پیوندهای مفید
اخبار و اعلانات
آمار
| تعداد نشریات | 44 |
| تعداد شمارهها | 1,860 |
| تعداد مقالات | 15,073 |
| تعداد مشاهده مقاله | 42,373,283 |
| تعداد دریافت فایل اصل مقاله | 16,807,016 |
Comparison of morphological variations among three species of the genus Paracobitis in Iran using geometric morphometrics method with a taxonomical review on the genus in Iran | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Taxonomy and Biosystematics | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| مقاله 2، دوره 7، شماره 22، تیر 2015، صفحه 1-12 اصل مقاله (1.5 M) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| نویسندگان | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Omid Jafari1؛ Soheil Eagderi* 2؛ Maryam Nasrolah-Pourmoghadam2؛ Hashem Noferesti1؛ Hamed Mosavi-Sabet3 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1Department of Fisheries, Faculty of Fisheries and Environment, Gorgan University of Agriculture Science and Natural Resources, Gorgan, Iran | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 2Department of Fisheries, Faculty of Natural Resources, College of Agriculture and Natural Resources, University of Tehran, Karaj, Iran | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 3Department of Fisheries Sciences, Faculty of Natural Resources, University of Guilan, Sowmeh Sara, Iran | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| چکیده | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| This study was conducted to apply the landmark-based geometric morphometrics technique to differentiate three species of the genus Paracobitis (P. iranica, P. malapterura and P. rhadinaeus)in Iran based on their body shape, because previous works, using traditional morphometrics, could not distinct them. A total of 150 specimens were sampled from the Zaringol, Madarsoo, Ghomrood, Kordan Rivers and Chahnimeh reservoir. The left side of the specimens was photographed using a digital camera and then fifteen landmark-points were digitized on two-dimensional images using TpsDig2. Landmark data were analyzed after a generalised procrustes analysis using PCA, CVA and cluster analysis. The patterns of body shape differences among the populations were illustrated in the deformation grids in relation to consensus configuration. The results showed a significant differences among the studied species and their populations in terms of morphological traits (P<0.0001). Some differences were found in the length and depth of head, depth of body, caudal peduncle length and position of eye and position of dorsal fin. The result also showed that P. iranica from Kordan River can be considered to be a distinct taxon compared to the Ghomrood taxon based on its morphological characteristics. In addition, our findings revealed that the geometric morphometrics approach can be a proper tool for morphological and taxonomic studies in species with small sizes including Nemachelinae. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| کلیدواژهها | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Landmark؛ Landmark-based geometric morphometrics؛ based geometric morphometrics؛ Paracobitis iranica؛ P. malapterura؛ P. rhadinaeus | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| اصل مقاله | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
مقدمه. سگماهیان جویباری جنس Paracobitis Bleeker, 1863با 17 گونه، در غرب آسیا پراکنش یافتهاند و حضور شش گونه از آنها شامل: P. iranica (Nalbant and Bianco, 1998)، P. malapterura (Valenciennes, 1846)،P. rhadinaeus (Regan, 1906)، P. smithi(Greenwood, 1976)؛ P. vignai (Nalbant and Bianco, 1998) و Paracobitis sp. (در رودخانه کر استان فارس) در ایران گزارش شده است (Coad, 2013). در اعضای این جنس، سر از بالا به پایین و ساقهدمی از طرفین فشرده بوده، ساقهدمی دارای یک تاج پشتی بلند و طویل است که از باله پشتی تا بالهدمی کشیده شده است ولی به بخش جلویی بالهدمی اتصال ندارد (Coad, 2013). اعضای جنس Paracobitis دارای الگوهای رنگی متفاوتی هستند و حتی در بین جمعیتهای مختلف گونههای آن تفاوت در الگوهایی رنگی گزارش شده است (Coad, 2013). با این وجود، جداسازی اعضای این جنس اساساًً بر اساس الگوی رنگی آنها بوده است، برای نمونه، گونه P. iranica وP. malapteruraبر اساس الگوی رنگ و تاج چربی از هم جدا شده و به عنوان گونههای مجزا معرفی شدهاند (Nalbant and Bianco, 1998). مطالعه 21 ویژگی ریختی و 6 ویژگی شمارشی این دو گونه نیز نتوانسته است این دو گونه را از هم متمایز نماید (Coad, 2013). به علاوه، گزارشهای متعددی از حضور اعضای این جنس در حوضههای مختلف ایران به ویژه در حوزههای آبریز جنوب وجود دارد که نیازمند یک بررسی جامع آرایهشناختی هستند (Coad, 2013). بنابراین، جدا نشدن اعضای این دو گونه و احتمالاً سایر گونهها و حتی جمعیتها، علیرغم تفاوت ظاهری در شکل بدن آنها، میتواند بیانگر عدم توانایی روشهای ریختسنجی سنتی در بررسی ویژگیهای ریختشناختی اعضای جنس Paracobitis باشد. روش ریختسنجی هندسی (geometric morphometric) یک روش مدرنتر نسبت به روش سنتی است که در آن دادههای لندمارک و خط سیر پیرامونی (outline) میتواند اطلاعات ساختارهای زیستی را در قالب شکل اصلی استخراج و به صورت گرافیکی به نمایش درآورد Zelditch, 2004)؛ Tabatabei et al., 2013). علاوه بر این، امکان تفسیر دادههای این شکلها و تحلیل آماری آنها به راحتی امکانپذیر است Adams et al., 2004)؛ (Eagderi et al., 2013. برخلاف روش سنتی که از فواصل به عنوان دادههای شکل استفاده مینماید، در روش ریختسنجی هندسی لندمارک پایه الگوی شکل نمونهها بر اساس مختصات فضایی نقاط به عنوان بازتابی از تغییرات شکل در بین ساختارهای زیستی بررسی و مقایسه میگردد Adams et al., 2004)؛ (Ghanbari et al., 2013. از این رو، با توجه به قابلیتهای بالای روش ریختسنجی هندسی در جداسازی اشکال زیستی، مطالعه حاضر با هدف بررسی و مقایسه شکل بدن (ویژگی ریختشناختی) اعضای سه گونه P. iranica (با دو جمعیت از رودخانههای قمرود و کردان کرج)،P. malapterura (با دو جمعیت از رودخانه زرینگل گلستان و رودخانه تجن) و مواد و روشها. جایگاههای نمونهبرداری: تعداد 150 نمونه جنس Paracobitis از پنج منطقه زرینگل (E:54°57', در روش ریختسنجی هندسی، دادههای حاصل، مختصات لندمارکها است که برای استخراج دادههای شکل مورد استفاده قرار میگیرند و میتوانند در یک شبکه تغییر شکل مصورسازی شوند (Adams et al.,2004). از این رو، از سمت چپ سطح جانبی نمونهها با استفاده از Copystand مجهز به دوربین دیجیتال Kodak با قدرت تفکیک شش مگاپیکسل عکسبرداری شد. برای استخراج دادههای شکل در روش ریختسنجی هندسی تعداد 15 لندمارک تعیین (شکل 1) و با نرمافزار TpsDig2 روی تصاویر دو بعدی رقومی گردیدند. رویهمگذاری جایگاه لندمارکهای نمونهها به منظور حذف تغییرات غیرشکل (شامل مقیاس، جهت و موقعیت) با استفاده از تحلیل پروکراست (Generalised Procrustes Analysis) (Rohlf, 2001) در نرمافزارهای MorphoJ و Past انجام شد (Klingenberg, 1998). دادههای حاصل از شکل بدن جمعیتهای مطالعه شده با استفاده تحلیلهای چندمتغیره تجزیه به مؤلفههای اصلی (PCA) و تحلیل خوشهای (CA) با انتخاب الگوریتمهای Paired group و Eucilidean توسط نرمافزار PAST نسخه 10/2 و تحلیل همبستگی کانونی (CVA) بر اساس ارزش عدد P حاصل از
نتایج تجزیه به مؤلفههای اصلی (PCA)، شش عامل نخست را با مجموع 72 درصد از واریانسها به عنوان مؤلفههای مؤثر تشخیص داد که سهم هر کدام از این مؤلفهها از مؤلفه اول تا ششم به ترتیب 56/22، 30/17، 43/14، 48/10، 95/7 و 88/5 درصد بود. مؤلفههای اصلی اول و دوم که در مجموع حدود 40 درصد واریانس را نشان میدادند، نسبت به یکدیگر پلات شدند که نحوه توزیع جمعیتها در نمودار PCA در شکل 2 آورده شده است. مؤلفه اصلی اول مربوط به ویژگیهایی شامل: طویل شدن ساقه دمی، افزایش پهنای بدن، جابهجایی پشتی ناحیه آبششی، جابهجایی جایگاه چشم و تغییر موقعیت دهانی و مؤلفه اصلی دوم بیان کننده کوچک شدن سر، جابهجایی شکمی نوک پوزه، جابهجایی پشتی باله پشتی، پهن شدن بدن در ناحیه باله پشتی و کم عرض شدن ناحیه سر در مجاورت چشم بود.
شکل 1- لندمارکهای تعیین شده روی نمونهها: 1) ابتداییترین نقطه پوزه، 2) مرکز چشم، 3) نقطه لبه بالایی سر در امتداد مرکز چشم،
شکل 2- نمودار تجزیه به مؤلفههای اصلی (PCA) شکل بدن گونههای مطالعه شده. (A جمعیت گونه Paracobitis iranicaرودخانه قمرود؛ (B جمعیت گونه P. iranica رودخانه کردان؛ (C جمعیت گونه P. rhadinaeusرودخانه چاهنیمه زابل؛ (D جمعیت گونه P. malapterura رودخانه مادرسو؛ (E جمعیت گونه P. malapterura رودخانه زرینگل.
تحلیل همبستگی کانونی (CVA) حدود 100 درصد واریانس را در چهار مؤلفه اول نشان داد که هر کدام به ترتیب: 44/52، 70/25، 73/12و 13/9 از واریانس را به خود اختصاص دادند. CVA توانست 99 درصد دادهها را به صورت صحیح کلاسهبندی کند. دو مؤلفه نخست با 77 درصد واریانس به عنوان عوامل اصلی پلات شدند (شکل 3). نمودار CVA پنج گروه بررسی شده را کاملاً از یکدیگر متمایز نمود. در این نمودار گونه بررسی الگوهای ریختی شکل بدن گروههای مطالعه شده بر اساس نتایج مصورسازی شده در شبکه تغییر شکل نشان داد که شکل بدن این گونهها از الگوهای متنوعی تبعیت میکنند (شکل 4). بر اساس الگوی جابهجایی لندمارکها در گونه P. iranica رودخانه کردان بیشترین تفاوت مربوط به تغییر جایگاه لندمارکهای مستقر در نیمه جلویی بدن بود. اعضای این گروه دارای سر بزرگتر و پهنتر بودند (جابهجایی لندمارکهای 1، 3، 13 و 14). این گونه باله سینهای کاملاً شکمیتر (جابهجایی لندمارکهای 9 و 10) و طول قاعده باله مخرجی کوتاه دارد. همچنین، در این گونه عرض در انتهای ساقه دمی نیز اندکی قدامی بود. گونه P. iranicaرودخانه قمرود دارای پوزه کوتاهتر و سری کوچکتر است (جابهجایی لندمارکهای 1 و 14) و ابتدای قاعده باله سینهای آن نیز پشتی است. در این گروه، قاعده باله پشتی به سمت جلو جابهجا شده بود و دارای ساقه دمی درازتری نیز بود (جابهجایی پشتی لندمارکهای 7 و 8). گونه همچنین اندازهگیری برخی ویژگیهای ریختسنجی مشاهده شده در شبکه تغییر شکل بر اساس روش ریختسنجی سنتی به صورت فواصل نسبت به طول استاندارد بین جمعیتها و گونهها بیانگر دادههایی بود که میتواند در شناسایی و معرفی گونههای جنس Paracobitis نیز به کار رود (جدول 2).
شکل 3- نمودار تحلیل CVA شکل بدن جمعیتهای گروههای بررسی شده
جدول 1- فواصل Mahalanobis شکل بدن گروههای بررسی شده حاصل از تحلیل CVA، (0001/0P<)
شکل 4- نمودار تحلیل خوشهای شکل بدن جمعیتهای بررسی شده (شبکههای تغییر شکل نشان دهنده تفاوت هر گروه نسبت به شکل میانگین است)
جدول 2- برخی ویژگیهای اندازهگیری شده نسبت به طول استاندارد بر اساس جایگاه تفاوت مشاهده شده. مقادیر نشان داده شده بیانگر میانگین اعداد ± خطای انحراف معیار هستند (SD ± میانگین). n: تعداد نمونه بررسی شده در هر جمعیت
تحلیل خوشهای بر اساس بوتاسترپ و انتخاب بیش از 50 درصد حمایت، جمعیتهای مورد بررسی را به سه شاخه شامل: جمعیت قمرود در شاخه اول، چاهنیمه در یک شاخه دوم و جمعیتهای زرینگل، مادرسو و کردان را در شاخه سوم تقسیم نمود (شکل 4). همچنین بر اساس فواصل Mahalanobis شکل بدن گروههای مورد بررسی، جمعیتهای مادرسو و زرینگل دارای کمترین و جمعیتهای قمرود و چاهنیمه دارای بیشترین فاصله بودند (شکل 4).
بحث. نتایج پژوهش حاضر نشان داد که گروههای مطالعه شده به لحاظ ریختی با استفاده از روش ریختسنجی هندسی کاملاً از یکدیگر متمایز هستند. با استفاده از این روش نه تنها تمایز بین گونهای، بلکه بین جمعیتهای مورد بررسی کاملاً آشکار شد که میتواند بیانگر تمایز ریختی وابسته به فاصله جغرافیایی، زیستگاه یا به واسطه تعلق به آرایه متفاوت باشد (Langerhans et al., 2003). اساساً بسیاری از گونههای ماهیان در زیستگاههای مختلف تفاوتهای ریختی نشان میدهند بر اساس نتایج ریختسنجی هندسی، برخلاف پژوهشهای پیشین که از روش ریختسنجی سنتی استفاده کرده بودند (Coad, 2013)، این روش تفاوتهای ریختی اعضای Paracobitisرا به خوبی آشکار نمود و جداسازی گونهP. iranica از رودخانه قمرود (نزدیک شهر قم) و گونه P. malapterura از حوضه خزری را که بر اساس الگوی رنگ بدن و تاج چربی که توسط Nalbant و Bianco (1998) انجام شده بود را تأیید نمود. نتایج ریختسنجی هندسی نشان داد که P. iranica رودخانه قمرود دارای ساقه دمی طویلتر و قاعده باله مخرجی قدامیتر، طول پوزه کوتاهتر و ابتدای باله سینهای پشتیتر نسبت به گونه همچنین نتایج نشان داد که دو جمعیت P. iranica رودخانههای قمرود و کردان از حوضه دریاچه نمک، از نظر شکل بدن تفاوت معنیداری با یکدیگر دارند. همان طورکه در تحلیل خوشهای نشان داده شده است، جمعیت P. iranica رودخانه کردان از لحاظ ویژگیهای ریختی شکل بدن به گونه بر اساس نتایج دو جمعیت P. malapteruraمربوط به رودخانههای مادرسو و زرینگل به علت شباهتهای متعدد به یکدیگر در یک شاخه تحلیل خوشهای واقع شدند، اما با این وجود نمونههای جمعیت زرینگل دارای بدنی پهنتر (در محل قاعده باله پشتی) و موقعیت شکمیتر نوک پوزه و چشم و جایگاه پشتیتر منشأ جفت سبیلک دوم هستند. ویژگیهای مربوط به ارتفاع بدن و جایگاه چشم و ابتدای سبیلک زیرین بین دو جمعیت احتمالاً به واسطه انعطافپذیری ریختی تحت تأثیر عوامل محیطی هستند که در نتیجه سازگاری به شرایط محیطی زیستگاه در فرآیند تکامل موجودات حاصل میشود (Guill et al., 2003). بنابراین، بر اساس ویژگیهای ریختی میتوان جمعیت این دو رودخانه را بر اساس موقعیت پوزه، جایگاه چشم آنها و موقعیت پشتیتر ابتدای باله سینهای و منشأ جفت سبیلک دوم تشخیص داد. البته با توجه به گستره پراکنش بسیار بالای گونه P. malapteruraکه از حوضه خزر تا دجله ادامه مییابد (Banarescu and Nalbant, 1995) وجود تفاوتهای ریختی در اعضای این گونه میتواند قابل انتظار باشد. با این حال به نظر میرسد که محدوده گسترش این گونه مربوط به حوضه خزر باشد و گونه منطقه دجله (رودخانه کر) نیاز به بازبینی تاکسونومیکی دارد (Coad, 2013) و احتمالاً به آرایههای متفاوتی تعلق داشته باشند. بر اساس نظر Nalbant و Bianco (1998) گونههای P. iranica، گونه P. rhadinaeus قبلا فقط از رودخانه هلمند افغانستان گزارش شده بود و به تازگی برای نخستین بار توسط Rahdari و همکاران (2013) برای ایران گزارش شده است. گونه P. rhadinaeusمطالعه شده در تحقیق حاضر، اندازه بسیار بزرگتری (160 تا 220 میلیمتر طول کل) نسبت به سایر اعضای جنس Paracobitis داشتند. از ویژگیهای قابل تشخیص این گونه در مقایسه با سایر اعضای جنس Paracobitisدر ایران، میتوان به داشتن طول سر درازتر، عرض سر کمتر، بدن کم عرض، جایگاه پشتی باله مخرجی و ساقه دمی کوتاه اشاره کرد. پژوهش حاضر نشان داد که هر یک از سه گونه و جمعیتهای مختلف جنس Paracobitis مطالعه شده، بر اساس ویژگیهای ریختی قابل تمایز هستند. همچنین، روش ریختسنجی هندسی-با قابلیت بالا در آشکارسازی تفاوتهای ریختی نسبت به روش ریختسنجی سنتی- میتواند برای بسیاری از گونهها با اندازه کوچک نظیر اعضای خانواده Nemachelinae به عنوان ابزاری برای مطالعات ریختشناختی و آرایهشناسی به جای تکیه بر الگوهای رنگی بدن مورد استفاده قرار گیرد. سپاسگزاری. مقاله حاضر با حمایت مالی دانشگاه تهران انجام شده است.
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| مراجع | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
منابع. Adams, D. C., Rohlf, F. J. and Slice, D. E. (2004) Geometric morphometrics: Ten years of progress following the revolution. Italian Journal of Zoology 71: 5-16. Banarescu, P. and Nalbant, T. (1995) A generical classification of Nemacheilinae with description of two new genera (Teleostei: Cypriniformes: Cobitidae). Catalogue of Travaux du Muséum d'histoire naturelle "Grigore Antipa" 35: 429-496. Bleeker, P. (1963) Onzieme notice sur la faune ichthyologique de l’ile d’Obi. Neder. Tijdschri. Dierk, I. 228-238. Coad, B. (2013) Fresh water fishes of Iran. Retrieved from http://www.briancoad.com/contents.htm. On: 19 May 2013. Eagderi, S., Esmaeilzadegan, E. and Maddah, A. (2013) Body shape variation in riffle minnows (Alburnoides eichwaldii De Filippii, 1863) populations of Caspian Sea basin. Taxonomy and Biosystematics 5(14): 1-8 (in Persian). Ghanbari, F., Kaboli, M., Eagderi, S. and Nezami Balouchi, B. (2013) Sexual dimorphism in skull morphology of the brown bear (Ursus arctos Linnaeus, 1758) in Iran using geometric morphometric technique. Taxonomy and Biosystematics 5(16): 17-26 (in Persian). Greenwood, P. H. (1976) A new and eyeless cobitid fish (Pisces, Cypriniformes) from the Zagros Mountains, Iran. Journal of Zoology, London 180: 129-137. Guill, J. M., Hood, C. S. and Heins, D. C. (2003) Body shape variation within and among three species of darters (Perciformes: Percidae). Ecology of Freshwater Fish 12: 134-140. Holtmeier, C. L. (2001) Heterochrony, maternal effects and phenotypic variation among sympatric pupfishes. Evolution 55: 330-338. Klingenberg, C. P. (1998) Heterochrony and allometry: the analysis of evolutionary change in ontogeny. Biological Reviews 73: 79-123. Langerhans, R. B., Layman, C. A., Langerhans, A. K. and DeWitt, T. J. (2003) Habitat-associated morphological divergence in two Neotropical fish species. Biological Journal of Linnean Society 80: 689-698. Mittelbach, G. G., Osenberg, C. W. and Wainwright, P. C. (1999) Variation in feeding morphology between pumpkinseed populations: phenotypic plasticity or evolution? Evolutionary Ecology Research 1(1): 111-128. Nalbant, T. T. and Bianco, P.G. (1998) The loaches of Iran and adjacent regions with description of six new species (Cobitoidea). Italian Journal of Zoology 65: 109-123. Rahdari, A., Gharaei A., Ghaffari, M., Pakzad Tochaei, S., Karami, R., Righi, M., Raeisi Azizi, M. and Mishmast, A. (2013) A new record of Paracobitis rhadinaeus (Regan, 1906) after a hundred years from Sistan basin, southeast of Iran. Caspian Journal of Environmental Sciences 11(2): 253-257. Regan, C. T. (1906) Two new cyprinoid fishes from the Helmand basin. Journal of the Asiatic Society of Bengal 2(1): 8-9. Robinson, B. W. and Wilson, D. S. (1994) Character release and displacement in fishes: a neglected literature. The American Naturalist 144(4): 596-627. Robinson, B. W. and Wilson, D. S. (1995) Experimentally induced morphological diversity in Trinidadian guppies (Poecilia reticulata). Copeia 2: 294-305. Rohlf, F. J. (2001) Comparative methods for the analysis of continuous variables: geometric interpretations. Evolution 55(1): 2143-2160. Ruzzante, D. E., Walde, S. J., Cussac, V. E., Macchi, P. J. and Alonso, M. F. (1998) Trophic polymorphism, habitat and diet segregation in Percichthys trucha (Pisces: Percichthyidae) in the Andes. Biological Journal of the Linnean Society 65: 191-214. Smith, T. B. and Skulason, S. (1996) Evolutionary significance of resource polymorphisms in fishes, amphibians and birds. Annual Review of Ecology and Systematics 27: 111-133. Tabatabei, S. N., Eagderi, S., Hashemzadeh Segherloo, I. and Abdoli, A. (2013) Geometric and morphometric analysis of fish scales to identity genera, species and populations case study: the Cyprinid family. Taxonomy and Biosystematics 5(17): 1-8 (in Persian). Valenciennes, A. (1846) Histoire naturelle des poissons. 520-553. Tome dix-huitième. Bertrand, Paris. Wimberger, P. H. (1992) Plasticity of fish body shape. The effects of diet, development, family and age in two species of Geophagus (Pisces: Cichlidae). Biological Journal of the Linnean Society 45: 197-218. Wimberger, P. H. (1994) Trophic polymorphisms, plasticity and speciation in vertebrates. In: Theory and application in fish feeding ecology (Eds. Stouder, D. J., Fresh, K. L. and Feller, R. J.) 9-43. University of South Carolina Press, Columbia. Zelditch, M. (2004) Geometric morphometrics for biologists: a primer. Academic Press, New York.
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
آمار تعداد مشاهده مقاله: 1,004 تعداد دریافت فایل اصل مقاله: 900 |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||