تنوع ژنتیکی جمعیت‌های مختلف Thymus kotschyanus توسط نشانگرهای RAPD

مقدمه

آویشن با نام علمی Thymus kotschyanus Boiss. & Hohen. از تیره نعناییان (Lamiaceae) گیاهی با ارزش دارویی است که در مناطق کوهستانی می‌روید. هر چند این گیاه در سرتاسر دنیا یافت می‌شود، اما بیشترین تراکم را در نواحی مدیترانه دارد. در بین تمام آویشن‌های موجود در ایران، این گونه بیشترین پراکندگی را دارد (Jamshidi et al.,2006). در ارتفاعات جنوبی البرز در منطقه طالقان با افزایش ارتفاع، جمعیت و تراکم این گونه آویشن افزایش می‌یابد، به حدی که در ارتفاع 2800 متری گیاه غالب است (Habibi et al.,2006). این گونه گیاهی پایا با بوته‌های کوچک در ریشه چوبی، پُر شاخه و منشعب است (Mehrpur et al., 2004). بهترین دما برای جوانه‌زنی این گیاه محدوده 15 تا 30 درجه سانتیگراد است (Bannayan et al., 2006).

مهم‌ترین مسأله در اصلاح گیاهان دارویی، به دست آوردن گیاهی با متابولیت‌های ثانویه مورد نظر است و از آنجا که تفاوت‌های فیتوشیمیایی به طور مستقیم یا غیر مستقیم با تنوع ژنتیکی پیوستگی دارد (Arya et al., 2011) بنابراین، آنالیز تنوع ژنتیکی می‌تواند مبنای گزینش‌های بعدی باشد. گیاه آویشن را می‌توان به راحتی از طریق روش‌های اصلاحی متداول از جمله انتخاب، اصلاح نمود که این امر به دلیل تنوع ژنتیکی وسیع و هیبریداسیون موفق بین گونه‌های مختلف این گیاه است (Ismaili et al., 2013). نشانگرهای DNA بر پایه انگشت‌نگاری می‌تواند گونه‌ها را با میزان کمی از DNA تمیز دهد و بنابراین می‌تواند در استنباط صحیح از روابط فیلوژنتیکی بین آنها کمک کند.

راهکارهای مختلفی برای انگشت‌نگاری DNA نظیر: چندشکلی طولی قطعات تکثیر یافته (Amplified Fragment Length Polymorphism; AFLP)، توالی تکراری ساده (Simple Sequence Repeat; SSR) و چندشکلی DNA تکثیریافته تصادفی (Random Amplified Polymorphic DNA; RAPD) در دسترس است (Lanying et al., 2009). نشانگر RAPD به راحتی چندشکلی مناسب را با مقدار اندکی از DNA نشان می‌دهد (Talebi Bedaf et al.,2011) و می‌تواند در آنالیز تنوع ژنتیکی و روابط بین گونه‌ها استفاده شود. این نشانگر در آنالیز روابط بین نژادهای متعلق به جنس‌های مشابه و تنوع ژنتیکی در تعدادی از گیاهان، به ویژه گیاهان دارویی استفاده شده است (Lanying et al., 2009). اگرچه نشانگر RAPD طبیعتاً غالب است اما راهکارهای مختلفی برای کم کردن اثر غالبیت بر آنالیز تنوع ژنتیکی وجود دارد Lynch and Milligan, 1994)؛ Stewart and Excoffier, 1996). نشانگر RAPD تکرارپذیری اندکی دارد که این مشکل را نیز می‌توان با بهینه کردن شرایط واکنش تاحدودی برطرف کرد (Weising et al., 1995؛ (Szmidt et al., 1996. آنالیز RAPD نیازمند تنها مقدار اندکی از DNA ژنومیک است و می‌تواند سطح بالایی از چندشکلی را تولید کند که این موضوع می‌تواند آنالیز تنوع در گیاهان را راحت‌تر کند (Arya et al., 2011) و اطلاعاتی را فراهم کند که تمایز گونه‌ها و روابط فیلوژنتیک در سطح مولکولی را بتوان تشخیص داد. استفاده از چنین روش‌هایی برای توصیف ژرم‌پلاسم می‌تواند محافظت و کاربرد منابع ژنتیکی گیاهی را تسهیل کند.

پژوهش‌هایی پیرامون اسانس گونه
T. kotschyanusانجام گرفته است و از آن به عنوان یک نشانگر مورفولوژیکی استفاده شده است Mehrpur et al., 2004)؛ (Amiri, 2012. در پژوهشی دیگر اسانس چند جمعیت از گونه T. kotschyanusکه در شرایط مختلف گلخانه و مزرعه کشت شده بودند آزمایش شد که ترکیبات عمده موجود در اسانس آن شامل: تیمول، کارواکرول و پارا سایمن بود (Mehrpur et al., 2004). در تحقیقی دیگر میزان و محتوای اسانس‌های سه گونه T. daenensis،
T. eriocalyx و T. kotschyanus بررسی شد و مقادیر مختلفی از اسانس در این سه گونه یافت شد که این تنوع می‌تواند به چندین علت از جمله آب و هوا و ژنوتیپ نمونه‌ها باشد (Amiri, 2012). برای بالا بردن تنوع ژنتیکی و شناسایی والدین هیبریدهای درون گونه‌ای، مطالعه‌ای در مورد تنوع پلوئیدی سه جمعیت از گونهT. kotschyanus که در شمال و شمال غرب ایران رشد یافته بودند انجام شد؛ در این تحقیق نمونه‌هایی با تعداد کروموزوم برابر و دامنه تغییرات طول کروموزوم یکسان برای ایجاد هیبرید معرفی شد (Mehrpur et al., 2002). همچنین، بررسی تنوع کاریوتیپی سه گونه:T. daenensis، T. kotschyanus و T. vulgarisبررسی شده است که نتایج آن نشان داد که گونهT. kotschyanus دارای دو سطح پلوئیدی x2 و x4 است (Javadi et al., 2009). در تحقیقی دیگر، تنوع سیتوژنتیکی بین 16 توده مختلف از T. daenensis وT. kotschyanus تحلیل شد که تمام نمونه‌هایی که از لحاظ کاریوتیپی کمترین تفاوت را داشتند در یک خوشه قرار گرفتند (Ziaei Nasab et al., 2012).

در گونه T. kotschyanus تنوع ژنتیکی توسط نشانگرهای مولکولی نیز بررسی شده است که از آن جمله تحقیقی است که در آن تنوع ژنتیکی گونه
T. kotschyanus به همراه 14 گونه دیگر آویشن مورد آنالیز قرار گرفت و نتایج نشان داد که این گونه تشابه ژنتیکی بیشتری با گونه T. brachychilusدارد (Sunar et al., 2009).

با توجه به پراکندگی وسیع این گیاه در ایران متأسفانه تاکنون تحقیقات بر پایه نشانگرهای مولکولی (به ویژه نشانگرهای تصادفی RAPD) روی آن انجام نشده است، بنابراین در مطالعه حاضر، تنوع ژنتیکی توده‌های مختلفT. kotschyanusبا استفاده از نشانگر تصادفی محاسبه و روابط ژنتیکی آنها بررسی شده است.

مواد و روش‌ها

تعداد 18 جمعیت از مؤسسه تحقیقات جنگل‌ها و مراتع کشور واقع در کرج جمع‌آوری شد. این نمونه‌ها از شش استان مختلف بودند و به صورت کدهای C1 تا C18 نام‌گذاری شدند. کدهای C1، C2، C9 و C11 مربوط به استان قزوین، کدهای C5، C7، C15 و C18 مربوط به استان آذربایجان غربی، کدهای C3، C4، C6 و C13 مربوط به استان زنجان، کدهای C8، C10 و C17 مربوط به استان کردستان، کد C14 مربوط به تهران و کد C16 متعلق به استان کرمان و کد C12 با مکان جمع‌آوری نامعلوم است (شکل 1).

DNA ژنومیک از برگ‌های پودر شده در ازت مایع با روش Khanuja و همکاران (1999) با اندکی تغییر انجام گرفت. سپس RNase به آن اضافه شد و روی ژل آگاروز 8/0 درصد ارزیابی شد. در تحقیق حاضر، 30 آغازگر RAPD که در مطالعات قبلی Dababneh, 2007)؛ Trindade et al., 2008؛ Sunar et al., 2009) روی گیاه آویشن چندشکلی بالایی نشان داده بودند، انتخاب شد (جدول 1). واکنش PCR در حجم 25 میکرولیتر بر اساس روش Williams و همکاران (1990) انجام شد. شرایط تکثیر PCR برای RAPD شامل واسرشت‌سازی اولیه در دمای 95 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه و پس از آن 40 چرخه شامل واسرشت‌سازی در دمای 95 درجه به مدت یک دقیقه، اتصال آغازگر در دمای 40 درجه سانتیگراد به مدت 30 ثانیه و بسط در دمای 72 درجه سانتیگراد به مدت دو دقیقه بود و در پایان چرخه‌ها بسط نهایی در 72 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه انجام شد. در انتها، محصولات PCR برای مشاهده روی ژل آگاروز 5/1 درصد الکتروفورز گردید.

شکل 1- مکان‌های جمع‌آوری 18 جمعیت آویشن در ایران

جدول 1- آغازگرهای 10 نوکلئوتیدی برای نشانگر RAPD

باندهای RAPD بر اساس حضور (1) یا عدم حضور (0) امتیازدهی شدند و هر باند به عنوان یک جایگاه ژنی در نظر گرفته شد (شکل 2). محاسبات با نرم‌افزارهای NTSys PC نسخه 02/2 (Rohlf, 1998) و Darwin نسخه 146/0/5 انجام شد. دندروگرام با روش UPGMA با واحد SAHN توسط نرم‌افزار Darwin ترسیم گردید. محتوای اطلاعات چندشکلی بر اساس فرمول Anderson و همکاران (1993) و شاخص نشانگر بر اساس فرمول Powell و همکاران (1996) محاسبه گردید.

شکل 2- محصول آغازگر b06 روی ژل آگاروز 5/1 درصد. M: نشانگر اندازه مخلوط kb1 و bp100؛ C: شاهد منفی؛ شماره ها بیانگر توده‌ها است.

نتایج

از 30 آغازگر استفاده شده، 29 آغازگر چندشکلی قابل توجهی نشان دادند. این 29 آغازگر از 8 تا 20 قطعه را تولید کردند. تعداد باندهای چندشکل از 4 تا 20 عدد باند متغیر بود و محدوده درصد چندشکلی از 50 درصد (آغازگرهای d13، opb10 و opy18) تا 100 درصد (آغازگرهای b06، d05، opa2، opb5 و opz10) محاسبه گردید (جدول 2). میانگین محتوای اطلاعات چندشکلی آغازگرها برابر با 32/0 برآورد شد که بین 17/0 (آغازگر E16) و 45/0 (آغازگر B11) قرار دارد. بنابراین، آغازگر B11 بهتر از سایر آغازگرهای به کار رفته توانست فاصله ژنتیکی نمونه‌ها را مشخص کند. محاسبه شاخص نشانگر (MI) برای هر کدام از نشانگرهای مورد استفاده نشان داد که بیشترین میزان شاخص نشانگر مربوط به آغازگر B06 (48/7) و کمترین مقدار مربوط به آغازگر OPY18 (88/0) بود. این شاخص نشان داد که آغازگر B06 نسبت به سایر آغازگرها پتانسیل بالاتری در تولید باند بیشتر دارد Anderson et al., 1993)؛ (Powell et al., 1996.

دندوگرام توسط نرم‌افزار داروین با 100 بار نمونه‌برداری راه‌انداز (bootstrap samples) برای تعیین کارآیی روش‌های مورد استفاده، ترسیم شد (شکل 3) و توده‌ها را به چهار گروه اصلی تقسیم نمود. گروه یک شامل 8 توده C1، C2، C9، C10، C12، C13، C14 و C17؛ گروه دو شامل تک توده C16؛ گروه سه شامل هفت توده C3، C4، C5، C6، C7، C8 و C11 و گروه چهارم شامل دو توده C15 و C18 است. بررسی روابط ژنتیکی نمونه‌ها با استفاده از آزمون تجزیه به مؤلفه‌های اصلی انجام شد (شکل 4). با استفاده از این فضای مختصاتی می‌توان موقعیت توده‌ها را نسبت به یکدیگر شناسایی کرد.

نتایج تجزیه مؤلفه‌های اصلی شامل مقادیر ویژه و نسبت واریانس مورد انتظار توسط چهار مؤلفه اول برای هر آغازگر در جدول 3 آورده شده است. چهار مؤلفه اول در کل 58/53 درصد از کل تغییرات را توجیه نمودند، که سهم مؤلفه اول 41/19 درصد و سهم سه مؤلفه بعدی به ترتیب 86/13 درصد، 08/11 درصد و 23/9 درصد بود.

جدول 2- مشخصات چندشکلی آغازگرهای استفاده شده

شکل 3- دندوگرام UPGMA، 18 توده T. kotschyanus بر اساس 29 آغازگر RAPD. اعداد روی شاخه‌ها (بوت‌استرپ) با 100 تکرار هستند.

جدول 3- تجزیه مؤلفه‌های اصلی شامل مقادیر ویژه و واریانس مورد انتظار

شکل 4- نمودار دو بعدی مربوط پراکندگی توده‌های T. kotschyanusبا استفاده از آزمون تجزیه به مؤلفه‌های اصلی

بحث و نتیجه‌گیری

روش RAPD، روشی معمول و مناسب برای مطالعات ژنتیکی است. همچنین یک فرآیند آسان و راحت برای کشف تنوع ژنتیکی کل، درون و بین جمعیت‌ها است. روش RAPD با موفقیت در مطالعات تنوع ژنتیکی و تفاوت‌های رده‌بندی استفاده شده است Vyas et al., 2009)؛ (Ahmad et al., 2010. سادگی روش RAPD کاربرد آن را برای بررسی روابط خویشاوندی بین جنس‌ها آسان می‌کند (Demeke et al., 1992؛ (Wilikie et al., 1993. یکی از معایب عمده این روش ایجاد باندهایی با مهاجرت یکسان است که از نظر منشأ ژنومی یکسان نیستند. با وجود این محدودیت، نشانگرهای RAPD دارای مزایای زیادی هستند از جمله این که سرتاسر ژنوم را کاوش می‌کند؛ از این رو، مطالعات فیلوژنتیک فراوانی در سطح گونه انجام گرفته است Wilikie et al., 1993)؛ Nair et al., 1999). در پژوهش حاضر، گونه T. kotschyanusدرصد بالایی از چندشکلی ژنتیکی (57/77 درصد) را نشان داد که این درصد کمتر از درصدی بود که در تحقیقی بر T. caespititius(97 درصد) به دست آمده بود (Trindade et al., 2008). مطالعه حاضر نشان داد که RAPD اطلاعات مفید و کافی در رابطه با آزمون تنوع ژنتیکی توده‌های طبیعی T. kotschyanus فراهم می‌کند. بنابراین، نشانگرهای RAPD ابزاری سودمند در ارزیابی و حفاظت از ژرم‌پلاسم هستند. تنوع ژنتیکی ارتباط نزدیکی با پراکنش جغرافیایی آنها دارد. گونه‌هایی با منطقه جغرافیایی وسیع عموماً تنوع ژنتیکی بیشتری نشان می‌دهند (Wilikie et al., 1993). آنالیز RAPD تنوع ژنتیکی بالایی را در توده‌های رشد کرده در محیط‌های مختلف و تنوع کمتری را در توده‌های رشد کرده در مناطق مشابه نشان داد.

همان طور که در شکل3 دیده می‌شود، نمونه‌های موجود در خوشه‌ اول (با ارزش بوت‌استرپ 86 درصد) دارای قرابت‌های جغرافیایی نیز هستند به طوری که تمام نمونه‌های این گروه از ارتفاعات 1600 متر به بالا جمع‌آوری شده‌اند؛ بیشترین شباهت مربوط به دو نمونه C1 و C2 است که هر دو از مناطقی با اکولوژی یکسان از استان قزوین هستند. مطابقت تنوع ژنتیکی با تنوع جغرافیایی در بسیاری از مطالعات روی سایر گیاهان گزارش شده است Alpert et al., 1993)؛ Botanga et al., 2002؛ (Yang et al., 2007. خوشه‌ دوم تنها شامل تک نمونه‌ای از استان کرمان بود که دور بودن این نمونه از مرکز تنوع گونه T. kotschyanus در ایران که عمدتاً در شمال، شمال غرب و غرب است (Javadi et al., 2009) می‌تواند دلیلی بر جدا افتادن این نمونه باشد، همچنین دگرگشنی بالایی که در جنس آویشن گزارش شده است (تا 80 درصد) (Valdeyron et al., 1977) همراه با نزدیکی به مرکز تنوع گیاه آویشن دنایی (Ghasemi Pirbalouti et al., 2011) می‌تواند دلیلی بر تفاوت‌های ژنتیکی نشان داده شده در این نمونه باشد. گروه سوم شامل نمونه‌هایی بود که بیشترین شباهت اکولوژیکی را با هم داشتند و همگی از مناطق سردسیر هستند. برای مثال، نمونه‌های C3 و C4 هر دو از استان زنجان بوده، از طول و عرض جغرافیایی نسبتاً نزدیک جمع‌آوری شده بودند؛ ارزش بالای بوت‌استرپ (89 درصد) این شاخه دلیل قابل قبولی در خصوص صحت گروه‌بندی این نمونه‌ها بود. گروه چهارم (با ارزش بوت‌استرپ 92 درصد) دارای دو نمونه بود که هر دو از اطراف شهر ارومیه در استان آذربایجان غربی جمع‌آوری شده‌اند، ارتفاع مکان رشد این دو نمونه 1480 و 1500 متر است و دارای اقلیم مشابه است که می‌تواند دلیلی برای هم‌گروه شدن این دو توده باشد.

طی مطالعه تنوع ژنتیکی این گونه، تقسیم نمونه‌ها به چهار گروه که در شکل 3 نشان داده شده است، احتمال اندکی را برای جریان ژنی در میان توده‌هایی که از لحاظ جغرافیایی با هم فاصله دارند قایل می‌شود؛ اما احتمالاً تلاقی ژنتیکی طبیعی و جریان ژنی در بین نمونه‌های نزدیک به هم رخ داده است. از پژوهش حاضر می‌توان چنین استنباط کرد که تنوع ژنتیکی بالا بین توده‌های مجاور به احتمال قوی ناشی از معرفی مصنوعی مواد ژنتیکی توسط بشر بوده است و ناشی از تفاوت‌های ژنتیکی ژنوم آنها نیست.

نشانگر RAPD، یک نشانگر چند جایگاهی با تکنولوژی سریع و ساده است که به طور موفقیت‌آمیزی در تعیین تنوع ژنتیکی درون گونه‌ای چندین گونه گیاهی به کار رفته است Gupta et al., 2010)؛ Malviya and Yadav, 2010). محاسبه PIC بر اساس این احتمال که دو ژنوتیپ نامربوط تکثیر شده از جمعیت مورد آزمون در گروه‌های متفاوتی قرار می‌گیرند، انجام شد. مقادیر PIC درجه چندشکلی نشانگر است که اساساً نسبت افرادی است که برای نشانگر هتروزیگوت هستند. شاخص PIC یک مقیاس مناسب از هتروزیگوتی است و مقدار بالای PIC نشان‌دهنده هتروزیگوتی زیاد است که به نوبه خود بیانگر درجه بالای چندشکلی است (Mba and Tohme, 2005). در بررسی حاضر، محدوده مناسب مقادیر PIC به دست آمد که نشان دهنده تنوع ژنتیکی قابل توجهی در میان توده‌های T. kotschyanus است.

نتایج حاصل از تجزیه خوشه‌ای و تجزیه مؤلفه‌های اصلی در بررسی تنوع ژنتیکی با استفاده از داده‌های مولکولی نشان داده است که در حالت ادغام منابع ژرم‌پلاسمی الگوی تنوع ژنتیکی حالت طبقه‌ای نداشته و استفاده از الگوریتم‌های تجزیه خوشه‌ای دارای محدودیت در گروه‌بندی این مواد ژنتیکی هستند. بنابراین، در چنین مواردی تجزیه به مؤلفه‌های اصلی و سایر روش‌های مرتبط می‌تواند روشی جایگزین برای گروه‌بندی افراد باشند (Mohammadi and Prasanna, 2003). با مقایسه فواصل فضایی در آزمون تجزیه مؤلفه‌های اصلی و فواصل ژنتیکی در روش تجزیه خوشه‌ای، مشاهده شد که هر دو روش، توده‌ها را به طور مشابهی از هم تفکیک کرده‌اند. با توجه به مقادیر جدول 3 و این که چهار مؤلفه اول تنها 05/33 درصد از تنوع را توجیه کرده‌اند، مشخص می‌شود که تنوع در سطح وسیعی از ژنوم نمونه‌ها وجود دارد و تنها به یک بخش ژنوم اختصاص ندارد. این موضوع می‌تواند مزیتی برای نشانگر RAPD باشد، زیرا این نشانگر در سرتاسر ژنوم پخش شده است.

شناسایی تنوع ژنتیکی درون جمعیتی یک پیش شرط برای آنالیز تنوع ژنتیکی کل است. مشاهدات و تفاسیر تحقیق حاضر می‌تواند به عنوان یک تحلیل اکتشافی اولیه جالب توجه باشد. یافته‌های موجود می‌تواند نقطه قوتی برای توسعه دادن حوزه و اندازه مجموعه مناطق پراکنش T. kotschyanus جهت دریافت کمّیت تنوع ژنتیکی موجود در گونه‌ها در سطح مولکولی باشد. پژوهش حاضر نخستین گزارش از توصیف ژنوتیپ‌های T. kotschyanus موجود در ایران با آغازگرهای تجاری قابل دسترس است. توانایی روش‌های مولکولی بر پایه الگوهای RAPD به منظور تشریح روابط ژنوتیپ‌ها در این تحقیق نشان داده شد.

سپاسگزاری

از مؤسسه جنگلها و مراتع کشور به خاطر در اختیار گذاردن برخی نمونه‌های گیاهی قدردانی می‌شود.