ارزیابی اعتبار آرایه‌شناختی کلادهای مولکولی طایفه Arvicolini (پستانداران)

مقدمه

نتایج مطالعات مولکولی اعم از بررسی‌های پروتئینی، آنزیمی و توالی‌یابی ژن‌های هسته‌ای و میتوکندریایی نشان می‌دهد که به بازنگری آرایه‌های گونه‌ای و زیرگونه‌ای تعریف شده بر اساس مطالعات ریختی کمک شایانی می‌کنند. از جمله این مطالعات می‌توان به تحقیقات مولکولی Baker و Bradley (2006) اشاره کرد که نتایج آنها معرف گروه‌های ژنتیکی متعدد درون گونه‌های ریختی پستانداران بود. طایفه‌ ول‌ها‌ (Arvicolini Gray, 1821) با 14 جنس و 65 گونه‌ شناخته شده از متنوع‌ترین پستانداران نیمکره شمالی جهان است (Musser and Carleton, 2005). امروزه پژوهشگران در مطالعاتشان علاوه بر مفهوم زیستی گونه به مفهوم گونه‌ ژنتیکی نیز اشاره می‌کنند؛ مفهوم زیستی و ژنتیکی گونه دو دیدگاه متفاوت با مبانی نظری متفاوت هستند (Bradley and Baker, 2001). گونه‌ ژنتیکی به عنوان گروهی از جمعیت‌های طبیعی تعریف می‌شود که با وجود درون‌زادآوری، از نظر تبادل ژنتیکی از گروه‌های خویشاوند جدا شده و به صورت کلادی دارای جدایی ژنتیکی قابل قبول و گنجینه‌ ژنتیکی متفاوت می‌شود و تاریخچه‌ تکاملی مستقلی دارد. تأکید بر جدایی ژنتیکی و نه جدایی تولید مثلی، بیانگر مهم‌ترین تفاوت مفهوم گونه‌ ژنتیکی نسبت به گونه‌ زیستی است (Baker and Bradley, 2006). همین مسأله در مورد برخی گونه‌های ول‌ها‌ صادق است، مطالعات اخیر نشان می‌دهند که گونه‌های:
Microtus agrestis (Jaarola and Searle, 2004)،
 M. arvalis Haynes et al., 2003)؛ Fink et al.,2004؛ (Buzan et al., 2010، M. longicaudus (Conroy and Cook, 2000) و M. oeconomus Brunhoff et al.,2003)؛ Galbreath and Cook, 2004) تفاوت‌های آنزیمی، هاپلوگروه‌های میتوکندریایی مجزا و چند ریختی کروموزومی درون گونه‌ای دارند (Modi, 1987) که به مشکلات آرایه‌شناختی فراوانی در مورد حدود گونه‌ زیستی و اعتبار گونه‌های ریختی توصیف شده در این گروه از جوندگان منجر شده است. متأسفانه با وجود مطالعات متعدد در مورد تبارزایی جنس‌ها و گروه گونه‌های پیشنهادی در مطالعات پراکنده و جدا از هم، تاکنون مطالعه جامعی در مورد ارزیابی اعتبار ریخت‌گونه‌های معرفی شده، در مقایسه با کلادهای مولکولی در این طایفه انجام نشده است. بنابراین، در مطالعه حاضر سعی شده است تا با استفاده از نشانگر مولکولی ژن سیتوکروم b (Cytb)، ضمن بررسی روابط تبارزایی جنس‌ها، اعتبار ریخت‌گونه‌ها مورد آزمون قرار گیرد.

مواد و روش‌ها

در مطالعه‌ حاضر، 823 توالی از ژن Cytb به طول 1140 جفت نوکلئوتید مربوط به 38 گونه از طایفه‌ ول‌ها‌ در نیمکره شمالی، با استفاده از داده‌های بانک ژنی برای شناسایی هاپلوتیپ‌ها و با استفاده از نرم‌افزارهای DnaSP. (Librado and Rozas, 2009) و TCS (Clement et al.,2000) مطالعه شد. فواصل ژنتیکی درون و بین گروهی گونه‌های ریختی مورد مطالعه با استفاده از برنامه نرم‌افزاری ExCaliBAR (Aliabadian et al.,2014) و فواصل درون و بین گروهی شبکه‌های هاپلوتیپی، با استفاده از نرم‌افزار Mega5 (Tamura et al.,2011) محاسبه شدند و گراف حاصل در برنامه excel نسخه 2007 ترسیم شد. درخت فیلوژنتیکی بیژین (Bayesian) هاپلوتیپ‌ها با نرم‌افزار MrBayes نسخه 2/1/3 (Ronquist and Huelsenbeck, 2003) برای گونه‌ها و گروه گونه‌ها ترسیم گردید- اصطلاح گروه گونه به گونه‌هایی اطلاق می‌شود که به دلایل متعدد، تفاوت‌های مورفولوژیکی بسیار مشخصی نسبت به یکدیگر نشان نمی‌دهند و یک اصطلاح غیر رسمی در تاکسونومی است (Mayr, 1942) که برای ول‌ها به طور متداول در منابع به کار برده می‌شود (Musser and Carleton, 2005) و در درک گروه‌بندی‌های این زیرخانواده بسیار سودمند است. برای بهتر نشان دادن واگرایی بین گروه‌های داخلی، گروه‌های خارجی از درخت حذف شدند.

نتایج

درخت حاصل از تحلیل بیژین (شکل 1)، دربرگیرنده دو گروه اصلی برای داده‌های مطالعه شده ول‌ها‌ است؛ گروه اول متعلق به گونه‌های ناحیه پالئارکتیک (شامل دو زیرجنس Microtus و Terricola) و گروه دوم (زیرجنس Mynomys)شامل گونه‌های ناحیه نئارکتیک است و زیرجنس Alexandromys در قاعده درخت قرار می‌گیرد. زیرجنس Microtus شامل سه گروه گونه شناخته شده arvalis، socialis و guentheri است. زیرجنس Terricola شامل دو گروه گونه تک‌نیا است که یکی از دو گروه شامل گونه‌های Microtus (T). subterraneus و Microtus (T). daghestanicus است و گروه دیگر شامل گونه‌های بوم‌زاد اروپا است. زیرجنس Terricola شامل گونه‌هایی است که دارای کمترین فاصله ژنتیکی بین گونه‌ای (≤2 درصد) است: از جمله می‌توان به گونه‌های خواهری ذیل اشاره کرد:
Microtus (T). lusitanicus-Microtus (T). duodecemicostatus و Microtus (T). bavaricus-Microtus (T). liechtensteini. فاصله ژنتیکی بین گونه‌ای بر اساس مدل کیمورا-2 برای گونه‌های ریختی تعریف شده محاسبه شد که در محدوده 2-20 درصد قرار داشت، فواصل درون گونه‌ای برای این گونه‌ها بین 0-7 درصد محاسبه شد (شکل 2). بالاترین میزان فاصله ژنتیکی درون گونه‌ای در گونه‌های ریختی بررسی شده در این مطالعه مربوط به گونه‌های Microtus (A). maximowiczii (با 7 درصد) و Microtus (T). savii و Microtus (T). subterraneus(با 4 درصد) است. در تحلیل شبکه هاپلوتیپی مشخص شد که گونه Microtus (A). maximowiczii متشکل از سه شبکه هاپلوتیپی است که فواصل بین آنها برابر با 4/10-2/11 درصد بود، گونه‌ ریختی T. savii شامل سه شبکه هاپلوتیپی است که فواصل ژنتیکی بین آنها در حدود 7/4-6/7 درصد است. گونه T. subterraneus پنج شبکه هاپلوتیپی تشکیل می‌دهد که فواصل بین آنها برابر با 9/2-9/5 درصد است. توالی‌های
T. daghestanicus با داشتن فاصله درون گونه‌ای 3 درصد، دو شبکه هاپلوتیپی را تشکیل می‌دهند که فاصله بین آنها برابر با 9/3 درصد است. فواصل ژنتیکی بین گونه‌های ریختی M. abbreviates-M. miurus،
T. liechtensteini-T. bavaricusو T. lusitanicus-T. duodecemicostatus برابر با 2 درصد است که معادل کمترین مقدار فاصله محاسبه شده - و برابر با فاصله ژنتیکی بین شبکه‌های هاپلوتیپی (گروه‌های فیلوژنتیکی)- است.

در نهایت، از تعداد 823 توالی مربوط به 38 گونه، 64 شبکه هاپلوتیپی شناسایی شد. گونه T. pyrenaicusدر داخل شبکه هاپلوتیپی گونه T. gerbei قرار گرفت، همچنین تعدادی از توالی‌های مربوط به گونه‌های
M. miurus و M. abbreviatusبه دلیل فاصله ژنتیکی بسیار اندک در داخل یک شبکه هاپلوتیپی قرار گرفتند. به طور کلی، فواصل ژنتیکی بین شبکه‌های هاپلوتیپی و اختلافات ژنتیکی بین گونه‌های ریختی (2-20 درصد) و همچنین اختلاف ژنتیکی درون شبکه‌های هاپلوتیپی، با کمترین اختلاف ژنتیکی بین گونه‌های ریختی بر هم منطبق هستند (≤2 درصد).

شکل 1- درخت بیژین 64 هاپلوتیپ متعلق به 38 گونه‌ ریختی ول‌های ‌مطالعه شده، بر اساس توالی‌های ژن Cytb ترسیم شده است. اعداد پشت هر گره نشان دهنده مقادیر احتمال پسین (posterior probability) است.

بحث

بازسازی روابط تکاملی طایفه‌ ول‌ها‌ بر اساس صفات ریختی، فقط برای تعداد محدودی از نمونه‌ها امکان‌پذیر است، زیرا بررسی ویژگی‌های دندانی و جمجمه‌ای، تغییرات درون گونه‌ای و میزان همگرایی سازشی بالایی را در بسیاری از گونه‌های همزاد نشان داده است (Martinkova et al.,2007). یکی از نتایج محتمل تکامل بسیار سریع در ژنوم تاکسون‌هایی نظیر طایفه‌ ول‌ها‌، عدم وجود تغییرات ریختی است؛ عنوان شده است که این گروه از جوندگان دارای بالاترین نرخ تکامل ژن میتوکندریایی در بین پستانداران هستند (Triant and De Woody, 2008). اطلاعاتی از قبیل داده‌های آلوزیمی ژل نشاسته (Hubby and Lewontin, 1966؛ (Lewontin and Hubby, 1966، کاریوتیپ Patton, 1967)؛ (Hsu, 1979 و به ویژه توالی‌یابی ژن‌ها در اواسط دهه 1980، به ایجاد مجموعه داده‌های ژنتیکی بسیار غنی منجر شده است و احتمال تشخیص گونه‌های ناشناخته را افزایش داده است.

Bradley و Baker (2001) با مطالعه 18 گونه جونده، میانگین فاصله ژنتیکی بین گونه‌ای را برای گونه‌های پستانداران 49/2 درصد پیشنهاد کردند و فاصله ژنتیکی کمتر از عدد 2 درصد را نشان دهنده تغییرات درون گونه‌ای عنوان کردند.

شکل 2- بارکد گپ فواصل درون گونه‌ای و بین گونه‌ای در گونه‌های ریختی ول‌ها‌ بر اساس ژن Cytb. همپوشانی فواصل ژنتیکی درون گونه‌ای و بین گونه‌ای در شکل مشخص است. 4 عدد از گونه‌های ریختی بررسی شده (5/10 درصد) تغییرات بین گونه‌ای پایین‌تر از عدد 2/4 درصد و در مقابل3 عدد ازگونه‌ها (9/7 درصد) تغییرات درون گونه‌ای بالاتر از 2/4 درصد را نشان می‌دهند.

به نظر می‌رسد پراکنش کنونی ول‌ها‌ در نیمکره‌ شمالی نتیجه سه رویداد مهاجرت مستقل، از آسیای جنوب شرقی به عنوان خاستگاه فرضی آنها (Chaline et al.,1999؛ Musser and Carleton, 2005؛ Fink et al.,2010) به سمت شمال آمریکا، اروپا و شمال آسیا بوده است. همان طور که نتایج پژوهش حاضر نشان داد، بیشترین مقادیر واگرایی ژنتیکی بین گونه‌های متعلق به قاره‌های مختلف (آسیا، اروپا، آمریکای شمالی) است که نشان دهنده جدایی زیاد این گونه‌ها از یکدیگر است. از سوی دیگر، گونه‌های زیرجنس Alexandromys که در ناحیه‌ هولئارکتیک پراکنش دارند، منطبق با داده‌های Robovsky و همکاران (2008) است و بیانگر جدا افتادن این کلاد قدیمی از گونه‌های پالئارکتیک و نئارکتیک است. از طرفی، واگرایی ژنتیکی زیاد بین گونه‌های قاره‌های مختلف، می‌تواند به علت پراکنش چندین باره و جداگانه گونه‌های طایفه‌ ول‌ها‌ تفسیر شود (Fink et al.,2010).

فواصل ژنتیکی بین گونه‌ای در برخی از ول‌ها‌ نظیر گونه‌های: Microtus (A). maximowiczii (7 درصد)، Microtus (T). savii و Microtus (T). subterraneus(4 درصد)، بزرگتر از عدد آستانه 2/4 درصد پیشنهادی برای فاصله‌ بین گونه‌ای (Jaarola et al., 2004) است. این موارد نشان دهنده گونه‌های نا‌همگونی هستند که در تحلیل شبکه هاپلوتیپی شاهد گروه‌های ژنتیکی متعدد درون این گونه‌ها هستیم. این ناهمگونی ژنتیکی ممکن است بیانگر حضور گونه‌های نهانی باشد که در مطالعات ریختی شناسایی نشده‌اند. از سوی دیگر، نتایج نشان داد که برخی از گونه‌های ریختی دارای واگرایی ژنتیکی بسیار اندکی هستند (همپوشانی‌ها در شکل 2) و در تحلیل شبکه هاپلوتیپی درون یک شبکه واحد قرار می‌گیرند که از جمله می‌توان دو گونه ریختی M. abbreviates و
M. miurus را نام برد، این امر می‌تواند بیانگر تبادل ژنتیکی بین این گونه‌ها باشد؛ از این رو، لزوم بازبینی مجدد ماهیت چنین تاکسون‌هایی کاملاً ضروری است.

بر اساس آرایش درخت بیژین و فواصل ژنتیکی محاسبه شده بین گونه‌ها، به نظر می‌رسد که جدیدترین گونه زایی‌ها همچنان‌که پیشتر توسط Jaarola و همکاران (2004) و Kryštufek و همکاران (2010) عنوان شده است در گونه‌های پالئارکتیک و در زیرجنس Terricola رخ داده است. تا جایی که برخی از گونه‌های این زیرجنس، کمترین فاصله‌ ژنتیکی بین گونه‌ای (یک درصد) را در بین گونه‌های مطالعه شده دارا هستند، همانند گونه‌های خواهری Microtus (T). lusitanicus-Microtus (T). duodecemicostatus، و Microtus (T). bavaricus-Microtus (T). liechtensteiniکهتنها بر اساس مطالعات دورگ‌گیری به عنوان گونه‌های معتبر شناخته شده‌اند (Jaarola et al., 2004).

یکسان بودن محدوده فواصل ژنتیکی بین گونه‌های ریختی و هاپلوتیپ‌ها نشان دهنده این موضوع است که این جمعیت‌های ژنتیکی مجزا و گونه‌های ریختی که دارای چنین هاپلوتیپ‌هایی هستند نیازمند باز‌بینی و تصمیم‌گیری آرایه‌شناختی مجدد در سطح گونه هستند. در گونه‌های طایفه‌ ول‌ها‌ به دفعات با گونه‌های ریختی مواجه هستیم که اختلافات ژنتیکی و ریختی آنها بر هم منطبق نیستند؛ گونه M. qazvinensis بر اساس مطالعات دورگ‌گیری و کاریولوژی از شمال غرب ایران (استان قزوین) گزارش شده است (Golenishchev et al., 2003)، این گونه متعلق به گروه گونه ‘guentheri’ است و به جز عدم دورگ‌گیری، از نظر ریخت‌شناسی تفاوتی با گونه‌های دیگر این گروه M. guentheri) و (M. hartingiنشان نمی‌دهد. در مطالعه جامعی که اخیراً توسط نگارندگان بر روی این گونه انجام شده است نتایج مطالعات مولکولی ژن Cytb نشان داده است که این گونه اختلاف ژنتیکی قابل توجهی با دو گونه‌ ذکر شده دارد (تقریباً 9/5-2/6 درصد)؛ در مقابل، با گونه M. dogramacii(گونه‌ خواهری آن در درخت تبارزایی) با وجود دارا بودن ریخت و کاریوتیپ بسیار متمایز و فقدان دورگ‌گیری، اختلاف ژنتیکی اندکی دارد (3 درصد) (Mahmoudi et al., 2015). به طور کلی، تعریف حد آستانه‌ قطعی برای فواصل ژنتیکی بین گونه‌های طایفه‌ ول‌ها‌ نمی‌تواند منطبق بر قاعده‌ای کلی باشد و بنا به دلایل ذیل، ارتباط محکمی با شناسایی گونه‌های نهان احتمالی درون این جنس دارد:

الف) یکسان بودن و در برخی موارد، پایین بودن کمترین فاصله بین گونه‌ای در گونه‌های ریختی و فاصله ژنتیکی بین شبکه‌های هاپلوتیپی (2 درصد)

ب) همپوشانی قابل توجه فواصل ژنتیکی درون و بین گونه‌ای در گونه‌های ریختی (شکل 2).

ج) وجود گونه‌های ریختی تأیید شده که واگرایی ژنتیکی آنها بسیار پایین‌تر از حد آستانه‌ 2/4 درصد (Jaarola et al., 2004) پیشنهاد شده است.

طایفه‌ ول‌ها‌ گروهی جوان هستند و محققان معتقدند که نخستین گونه‌زایی از جد مشترک طی دوره پلیوستوسن روی داده است. این دوره در تاریخ زمین‌‌شناسی، با دوره‌های یخبندانی متعددی همراه بوده است (Mazurok et al., 2001) که نتیجه احتمالی آن، تشکیل جمعیت‌های جغرافیایی متعدد بوده است تا حدی که برخی پژوهشگران معتقدند حتی زمان انشعاب بسیاری از گونه‌های این آرایه به عصر آخرین یخبندان باز می‌گردد (Chaline, 1990) و بسیاری از جمعیت‌ها هنوز در سطوح مختلف گونه‌زایی قرار دارند (Martinkova et al.,2007). در نتیجه، می‌توان غنای گونه‌ای در ول‌ها‌ را حاصل تکه تکه شدن جمعیت اجدادی همراه با گونه‌زایی جغرافیایی پس از آن در نواحی پناهگاهی دانست (Kryštufek et al., 2009). روند گونه‌زایی سریع‌تر این آرایه، سازش آنها برای زندگی زیر‌زمینی، تطابق بالا با زیستگاه‌های متنوع (Musser and Carleton, 2005)، وجود صفات ریختی همگرا و گونه‌زایی خاص این جوندگان (Baker and Gatesy, 2002)، باعث شده است تا گروهی از گونه‌های بسیار جوان شکل بگیرند؛ از این رو، ما شاهد گروه‌های تبارزادی متعددی هستیم که احتمالاً می‌توانند معرف گونه‌های ناشناخته‌ای باشند که تاکنون شناسایی نشده‌اند؛ نمونه بارز این موضوع، تبارهای میتوکندریایی متعدد معرفی شده برای گونه Microtus arvalis (حداقل 6 تبار) توسط پژوهشگران مختلف است Haynes et al., 2003)؛ Fink et al.,2004؛ Buzan et al., 2010). نتایج مطالعات اخیر نگارندگان بر مبنای داده‌های Cytb یک تبار مولکولی دیگر به گونه
M. arvalis افزوده است که در ناحیه قفقاز تا شمال غرب ایران پراکنش دارد (Mahmoudi et al., 2014). به نظر می‌رسد این مسایل تا حدودی ناشی از سرعت بالای گونه‌زایی و جوان بودن این گروه از جوندگان باشد (Chaline, 1990). بنابراین، به نظر می‌رسد ناهمگونی موجود بین تغییرات ریخت‌شناسی، کاریولوژی و مولکولی می‌تواند در ارتباط با سرعت و مدل متفاوت تکاملی در تغییرات عنوان شده باشد
(Zima et al.,2013). به طور کلی، پژوهش حاضر معرف مواردی از گونه‌های همزاد و همچنین مواردی از جمعیت‌های در حال گونه‌زایی به صورت شبه گونه‌ها و یا جغرافیایی به صورت زیرگونه‌ها است که بر اساس مطالعات ریختی قابل تشخیص نبوده‌اند و نیاز به بررسی بیشتر دارند.

Bradley و Backer (2001) بر اساس مطالعات مولکولی بیان کردند که احتمال می‌رود بیش از 2000 گونه ناشناخته از پستانداران وجود داشته باشد. آنها معتقدند که توالی‌های DNA، بیش از هر مجموعه داده‌ دیگری، امکان وضوح چشم‌گیر برای درک وجود گونه‌ها و مرز آنها را به وجود می‌آورد. داده‌های مولکولی اجازه می‌دهد تا مفهوم ژنتیکی گونه را برای درک تنوع زیستی پستانداران به کار برد (Baker and Bradley, 2006). این موضوع، مفهوم جدیدی نیست و همراه با مفهوم زیستی و تیپولوژیک گونه Dobzhansky, 1937)؛ (Mayr, 1942 در بین قدیمی‌ترین مفاهیم گونه قرار دارد.

سپاسگزاری

از همکاران محترم بخش پژوهشی جونده‌شناسی دانشگاه فردوسی مشهد که در فراهم نمودن مقدمات نمونه‌برداری و کارهای آزمایشگاهی نگارندگان را یاری نمودند صمیمانه سپاسگزاری می‌شود.