بررسی تاکسونومی عددی Trifolium resupinatum L. (شبدر ایرانی) و Trifolium fragiferum L. (شبدر توت‌فرنگی) با استفاده از ریزماهواره‌های جدید

حائری نسب, مریم; آقایی, پیمان

تعداد نشریات	43
تعداد شماره‌ها	1,652
تعداد مقالات	13,408
تعداد مشاهده مقاله	30,253,013
تعداد دریافت فایل اصل مقاله	12,089,601

بررسی تاکسونومی عددی Trifolium resupinatum L. (شبدر ایرانی) و Trifolium fragiferum L. (شبدر توت‌فرنگی) با استفاده از ریزماهواره‌های جدید

تاکسونومی و بیوسیستماتیک

مقاله 6، دوره 5، شماره 14، خرداد 1392، صفحه 41-52 اصل مقاله (561.25 K)

نویسندگان

مریم حائری نسب^* ¹؛ پیمان آقایی²

¹گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه اصفهان، اصفهان، ایران

²مربی، گروه زیست‌شناسی، دانشگاه پیام نور، تهران 4697 – 19395، ج. ا. ایران

چکیده

Trifolium resupinatum و T. fragiferum دو گونه زراعی مهم تیره باقلائیان هستند. T. fragiferum به عنوان بخشی از خزانه وراثتی T. resupinatum در نظر گرفته شده است. در این مطالعه، ضمن بررسی انتقال‌پذیری زوج آغازگرهای T. pratense و T. repens به ژنوتیپ این دو گونه و معرفی نشانگرهای SSR (ریزماهواره‌های) جدید برای این گونه‌ها، میزان شباهت ژنومی آنها با استفاده از نشانگرهای SSR، به روش تاکسونومی عددی ارزیابی شد. نتایج حاصل از این مطالعه، حاکی از سطح بالای انتقال‌پذیری و چندشکلی ریزماهواره‌های معرفی شده برای T. pratense و T. repens به گونه‌های T. fragiferum و T. resupinatum بود. مطالعات نشان داد که در این گونه‌ها تنوع بین جمعیتی زیاد بوده، دو گونه در خوشه‌هایی با شباهت بسیار اندک دسته‌بندی شدند که نشانگر تفاوت ژنومی آنها در جایگاه‌های ‌ژنی SSR آزموده شده است. این مطالعه نشان داد که ریزماهواره‌ها می‌توانند ابزار مفیدی برای بررسی تنوع ژنتیکی در این گونه‌ها باشند. نتایج این بررسی پیشنهاد می‌کند تا زمانی که جفت آغازگرهای SSR اختصاصی برای این دو گونه طراحی نشده است، می‌توان با ضریب اطمینان بالایی از آغازگرهای SSR به دست آمده از T. pratense و T. repens، برای تحلیل ژنوم در این گونه‌ها استفاده نمود.

کلیدواژه‌ها

شبدر ایرانی (Trifolium resupinatum)؛ شبدر توت‌فرنگی (T. fragiferum)؛ SSR؛ تحلیل تاکسونومی عددی؛ ایران

اصل مقاله

مقدمه

جنس شبدر (Trifolium L.) متعلق به طایفه Trifolieae Brongniart از تیره باقلائیان (Fabaceae Lindley) یکی از مهم‌ترین جنس‌های گیاهی از نظر زراعی و تعداد گونه (255 گونه در جهان) است (Ellison et al.,2006). این جنس خویشاوندی بسیار نزدیکی با جنس‌های Trigonella L.، Medicago L. و Melilotus Miller دارد. بدون شک، ناحیه مدیترانه‌ای مرکز کشت و به‌نژادی بیشترین گونه‌های زراعی جنس شبدر است (Zohary and Heller, 1984). گونه‌های مختلف جنس شبدر علاوه بر استفاده به صورت علوفه، به طور وسیع در زنبورداری و به ندرت به عنوان سبزیجات خوراکی و دارویی استفاده می‌شوند (Zohary and Heller, 1984). شبدر پس از یونجه (Medicago) مهم‌ترین گیاه علوفه‌ای دو لپه‌ای است که با سطح کشت حدود یکصد هزار هکتار جایگاه ویژه‌ای در کشور دارد (زمانیان، 1384) و باعث افزایش شدید نیتروژن خاک شده، مبنای تناوب کشت را تشکیل می‌دهد (جود و همکاران، 1382). مهم‌ترین گونه‌های زراعی جنس Trifolium در ایالات متحده که بیشترین کشت و زراعت شبدر را در جهان دارد گونه‌های T. pretense L.(شبدر قرمز)، T. repens L. (شبدر سفید)،
T. incarnatum L. (شبدر لاکی) و T. hybridum L. (شبدر دو رگ) هستند (Taylor, 1985)، در حالی که در ایران مهم‌ترین گونه زراعی کشور با سطح زیر کشت حدود 100 هزار هکتار Trifolium resupinatum L. (شبدر ایرانی) است (عباسی و زمانیان، 1384). شبدر ایرانی، گیاهی یک‌ساله با دو فصل رویش بهار و زمستان است. گونه T. Clusii Godr. & Gren. خزانه ژنی دوم و گونه T. fragiferum L. (شبدر توت‌فرنگی) خزانه ژنی سوم این گونه هستند (Taylor and Gillett, 1988). زمانی که به‌نژادگران نتوانند آلل‌های موردنظرشان را از خزانه ژنی اول (تمام ارقام و کولتیوارهای اصلاح شده جمعیت‌های بومی و جمعیت‌های خودرو در هر گونه زراعی) به دست آورند، خزانه‌های ژنی دوم و سوم را جستجو می‌نمایند (Fehr, 1987). شبدر توت‌فرنگی،گیاهی چندساله با عادت رشد به طور عمده خوابیده و دارای ساقه‌های رونده (stolon) است که علاوه بر تکثیر جنسی به وسیله بذر با قطعه قطعه شدن ساقه به طریق رویشی، قابلیت تکثیر دارد. با اینکه این گونه پتانسیل استفاده در سیستم‌های مرتع و چراگاهی را دارد، اما هنوز در کشور به عنوان گونه زراعی مورد استفاده قرار نگرفته است. این گونه به دلیل ساقه‌زایی بالا، فقدان کُرک در بیشتر جمعیت‌ها، نرمی بافت رویشی، تولید بیوماس بالا و سازگاری با خاک‌های شور و قلیایی (Taylor and Gillett, 1988) می‌تواند یکـی از مناسب‌ترین گونه‌ها در مـراتع و چـراگاه‌های پایا باشد. همچنین، در صورت نیاز به‌نژادگران در برنامه‌های دو رگ‌گیری با شبدر ایرانی استفاده شود (عباسی، 1387). دامنه پراکنش جغرافیایی T. fragiferum،اروپا، قبرس، ترکیه، ایران، قفقاز و سوریه است و در نواحی شمال، شمال‌غرب، غرب و مرکز ایران می‌روید، در حالی که
T. resupinatum در نواحی بالکان، آسیای میانه، ترکیه، ایران، روسیه، عراق، سوریه، فلسطین و مصرگسترش یافته، در بخش‌های شمال، غرب، جنوب‌غرب و مرکز ایران پراکنده است (Heller, 1984).

ریزماهواره‌ها یا نشانگرهای مولکولی SSR شامل توالی‌های تکراری ساده با واحدهای 1 تا 6 نوکلئوتیدی هستند که به دلیل مزایای زیادی که نسبت به سایر نشانگرهای مولکولی دارند بیشتر مورد توجه قرار گرفته‌اند. از جمله مزایای آنها می‌توان به کاربرد آسان، سادگی تفسیر نتایج، میزان بالای تنوع، فراوانی و تنوع زیاد آلل‌ها در سطح ژنوم یوکاریوت‌ها، الگوی توارث هم‌بارز و تکرارپذیر بودن نتایج اشاره کرد. این مزایا سبب شده تا این نشانگر مولکولی به طور وسیع در تهیه نقشه‌های ژنتیکی، تخمین تنوع ژنتیکی، مطالعه روابط خویشاوندی و همچنین در برنامه‌های به‌نژادی در گیاهان مورد استفاده قرار گیرد. از جمله معایب این نشانگر پیچیدگی و صرف هزینه و وقت زیاد را می‌توان نام برد (نقوی و همکاران، 1384). در جنس شبدر، از این نشانگرها تنها در آنالیز ژنوم گونه‌های T. pratense و T. repens استفاده شده است Sato et al.,2005)؛ Dias et al., 2008؛ Zhang et al.,2007؛ Zhang, 2010). Sato و همکاران (2005) و Zhang و همکاران (2007) با استفاده از نشانگرهای SSR به ترتیب نقشه ژنتیکی T. pratense و T. repens را تهیه نمودند. همچنین، تنوع ژنتیکی در T. pratense با استفاده از صفات ریخت‌شناختی و نشانگرهای SSR (Dias et al., 2008) و در T. repens بر پایه صفات ریخت‌شناختی، نشانگرهای SSR وRAPD (Zhang, 2010) ارزیابی شده است. بررسی منابع نشان می‌دهد که تاکنون تحقیقاتی در زمینه جداسازی، شناسایی و تعیین ردیف بازی توالی‌های تکراری ساده گونه‌های
T. resupinatumو T. fragiferumانجام نشده است. به منظور رفع کمبود اطلاعات موجود در‌ این زمینه می‌توان اقدام به جداسازی و توالی‌یابی این جایگاه‌های ژنی کرد و یا نسبت به بررسی انتقال‌پذیری آغازگرهای توالی‌های تکراری ساده (SSR) به دست آمده از گونه‌های خویشاوند در این گونه‌ها پرداخت. در این پژوهش، با توجه به کم هزینه‌تر بودن، سادگی و سرعت روش اخیر و همچنین تعدد مکان‌های توالی‌های تکراری ساده شناخته شده در دو گونه T. pratense و T. repens، انتقال‌پذیری آغازگرهای این دو گونه به ژنوتیپ‌های T. resupinatum و T. fragiferum به منظور بررسی میزان شباهت ژنتیکی این دوگونه ارزیابی شد و ریزماهواره‌های تکثیر شده به عنوان ریزماهواره‌های جدید در گونه‌های T. resupinatum و T. fragiferumمعرفی گردید.

مواد و روش‌ها

در این تحقیق، 19 جمعیت خودرو شامل 8 جمعیت از T. fragiferum و 11 جمعیت از T. resupinatum ارزیابی شد. نمونه‌های جمعیتی به گونه‌ای انتخاب شد که تمامی دامنه پراکنش این گونه‌ها در ایران را پوشش دهد. مشخصات مربوط به این جمعیت‌ها در جدول 1 نشان داده شده است. نمونه‌ها در فصول رویشی سال‌های 1388 و 1389 به صورت بذر و نمونه هرباریومی توسط مؤلف جمع‌آوری و نمونه‌های سند به هرباریوم دانشگاه اصفهان (HUI) سپرده شد. نمونه‌ها بر اساس کلید ارائه شده در فلورا ایرانیکا (Heller, 1984) شناسایی شدند. بذرها در شرایط گلخانه‌ای کشت و DNA ژنومی از برگ‌های تازه و جوان استخراج گردید. استخراج DNA از این جمعیت‌ها با روش CTAB تغییر یافته (Lefort and Douglas, 1999) انجام گرفت.

غلظت DNA استخراج شده، توسط الکتروفورز افقی، مشاهده بر روی ژل آگاروز 8/0 درصد و مقایسه با الگوی نشانگر مولکولی Lambda III (λ3) با وزن مولکولی مشخص به عنوان شاهد ارزیابی شد.

در این تحقیق، 22 جفت از آغازگرهای مشترک بین T. pratense و T. repens که با احتمال بیشتری قادر به تکثیر ریزماهواره‌ها و بیان تنوع ژنتیکی جمعیت‌های T. resupinatum و T. fragiferum هستند، انتخاب شدند (جدول 2). انتخاب این آغازگرها بر اساس اشتراک بین دو گونه T. pratense و
T. repens، چندشکلی و فراوانی آللی بالا صورت گرفت.

جدول 1- مشخصات نمونه‌های جمعیتی مطالعه شده از گونه‌های T. fragiferumو T. resupinatum. HUI = هرباریوم دانشگاه اصفهان

تاکسون	کد تاکسون	شماره هرباریومی	تاریخ جمع‌آوری	ارتفاع از سطح دریا (متر)	محل جمع‌آوری
T. fragiferum var. fragiferum	Tff1	17836 HUI	31/04/1389	2108	تهران: فیروزکوه به پلور، ارجمند
	Tff2	17835 HUI	29/05/1388	0	گلستان : گلوگاه به گرگان، روستای النگ
	Tff3	17838 HUI	14/05/1388	1250	آذربایجان غربی: 20 کیلومتری اهر به مشکین شهر، روستای نقاره کوب
	Tff 4	17847 HUI	01/05/1388	1929	لرستان: شول آباد
T. fragiferum var. pulchellum	Tfp1	17830 HUI	14/05/1388	1250	آذربایجان غربی: 20 کیلومتری اهر به مشکین شهر، روستای نقاره کوب
	Tfp2	17833 HUI	29/04/1389	0	مازندران: بهمنیر به قائم شهر
	Tfp3	17834 HUI	12/05/1388	1300	کردستان: 60 کیلومتری پیرانشهر از سردشت، نرسیده به موسالان
	Tfp4	17839 HUI	14/05/1388	1770	آذربایجان غربی: دامنه سبلان، 8 کیلومتری آبگرم قینرجه و موئیل
T. resupinatum var. resupinatum	Trr1	17895 HUI	25/02/1388	110	خوزستان: 5 کیلومتری جاده اندیمشک به شوش
	Trr2	17897 HUI	08/03/1388	1303	گلستان: علی آباد، سه راه کبودوال
	Trr3	17901 HUI	21/03/1389	79	گیلان: 17 کیلومتری رشت از قزوین- روستای جوکلبندان
T. resupinatum var. microcephalum	Trmi1	17893 HUI	25/02/1388	94	خوزستان: 20 کیلومتری جاده اندیمشک به شوش
	Trmi2	17892 HUI	11/03/1388	330	مازندران: زیرآب به فیروزکوه، 4 کیلومتری زیرآب
	Trmi3	17894 HUI	25/03/1389	43	گیلان: رضوانشهر
T. resupinatum var. majus	Trma5	17903 HUI	27/02/1388	828	خوزستان: کیلومتر 5 جاده ایذه به دهدز
	Trma1	17887 HUI	08/03/1388	200	گلستان: علی آباد به آزادشهر، ابتدای جاده زرین گل
	Trma2	17890 HUI	02/05/1388	1488	لرستان: درود
	Trma3	17886 HUI	25/02/1388	879	لرستان: بعد از پل دختر- بین تنگ فنی و روستای ولیعصر
	Trma4	17883 HUI	27/01/1389	424	خوزستان: باغ ملک به رامهرمز، بعد از رود زرد

به منظور بهینه‌‌سازی، یعنی تعیین غلظت‌‌های مناسب مواد واکنش و دمای مناسب اتصال آغازگرها (T_a, annealing temperature) جهت به دست آوردن محصول PCR مناسب، غلظت اجزای واکنش PCR (یون منیزیم، غلظتDNA و آغازگرها) و نیز دمای اتصال در شرایط مختلف برای هر یک از آغازگرها جداگانه توسط PCR گرادیان تعیین شد و سپس با بررسی محصول PCR بهترین غلظت و مناسب‌ترین دما انتخاب گردید. محدوده گرادیان دمایی حداکثر بین 8± درجه سانتیگراد پایین‌ترین دمای ذوب توصیه شده برای هر زوج آغازگر در نظر گرفته شد. برای هر زوج آغازگر یک محدوده دمایی بهینه از حداقل تا حداکثر دمای بهینه تعیین گردید (شکل 1(، به طوری که دربردارنده دمای بهینه اتصال برای هر دو گونه باشد. بنابراین، فرآیند PCR برای هر دو گونه به طور هم‌زمان انجام شد. از 22 زوج آغازگر SSR استفاده شده، 13 زوج از آنها دارای محصول PCR مشخص و منفرد نبودند و یا نتوانستند قطعات DNA را تکثیر کنند. به همین دلیل نشدند (جدول 2). 9 زوج آغازگر که در PCR گرادیان دارای محصول PCR مشخص بودند انتخاب و فرآیند PCR پس از تعیین دمای مناسب برای آنها انجام شد.

شکل 1- تعیین دمای بهینه اتصال زوج آغازگر RCS-1225 بر روی ژنوم T. fragiferum و T. resupinatum

جدول 2- توالی 22 زوج آغازگر نشانگرهای SSR آزموده شده در 19 جمعیت از گونه‌های T. fragiferumو T. resupinatum. * آغازگرهایی که توانستند در این مطالعه ریزماهواره‌های مورد نظر را تکثیر کنند.

نام آغازگر	ردیف قطعه تکراری (motif)	توالی آغازگر پیرو (′3 → ′5) (reverse primer)	توالی آغازگر پیشرو (′3 → ′5) (forward primer)
RCS0883 *	AAG	GAAGAGATAGCTTGCCTTGGA	CACGTTACTCAATTTGGATCTTTG
RCS0907	AAC	TGGGGAAGTGAAGGATGTTC	ATTTGAGCACAAGGCCTCAC
RCS1479	AG	ATCAACTCGATGGGAACACC	TTTTCTGGCGACGAATTAGG
RCS2773	AAG	GATTTCGATCCTCCTCCTCC	AATAACAATATGCGGCTTTGC
RCS0033	AAT	GCAGATTATGAGGAATAACATTG	AAATTATCATTTTGCAAATTTTA
RCS2343	AC	TTCAATCGGGAGTGTCAGTG	CGATTGCTACAAACACAGCC
RCS1735 *	AAC	GGTGCTAGCTCCAACCTCAG	CCTGCTCCGTACCATTGTTT
RCS2667 *	AAG	GGTGGTGTTGCTGATTACGA	CCTCAGCAGAATCTTCACCC
RCS1920*	AAG	CCCCCAAAATACAAAACCCT	GAGAAAAGAAAGAAGTCTCTGAAGGA
RCS1928 *	AGC	CCTTTCAGAACAGATGGCGT	TACCCTCTTGAGCACCCATT
RCS2202 *	AC	CGGCAGACGAAGTGACAAAT	GCCGATATTGCTAGGTTGGA
RCS1225 *	ATC	CTCGCTGAAGGAGGAAACAG	TGCAAACTCCGCTTTATGC
RCS1737	ATC	AGCTCAAGCTCAACGGACAT	GGCACGAGGCACACTACTTC
RCS1518	ATC	CGAAGCAGGTTGGAAAACAT	GCACGAGGCACACACTACTT
RCS0843	GGAT	TTGGCATCTCAAAGCTGAAA	GCCAAGCCCACCAATACATA
RCS3666 *	AC	TCTGTTTCTTGTCTCGGCCT	CATGGCTGCCTGAGGTTAAT
RCS3052	AAC	CACTAATTCAGACCACCAGCA	TCGGTGAGCTGTGACTAACG
RCS1327	ATC	AAACAAACCAAGCAGCACCT	ACGGTGGAATTATGGGATGA
RCS0793	AAG	TTCAACATGCAGGCTAAGAAAA	CGCAATCTTTCTTCTCATTTCA
RCS1897 *	AAAG	ATGAGCACCTTCACCAATCC	CATGTCAGCATATCCATTTTCC
TRSSRATS054	-------	AATCACGACGAGCGACAACA	GACACCGATTATGTGCAAGA
TRSSRATS055	-------	TCTCTGCTTCGCGTCTTCTC	CAATACAATCACCGCACCAG

به طور خلاصه، واکنش PCR در حجم نهایی 25 میکرولیتر حاوی 250 نانومول از هر آغازگر، مخلوط dNTP با غلظت 2/0 میلی‌مولار، کلرید منیزیم با غلظت 5/1 میلی‌مولار، 2/1 واحد آنزیمTaq polymerase و 50 تا 100 نانوگرم DNA ژنومی از نمونه‌های مطالعه شده، انجام شد. برنامه PCR به این ترتیب بود: 94 درجه سانتیگراد 4 دقیقه؛ 20 دور با 94 سانتیگراد 1 دقیقه، 1 دقیقه در حداکثر دمای اتصال بهینه، 72 درجه‌ سانتیگراد 1 دقیقه؛ 15 دور با 94 سانتیگراد 1 دقیقه، 1 دقیقه در حداقل دمای اتصال بهینه، 72 سانتیگراد 1 دقیقه؛ در پایان، 10 دقیقه در دمای 72 درجه.

تفکیک باندهای حاصل ابتدا روی ژل آگاروز 2 درصد حاوی اتیدیوم بروماید با ولتاژ 100 ولت انجام شد و تهیه عکس با استفاده از دستگاه UV transiluminator صورت گرفت. برای تفکیک دقیق‌تر باندها از روش الکتروفورز عمودی با ژل پلی‌آکریل‌آمید 12 درصد استفاده شد. رنگ‌آمیزی ژل پلی‌آکریل‌آمید با نیترات نقره و ظهور باندها به وسیله هیدروکسید سدیم انجام شد.

تحلیل باندها با در نظر گرفتن هر شماره باند به عنوان یک صفت انجام گرفت. در ارزیابی تاکسونومی عددی هر باند با دو حالت وجود (1)/غیاب (0) ارزیابی شد. دندروگرام با استفاده از ضریب Dice، Jaccard (J) و Simple Matching (SM) ترسیم شد. به منظور سنجش میزان انطباق دندروگرام رسم شده با ماتریس تشابه، میزان همبستگی کوفنتیک برای هر کدام از ضرایب فوق، محاسبه شد. دندروگرام رسم شده با نرم‌افزار NTSYS_pc2 بر اساس ضریب جاکارد، بیشترین میزان همبستگی (73/0= r) را نشان داد. بنابراین، از این ضریب برای رسم دندروگرام به روش UPGMA استفاده شد. البته تفاوت‌های معنی‌داری در گروه‌بندی‌ها در دندروگرام‌های حاصل از این ضرایب مشاهده نشد. رسته‌بندی توده‌ها نیز با استفاده از تجزیه به مؤلفه‌های اول و دوم (PCA, Principle Coordinate Analysis) به وسیله نرم‌افزار GenAlex6 انجام شد.

بحث و نتیجه‌گیری

از میان 22 جفت آغازگر مورد آزمایش، 9 جفت توانستند 46 آلل در جمعیت‌های گونه T. fragiferumو 56 آلل درجمعیت‌های گونه T. resupinatum تکثیر کنند (جدول 3) که بسیاری از این آلل‌ها بین دو گونه مشترک هستند. این نتیجه می‌تواند بیانگر شباهت زیاد ژنوم این دو گونه باشد.

از میان این آغازگرها، زوج آغازگر RCS1928 که قطعاتی از DNA گونه‌های T. fragiferum و
T. resupinatumرا تکثیر نمود، چه در درون‌گونه‌ها و چه در بین دو گونه، تنوعی نشان نداد (شکل‌های2 و 3) که نشان می‌دهد این ریزماهواره در بخش‌هایی از ژنوم واقع شده است که در طول تکامل، توالی‌های خود را به شدت حفظ نموده است. زوج آغازگر RCS3666 در درون هر دو گونه تنوعی نشان نداد، ولی در بین دو گونه قطعات متفاوتی را تکثیر کرد که گویای وجود تفاوت ژنومی در این ناحیه از DNA دو گونه است (شکل‌های 2 و 3). زوج آغازگرهای RCS1920 و RCS1897 با این که در گونه T. fragiferumتنوعینشان ندادند (شکل 2)، ولی در گونه T. resupinatumبه خوبی چندشکلی را آشکار ساختند (شکل 3). بنابراین، می‌توان چنین نتیجه گرفت که نقاطی از ژنوم که دربردارنده این ریزماهواره‌هاست در گونه
T. fragiferum در نواحی حفاظت شده واقع شده، در حالی که در گونه T. resupinatum در مسیر تکامل دستخوش تغییراتی شده است. به بیان دیگر، این ریزماهواره‌ها در بخش‌هایی از DNA واقع شده‌اند که در بین دو گونه از حیث ساختار و عملکرد متفاوت هستند. زوج آغازگر RCS2667 در گونه
T. fragiferumتنوعی نشان نداد، اما یکی از جمعیت‌های این گونه (Tff4)، دو آللی را که این آغازگر تنها برای گونهT. resupinatumتکثیرکرده بود، نشان داد که می‌تواند بیانگر ردپایی از نفوذ گذشته باشد (شکل 2، باندهای مربوط روی تصویر با پیکان نشان داده شده است).

جدول 3- مقایسه نتایج حاصل از تکثیر 9 نشانگر SSR در 19 جمعیت از گونه‌های T. fragiferumو T. resupinatum

ردیف	نام آغازگر	محدوده دمای اتصال بهینه (درجه سانتیگراد)	شبدر توت‌فرنگی (T. fragiferum)		شبدر ایرانی (T. resupinatum)
ردیف	نام آغازگر	محدوده دمای اتصال بهینه (درجه سانتیگراد)	اندازه قطعات (bp)	تعدادآلل‌ها	اندازه قطعات (bp)	تعدادآلل‌ها
1	RCS0883	55-47	230 - 150	11	230 - 150	12
2	RCS1225	52-48	250 - 190	5	250 - 190	5
3	RCS1735	52-46	310 - 180	11	310 - 180	8
4	RCS1920	52-46	310 - 220	4	360 - 220	11
5	RCS1928	58-50	250 - 205	4	250 - 205	4
6	RCS2667	52-48	200 - 190	3	200 - 190	4
7	RCS3666	52-48	230 - 200	2	190	1
8	RCS2202	51-48	120 - 90	4	120 - 90	5
9	RCS1897	52-48	260 - 240	2	295 - 240	6
				46 =		56 =

شکل 2- الگوی چندشکلی حاصل از تکثیر 9 نشانگر SSR در 8 جمعیت از گونه T. fragiferum

شکل 3- الگوی چندشکلی حاصل از تکثیر 9 نشانگر SSR در 11 جمعیت از گونه T. resupinatum

سایر آغازگرها در هر دو گونه تنوع در خور ملاحظه‌ای نشان دادند. همان طور که دردندروگرام حاصل از تحلیل باندها (شکل 4) مشاهده می‌شود، در بیشتر موارد، میزان شباهت بین جمعیت‌ها اندک است. با توجه به سیستم زادآوری در این دو گونه که اغلب از نوع خودلقاحی (autogamy) است (Taylor and Gillett, 1988)، انتظار می‌رود که کم بودن جریان ژنی بین جمعیت‌ها سبب افزایش تنوع ژنتیکی بین جمعیت‌ها و به همان نسبت کاهش تنوع در درون جمعیت‌ها شود که دندروگرام حاصل از این تحقیق به روشنی این مطلب را نشان داد.

در دندروگرام حاصل از نشانگرهای SSR، دو گونهT. fragiferumوT. resupinatum در سطح 43 درصد کاملاً از هم جدا شدند و جمعیت‌های مربوط به هر گونه بر روی یک خوشه مجزا قرار گرفتند (شکل 4) که این گروه‌بندی با طبقه‌بندی تاکسونومیک این گونه‌ها مطابقت دارد (Zohary and Heller, 1984).

همان طور که دندروگرام (شکل 4) نشان می‌دهد، گونه T. fragiferumاز نظر جغرافیایی دو گروه همپوشان را تشکیل داد: خزانه ژنی شمال-شمال‌غرب و خزانه ژنی غرب-شمال‌غرب، که این دو خزانه ژنی در ناحیه شمال‌غرب همپوشانی دارند. به نظر می‌رسد که این گونه از شمال‌غرب ایران و به احتمال زیاد از کشور ترکیه وارد ایران شده، در دو مسیر متفاوت، به سمت شمال و غرب در امتداد رشته کوه‌های البرز و زاگرس پراکنش یافته است. پراکنش این گونه در امتداد ساحل دریاچه شور ارومیه، مؤید قابلیت بالای این گونه در سازش با محیط‌های پر تنش به ویژه خاک‌های شور و قلیایی است. در گونهT. resupinatumدو گروه جغرافیایی مجزا شامل خزانه ژنی شمال-شمال‌شرق و غرب-جنوب‌غرب مشاهده شد. این گروه‌بندی، منطبق با پراکنش جغرافیایی ناشی از سازگاری این گونه با محیط است. البته آثاری از نفوذ خزانه ژنی غرب-جنوب‌غرب در خزانه ژنی شمال-شمال‌شرق نیز مشاهده می‌گردد که با توجه به فاصله مکانی بین این خزانه‌های ژنی، به احتمال زیاد این اختلاط ناشی از دخالت انسان به واسطه انتقال بذر باشد. این نتایج را در آنالیز مؤلفه‌های اصلی (PCA) نیز به وضوح می‌توان مشاهده کرد (شکل 5).

دندروگرام حاصل از نشانگرهای SSR سطوح فروگونه‌ای (واریته‌ها) را به وضوح از هم جدا نکرد و این نشان می‌دهد که این نشانگر در جنس Trifoliumدر سطوح فروگونه‌ای کارآیی چندانی ندارد (شکل 4).

شکل 4- دندروگرام UPGMA بر مبنای میزان شباهت‌های حاصل از تحلیل داده‌های SSR با استفاده از ضریب جاکارد (J) در میان 19 جمعیت از گونه‌های T. fragiferumو T. resupinatum.N = شمال، NE = شمال‌شرق، NW = شمال‌غرب، W = غرب و SW = جنوب‌غرب. جمعیت‌هایی که توسط دایره احاطه شده‌اند نفوذی‌های خزانه ژنی غرب-جنوب‌غرب در خزانه ژنی شمال-شمال‌شرق در گونه
T. resupinatumهستند.

شکل 5- رسته‌بندی 19 جمعیت از گونه‌های T. fragiferumو T. resupinatum بر اساس دو مؤلفه اصلی اول (PCA) بر مبنای میزان شباهت‌های حاصل از تحلیل داده‌های SSR.N = شمال، NE = شمال‌شرق، NW = شمال‌غرب، W = غرب و SW = جنوب‌غرب.

نتایج حاصل از این مطالعه، حاکی از سطح بالای چندشکلی و انتقال‌پذیری ریزماهواره‌های معرفی شده برای T. pratense و T. repens به گونه‌های
T. fragiferumو T. resupinatumاست. بالا بودن انتقال‌پذیری نشان می‌دهد که این گونه‌ها از نظر ژنتیکی به هم نزدیک هستند و پس از جدایی، ژنوم‌ آنها تغییرات زیادی را متحمل نشده‌اند. بنابراین، می‌توان از نشانگرهای مولکولی SSR مربوط به گونه‌های نزدیک به یکدیگر برای ارزیابی و تحلیل ژنوم در گونه‌های مختلف این جنس استفاده نمود. بر این اساس، تا زمانی که جفت آغازگرهای SSR اختصاصی برای T. fragiferumو T. resupinatum طراحی نشده است، می‌توان با ضریب اطمینان بالایی از آغازگرهای SSR به دست آمده از T. pratense و T. repens برای بررسی تنوع ژنتیکی آنها استفاده نمود.

از طرفی، به دلیل این که در این پژوهش استخراج DNA ژنومی به صورت جمعیتی انجام گرفت، امکان محاسبه تنوع درون جمعیتی و برون جمعیتی و مقایسه آنها به صورت عددی وجود نداشت. لذا، با توجه به اهمیت این دو گونه زراعی و مرتعی مطالعه دقیق‌تر تنوعات درون و برون جمعیتی در این دو گونه با استفاده از نشانگر SSR و یا سایر نشانگرهای مولکولی پیشنهاد می‌گردد.

مراجع

منابع

جود، وی. اس.، کمپبل، سی. اس.، کلوگ، ای. اِی. و استیونس، پی. اف. (1382) سیستماتیک گیاهی. ترجمه سعیدی، ح. الف، انتشارات جهاد دانشگاهی، واحد صنعتی اصفهان، اصفهان.

زمانیان، م. (1384) بررسی اثر فصل کاشت بر تولید علوفه گونه‌های شبدر. نهال و بذر 21: 159-173.

عباسی، م. ر. (1387) بررسی تنوع در خزانه‌های ژنتیکی شبدر ایرانی (T. resupinatum) موجود در بانک ژن گیاهی ملی ایران. تحقیقات ژنتیک و اصلاح گیاهان مرتعی و جنگلی ایران 16(1): 37-49.

عباسی، م. ر. و زمانیان، م. (1384) بررسی پتانسیل تولید، صفات مهم در عملکرد و گروه‌بندی ژرم‌پلاسم شبدرهای ایرانی چند چین. اولین همایش ملی گیاهان علوفه‌ای کشور، کرج.

نقوی، م.، قره یاضی، ب. و حسینی سالکده، ق. (1384) نشانگرهای مولکولی. انتشارات دانشگاه تهران، تهران.

Dias, P. M. B., Julier, B. Sampoux, J. P., Barre, P. and Dall’Agnol, M. (2008) Genetic diversity in red clover (Trifolium pratense L.) revealed by morphological and microsatellite (SSR) markers. Euphytica 160: 189-205.

Ellison, N. W., Liston, A., Steiner, J. J., Williams, W. M. and Taylor, N. L. (2006) Molecular phylogenetics of the clover genus (Trifolium-Leguminosae). Molecular Phylogenetics and Evolution 39: 688-705.

Fehr, W. R. (1987) Principles of cultivar development. vol. 1. Theory and technique. McGraw Hill, New York.

Heller, D. (1984) Trifolium. In: Flora Iranica. (ed. Rechinger, K. H.) 157: 275-325. Akademische Druck-u., Verlagsanstalt, Graz.

Lefort, F. and Douglas, G. C. (1999) An efficient micro-method of DNA isolation from mature leaves of four hardwood tree species Acer, Fraxinus, Prunus and Quercus.Annales of Forest Science 56: 259-263.

Sato, S., Isobe, S., Asamizu, E., Ohmido, N., Nakamura, Y., Kaneko, T., Sakurai, N., Okumura, K., Klimenko, I., Sasamoto, S., Wada, T., Watanabe, A., Kohara, M., Fujishiro, T. and Tabata S. (2005) Comprehensive structural analysis of the genome of red clover (Trifolium pratense L.). DNA Research 12: 301-364.

Taylor, N. L. (1985) Clover science and technology. Madison, Wisconsin.

Taylor, N. L. and Gillett, J. M. (1988) Crossing and morphological relationships among Trifolium species closely related to strawberry and persian clover. Crop Science 28: 636-639.

Zhang, X., Zhang, Y., Yan R., Han, J., Hong, F., Wang, J. and Cao, K. (2010) Genetic variation of white clover (Trifolium repens L.) collections from China detected by morphological traits, RAPD and SSR. African Journal of Biotechnology 9(21): 3032-3041.

Zhang, Y., Sledge, M. K. and Bouton, J. H. (2007) Genome mapping of white clover (Trifolium repens L.) and comparative analysis within the Trifolieae using cross-species SSR markers. Theor Appl Genet. 114: 1367–1378.

Zohary, M. and Heller, D. (1984) The genus Trifolium. The Israel Academy of Science, Jerusalem.

آمار

تعداد مشاهده مقاله: 616

تعداد دریافت فایل اصل مقاله: 407

سامانه مدیریت نشریات علمی. قدرت گرفته از سیناوب

پیوندهای مفید

اخبار و اعلانات

آمار

بررسی تاکسونومی عددی Trifolium resupinatum L. (شبدر ایرانی) و Trifolium fragiferum L. (شبدر توت‌فرنگی) با استفاده از ریزماهواره‌های جدید