ویژگی اندازشی شامل: فاصله جلوی باله پشتی به طول سر (Prdd.HL)، فاصله جلوی چشم به طول سر (Prod.HL) و نیز طول سر به طول استاندارد (HL.SL) بین جنس‌های نر و ماده ماهیان از سه حوضه مطالعه شده، تفاوت معنی‌دار بود (ANOVA, Duncan post hoc test, p<0.05). در مورد ویژگی‌های شمارشی، تعداد شعاع‌های باله مخرجی و لگنی فقط بین جنس‌های نر از سه حوضه به طور معنی‌دار متفاوت بودند، در حالی که تعداد خارهای آبششی فقط بین جنس‌های ماده از سه حوضه تفاوت معنی‌دار داشت (ANOVA, Duncan post hoc test, p<0.05). افزون بر این، آنالیز CDA بر پایه تمام ویژگی‌های شمارشی (7 عدد) و اندازشی (27 عدد) انجام شد. نتایج نشان داد که جدایی ریختی قابل توجهی بین جمعیت‌های سه حوضه وجود دارد به طوری که 5/99 درصد از افراد ماده و 4/93 درصد از افراد نر به طور موفقیت‌آمیز در گروه‌های خود دسته‌بندی شدند (شکل‌های 3 و 4).

تحلیل خوشه‌ای بر پایه میزان تشابه فاصله اقلیدسی برای تمام صفات شمارشی و اندازشی محاسبه و بر این اساس روابط ریختی جمعیت‌های ماهیان از سه حوضه مطالعه شد. تحلیل خوشه‌ای نشان داد که جمعیت‌های ماهیان از هر حوضه به طور جداگانه در گروه‌های متعلق به خود دسته‌بندی شده‌اند. به طوری که سه گروه مجزا قابل تشخیص است که شامل: جمعیت حوضه مکران، جمعیت‌های حوضه هرمزگان و جمعیت‌های حوضه خلیج فارس است.

مقایسه ویژگی‌های ریخت‌سنجی اتولیت: آنالیز واریانس یک طرفه صفات ریختی اتولیت نشان داد که از میان 10 صفت، چهار صفت شامل: طول/ارتفاع (length/weight)، طول نسبی بخش میانی (relative length of medial part)، طول نسبی روستروم (relative length of rostrum) و طول نسبی بخش پشتی (relative length of dorsal part) بین جنس‌های نر و ماده تفاوت معنی‌داری دارند (ANOVA, Duncan post hoc test, p<0.05). آنالیز CDA بر پایه تمام ویژگی‌های نسبی به طور جداگانه در هر دو جنس نر و ماده انجام شد. نتایج نشان داد که جدایی ریختی قابل توجهی بین جمعیت‌های سه حوضه وجود دارد به طوری که 3/89 درصد از افراد نر و 4/95 درصد از افراد ماده به طور موفقیت‌آمیز در گروه‌های خود دسته‌بندی شدند (شکل 5).

افزون بر این، محاسبه MDC (Mean Discriminant Coefficients) مربوط به داده‌های ریختی اتولیت نشان داد که طول نسبی میانی اتولیت و طول نسبی روستروم از صفت‌های مهم در جدایی افراد نر و ماده مربوط به سه حوضه مورد مطالعه، است (شکل 6).

شکل 5- آنالیز چند متغیره CDA بر پایه داده های ریخت‌سنجی سنگریزه شنوایی از سه حوضه در جنوب ایران.

شکل 6- میانگین شکل از سنگریزه شنوایی بین جمعیت‌های ماهیان از سه حوضه متفاوت. گروه A مربوط به میانگین شکل سنگریزه شنوایی در جمعیت‌های حوضه مکران در جنوب‌شرق، گروه B مربوط به میانگین شکل سنگریزه شنوایی در جمعیت‌های حوضه هرمزگان و گروه C مربوط به میانگین شکل سنگریزه شنوایی در جمعیت‌های حوضه بوشهر است.

فیلوژنی مولکولی: روابط فیلوژنتیک جمعیت‌های مورد مطالعه با استفاده از آنالیز بیشینه احتمال (maximum likelihood) انجام شد و دو کلاد (clade) مجزای ژنتیکی تشخیص داده شد (شکل 7). کلاد 1 خود از دو گروه تشکیل شده است. در این کلاد، جمعیت‌های حوضه جنوب‌شرق ایران (گروه A) گروه خواهری را با جمعیت‌های حوضه بوشهر در جنوب ایران تشکیل می‌دهند (گروه C). کلاد 2 متعلق به تمام جمعیت‌های حوضه هرمزگان است که در اینجا به عنوان گروه B نامگذاری می‌شود. بنابراین، درخت تکاملی نشان می‌دهد که جمعیت‌های گونه Aphaniusdispar در حوضه‌های جنوب‌شرق ایران (گروه A) ارتباط خواهری با جمعیت‌های حوضه‌های جنوب‌غرب ایران (گروه C) دارند. این دو گروه با هم با جمعیت‌های حوضه هرمزگان (گروه B) گروه خواهری را تشکیل می‌دهند. نکته مهم در این روابط تکاملی این است که فیلوژنی جمعیت‌ها کاملاً منطبق با نحوه ارتباط جغرافیایی زیر حوضه‌های مربوطه است.

شکل 7- تحلیل فیلوژنی مولکولی بر پایه ژنوم میتوکندریایی (سیتوکروم b) در جمعیت‌های کپورماهی دندان‌دار در حوضه‌های جنوبی ایران. کلاد 1 شامل جمعیت‌های حوضه‌های A (حوضه‌های جنوب‌شرق ایران) و C (حوضه خلیج فارس) است. در این کلاد، دو گروه A و C گروه‌های خواهری را تشکیل می‌دهند. کلاد 2 تمام جمعیت‌های مطالعه شده از حوضه هرمزگان (گروه B) را در بر می‌گیرد. اعداد در محل دو شاخه شدن به ترتیب از چپ به راست شامل ارزش بوت‌استرپ در آنالیز احتمال بیشینه (ارزش قابل اعتماد بالای 95) و احتمال پسین بیزین (ارزش قابل اعتماد بالای 90/0) در آنالیز بیزین است.

بحث.

به طور کلی، گوناگونی‌های ریختی بر پایه شرایط محیطی، به خاطر فراهم نمودن شرایط مناسب توسط یک موجود ایجاد می‌شود (Brönmark and Miner, 1992؛ Day et al., 1994؛ Robinson and Wilson, 1996). به بیان دیگر، این گوناگونی ریختی بیشتر نتیجه تأثیر متقابل دو عامل مهم طبیعی از جمله انتخاب طبیعی (ایجاد سازش در زیستگاه) و جریان ژنی (به خاطر ایجاد یکنواختی ژنتیکی در جمعیت‌های یک گونه) است. یکی از مهم‌ترین اهداف مطالعات اکولوژیک و زیست‌شناسی تکاملی این است که چگونگی و الگوی سیستماتیک تغیرات را در طبیعت توضیح دهد (Gaston and Blackburn, 2000). بنابراین، شناخت ویژگی تغییرات جغرافیایی در جمعیت‌هایی که به طور طبیعی در مناطق جغرافیایی جدا افتاده پراکنده شده‌اند، از ابزارهای مناسب برای بررسی الگوی گوناگونی‌های جغرافیایی است.

وجود گوناگونی‌های معنی‌دار در صفت‌های فنوتیپی جمعیت‌های مطالعه شده از سه حوضه جنوبی ایران، نشان‌دهنده تفاوت‌های احتمالی ژنتیکی در این جمعیت‌ها است. این موضوع با در نظر گرفتن اهمیت تاکسونومیک یک ویژگی ریختی (HL.SL) به طور قوی تأیید می‌گردد. در مطالعه Teimori و همکاران (c2012) مشخص شد که این صفت ریختی (نسبت طول سر به طول استاندارد ماهی) نقش مهمی را در جدایی دو گونه Aphanius dispar و A. ginaonis (Holly, 1929) دارد. پیش از این، مطالعه Hrbek و همکاران (2006) نشان داده بود که این صفت برای جدایی چهار گونه دیگر از جنس Aphanius که از نظر ژنتیکی به یکدیگر نزدیک هستند نیز اهمیت دارد. علاوه بر این صفت، Hrbek و همکاران (2006) نشان دادند که ویژگی دیگر که نقش مهمی در جدایی این چهار گونه دارد، نسبت عمق سر به طول استاندارد بدن ماهی (HD.SL) است. بنابراین، می‌توان پیشنهاد نمود که ویژگی‌های مرتبط با ریخت ناحیه سری در این ماهیان احتمالاً نقش مهمی را در جدایی گونه‌های Aphanius و نیز در تاکسونومی آنها دارد.

علاوه بر تفاوت‌های ریختی مرتبط با بدن ماهی، ریخت‌شناسی سنگریزه شنوایی نیز تفاوت‌های معنی‌داری را در جمعیت‌های سه حوضه نشان داد. طول نسبی روستروم و طول نسبی میانی سنگریزه شنوایی نقش مهمی در جدایی جمعیت‌های A. dispar در جنوب ایران دارند. اهمیت تاکسونومیک این صفات در مطالعات گذشته نیز مشخص شده است Reichenbacher et al., 2007)؛ Teimori et al., 2012b).

همچنین، بر اساس آنالیز فیلوژنی در پژوهش حاضر مشخص شد که جمعیت‌های سه حوضه، واگرایی ژنتیکی مشخصی دارند. نکته مهم در این الگوی واگرایی، منطبق بودن آن با تفاوت‌های ریختی مشاهده شده و نیز انطباق آن با الگوی پراکنش جغرافیایی جمعیت‌ها است. بنابراین، با در نظر گرفتن شواهد بررسی شده، می‌توان پیشنهاد داد که هر کدام از حوضه‌ها دارای واحدهای عملکردی تاکسونومیک (OTUs) مربوط به خود هستند که احتمالاً در سطح زیرگونه و حتی گونه نسبت به یکدیگر متفاوت هستند. علاوه بر این، پژوهش حاضر این دیدگاه که وجود تغییرات جغرافیایی در صفات ریختی می‌تواند نتیجه برهمکنش جریان‌های ژنی بین جمعیت‌ها و انتخاب طبیعی باشد را تأیید می‌نماید. بنابراین، زمانی که برهمکنش جریان‌های ژنی بین جمعیت‌ها و انتخاب طبیعی حاصل روندهای تکاملی در طولانی مدت باشد (همانند چیزی که در جمعیت کپورماهی دندان‌دار در جنوب ایران اتفاق افتاده است)، تفاوت‌های ریختی به وجود آمده در جمعیت‌های جدا از هم می‌تواند بیانگر وجود واحدهای عملکردی تاکسونومیک (OTUs) باشد. پیشنهاد شده است که وقایع خرد زمین‌شناسی در حوضه هرمزگان به احتمال زیاد باعث جدایی زیستگاه‌ها و نیز باعث به وجود آمدن محیط‌هایی با شرایط اکولوژیکی ویژه گردیده است (Teimori et al., 2012a). نتیجه این وقایع، پدید آمدن تعداد زیادی زیستگاه‌های جدا افتاده است که امروزه توسط جمعیت‌های A. dispar اشغال شده‌ است. جدایی زیستگاه‌ها، باعث افزایش تنوع ریختی در حوضه هرمزگان شده است، به طوری که جمعیت‌های جدا افتاده هر کدام به احتمال زیاد به عنوان واحدهای عملکردی تاکسونومیک مجزا در نظر گرفته می‌شوند Esmaeili et al., 2010)؛ (Teimori et al., 2014. یکی از مواردی که به بهترین حالت می‌تواند بیانگر این موضوع باشد، تکامل گونه A. ginaonis در جنوب ایران است. این گونه در چشمه آب گرم گنو یافت می‌شود که از نظر ریخت‌شناسی شباهت بسیار زیادی به گونه A. dispar دارد. وقایع خرد زمین‌شناسی در این ناحیه و نیز سازش طولانی مدت در زیستگاه‌های با شرایط اکولوژیک سخت باعث شده است تا از نظر ژنتیکی و ریختی از تاکسون جدی خود جدا شده، به صورت یک واحد تاکسونومیک مجزا در سطح گونه (OTUs) تکامل یابد (شکل 7).

سپاسگزاری

نگارندگان از جناب آقای دکتر حمیدرضا اسماعیلی به خاطر همکاری صمیمانه در تهیه شماری از نمونه‌های ماهیان برای مطالعات مولکولی، آقای دکتر اولریخ مسؤول بخش ماهی‌شناسی موزه جانورشناسی مونیخ به خاطر همکاری در تهیه عکس‌های الکترونی از سنگریزه شنوایی، آقایان علی غلامی و روزبهان خائفی به خاطر کمک در نمونه‌برداری قدردانی می‌نمایند.