Microscopical, macroscopical and chemical investigations and their uses in chemotaxonomy of Crataegus pontica C. Koch

مقدمه

بیش از 280 گونه از جنس Crataegus (Ching-Yeeet al., 2010) در سراسر جهان، شامل اروپا، خاور میانه، آسیای جنوب شرقی و آمریکای شمالی وجود دارد (Raul et al., 2009). این جنس در ایران دارای پراکندگی زیادی است و 17 گونه آن در ایران وجود دارد (مظفریان، 1375). گیاه زالزالک گرجی با نام علمی Crataegus pontica C. Koch گونه‌ای متعلق به این جنس است (Ozcan et al., 2005). از گیاهان این جنس به طور وسیع در طب سنتی و گیاه درمانی کشورهای اروپایی برای درمان برخی از بیماری های قلبی-عروقی استفاده می‌شود (فارماکوپه گیاهی ایران، 1381؛ (Xiao-Ping et al., 2010. آثار درمانی گونه‌های زالزالک به خاطر ترکیبات پلی‌فنلیک موجود در آن است (Xiao-Ping et al., 2010). عصاره این گیاه غنی از فلاونوئید و اسیدهای هیدروکسی سینامیک است (Predrag et al., 2005). بیشتر محصولات حاصل از برگ و گل این گیاه بر اساس فلاونوئید تام آن استاندارد شده‌اند (Wieland et al., 2008). نوع، میزان و درصد فلاونوئیدها نشانه کیفیت گیاه است (Urbonaviciute et al., 2006). کلمه فلاونوئید از واژه لاتین فلاوس به معنای زرد رنگ مشتق شده است (Goodwin, 1976)، تا کنون بیش از هزاران ترکیب از دسته فلاونوئیدها از گیاهان مختلف شناسایی و استخراج شده است (Craker and Simon, 1992). آثار بیولوژیک متعددی را در گیاهان به فلاونوئیدها نسبت می‌دهند. این ترکیبات نقش دفاع در برابر پاتوژن‌های گیاهی (Street and Cockburn, 1972)، تأثیرگذار در متابولیسم کربوهیدرات‌ها و همچنین، نقش احتمالی در فتوسنتز را دارا هستند (Goodwin, 1976; Harborne et al., 1976).

الگوی کیفی و کمّی فلاونوئیدها به طور مشخص در شناسایی سیستماتیک شیمیایی استفاده می‌شود (Husain et al., 1982; Ringl et al., 2007). این ترکیبات به طور گسترده‌ای نسبت به سایر ترکیبات ثانویه در گیاهان پراکندگی دارند، در نتیجه استفاده از آنها به عنوان مارکر در مطالعات سیستماتیک شیمیایی محدود نیست. علاوه بر این، به نظر می‌رسد فلاونوئیدها جزو پایدارترین مواد مؤثره گیاهی باشند و همچنین تغییرات کیفی آنها در سطح گونه‌ها بسیار محدود است. همچنین، این ترکیبات معمولاً به راحتی شناسایی می‌شوند (Lai Fang et al., 2001). با توجه به موارد فوق، فلاونوئیدها بیش از همه ترکیبات ثانویه گیاهی در مطالعات تاکسونومی استفاده می‌شوند (Svehlikova et al., 2002; Albach et al., 2005;Husain et al., 1982).

زالزالک گرجی با نام علمی C. pontica C. Koch درختی است با ارتفاع 6 تا 10 متر که دارای ساقه باریک و محکم با پوست قهوه‌ای مایل به خاکستری و دارای شکاف‌های عمیق طولی است و برگ‌های آن تخم‌مرغی-بادبزنی شکل است، دمبرگ آن کوتاه و گل آن سفید و میوه آن تقریباً کروی و به رنگ زرد طلایی (قهرمان، 1376) و نارنجی (Donmez, 2005, 2009) است. انتشار این گونه از ارمنستان و قفقاز و ایران تا ترکیه پیش می‌رود (ثابتی، 1373) و پراکندگی آن شامل قسمت‌های شمال غرب و غرب و مرکز ایران است (خاتمساز، 1371).

در این تحقیق به بررسی ریخت‌شناسی و فیتوشیمیایی مقدماتی گیاه پرداخته شد، سپس با بررسی کیفی و کمّی فلاونوییدها و اسیدهای هیدروکسی سینامیک موجود در آن به بررسی رابطه‌های سیستماتیک شیمیایی آن با گونه‌های C. monogyna Jacq.،C. melanocarpa M. Bieb.وC. curvisepala Lind. که در ایران موجود هستند و همچنین، گونه استاندارد دارویی آن یعنی
C. oxyacantha L. که در بیشتر نقاط دنیا از آن به عنوان داروی اصلی این جنس گیاهی استفاده می‌شود؛ پرداخته شد.

مواد و روش‌ها

جمع‌آوری گیاه: اندام‌های مختلف دارویی گیاه C. ponticaاز شهرستان ایوان غرب، در اردیبهشت و شهریورماه 1389 و 1390 جمع‌آوری شد. این شهر دارای طول جغرافیایی 46 و 17 دقیقه و عرض جغرافیایی 33 درجه و 49 دقیقه است، که در شمال غرب استان ایلام واقع شده و متوسط ارتفاع آن از سطح دریا 1170 است. منطقه ایوان غرب، منطقه‌ای از حوزه زاگرس با چین‌خوردگی‌های وسیع است (نوری، 1379). شناسایی سیستماتیک گیاه در دانشکده کشاورزی دانشگاه رازی کرمانشاه انجام پذیرفت.

خشک کردن نمونه‌ها: گیاهان پس از جمع‌آوری در سایه و در معرض جریان هوا خشک شدند. اندام‌های مختلف گیاهی شامل گل، برگ و میوه به قطعات کوچکتر تقسیم شده، پس از خشک شدن در محل خنک قرار گرفته تا از فساد و پوسیدگی آنها جلوگیری شود (عسگری، 1378؛ صمصام شریعت، 1372).

بررسی ماکروسکوپی: در بررسی‌های ماکروسکوپی، ویژگی‌های ظاهری گل، برگ و میوه گیاه C. ponticaمشخص و با گیاه C. oxyacantha مقایسه شد، سپس نمونه‌ها برای خشک کردن آماده شدند (Ghassemi Dehkordi et al., 1996).

شناسایی میکروسکوپی: به منظور انجام آزمایش‌‌های میکروسکوپی و خرده‌نگاری، پودر گل و برگ گیاهان مورد مطالعه، توسط روش‌های میکروسکوپی معمول و با استفاده از محلول کلرال هیدراته بررسی شد (Ghassemi Dehkordi et al., 1996; Eschrich, 1986).

آزمایش‌های فیتوشیمیایی: با توجه به وجود فلاونوئیدها و اسیدهای هیدروکسی سینامیک به عنوان اصلی‌ترین مواد متشکله گیاه، بررسی دقیق‌تر، شامل شناسایی و تعیین کمّی بر روی این دسته از مواد گیاه صورت گرفت.

عصاره‌گیری: پودر اندام‌های مختلف در دمای 60 درجه سانتیگراد مخلوط و در داخل یک ارلن عصاره‌گیری و سپس صاف گردید (Wagner et al., 1999).

کروماتوگرافی لایه نازک (TLC): با بهره‌گیری از روش کروماتوگرافی لایه نازک و استفاده از فاز ثابت سیلیکاژل 60G و فاز متحرک اتیل استات- فرمیک‌اسید-اسید استیک گلاسیال-آب (100-11-11-27) اقدام به کاشت عصاره حاصله از مرحله قبل بر روی صفحات شد. پس از گسترش حلال بر روی صفحات از معرف Natural product/Polyethylenglycol 4000 برای ظهور لکه‌های فلاونوئیدی موجود در گیاه استفاده شد (Wagner et al., 1999).

تعیین کمّی فلاونوئیدها (فلاونول‌ها) بر اساس هیپروزید: با استناد به وجود فلاونول گلیکوزیدها در گونه‌های گیاه زالزالک گرجی (Wagner, 1988; Wichtl, 1989) و با استفاده از روش مندرج در فارماکوپه گیاهی ایران، درصد فلاونوئیدهای قسمت‌های مختلف گیاه اندازه‌گیری شد (احمدی، 1374؛ فارماکوپه گیاهی ایران، 1381؛Ghassemi Dehkordi and Ghannadi, 1993) هر تعیین مقدار سه مرتبه تکرار گردید.

2/0 گرم از اندام مورد نظر گیاه را در بالن ریخته، مخلوطی از 1 میلی‌لیتر متنامین یا هگزامتیلن تتراآمین 5/0درصد در آب، 20 میلی‌لیتر استون و 2 میلی‌لیتر اسید کلریدریک 25 درصد به آن افزوده شد و پس از رفلاکس به مدت نیم ساعت، صاف شده و در یک بالن ژوژه 100 میلی‌لیتری ریخته و مجدداً پودر در دو مرحله و هر بار ده دقیقه با 20 میلی‌لیتر استون رفلاکس و به مخلوط قبلی اضافه گردید و نهایتاً با استون به حجم رسانده شد. به 20 میلی‌لیتر از این محلول، مخلوطی از 20 میلی‌لیتر آب و 15 میلی‌لیتر اتیل استات اضافه شد و پس از به هم زدن، فاز اتیل استانی به یک ارلن 50 میلی‌لیتر منتقل گردید. فاز آب و استون نیز در سه مرحله و هر بار با 10 میلی لیتر اتیل استات استخراج شد و فازهای اتیل استاتی به اتیل استات قبلی افزوده گردید.

مجموعه فازهای اتیل استاتی، دوبار و هر مرتبه با 50 میلی لیتر آب مخلوط و تکان داده شده (دکانته)، در نهایت در یک بالن 50 میلی‌لیتری به حجم رسانده شد. به 10 میلی‌لیتر از این محلول، 1 میلی‌لیتر از محلول 2 درصد کلرور آلومینیوم در استیک اسید 5 درصد در متانول افزوده گردید و در یک بالن ژوژه 25 میلی‌لیتری به حجم رسانده شد. جذب محلول حاصله پس از نیم ساعت در طول موج 425 نانومتر در مقابل محلول شاهد اندازه‌گیری و با استفاده از فرمول تجربی (1)، درصد فلاونول‌ها بر اساس هیپروزید محاسبه گردید. برای تهیه محلول شاهد، 10 میلی‌لیتر از محلول نمونه اتیل استاتی در بالن ژوژه 25 میلی‌لیتری ریخته و با محلول 5 درصد استیک اسید در متانول به حجم رسانده شد. جذب محلول یک درصد از هیپروزید معادل 500 در نظر گرفته شد. جذب محلول یک درصد از هیپروزید معادل 500 در نظر گرفته شد و از این فرمول تجربی برای محاسبه فلاونول ها در گیاه استفاده گردید.

فرمول تجربی (1):

 = درصد فلاونول‌ها بر اساس هیپروزید

نتایج

نتایج ماکروسکوپی: نتایج حاصل از بررسی ماکروسکوپی در جدول شماره 1 گزارش شده است.

نتایج میکروسکوپی: نتایج حاصل از این بررسی در شکل شماره 1 آورده شده است.

نتایج حاصل از کروماتوگرافی لایه نازک عصاره‌: طبق روش ارائه شده در قسمت مواد و روش‌ها، پس از انجام کروماتوگرافی وجود لکه‌هایی با R_f معادل 35/0، 45/0 و 55/0 در مخلوط گل و برگ
C. oxyacanthaو C. pontica اثبات شد که با توجه به رنگ لکه در طول موج 365 نانومتر و مقایسه R_f و رنگ حاصله با استانداردهای موجود، این لکه‌ها به ترتیب مربوط به روتین، کلروژنیک اسید و هیپروزید است (Wagner et al., 1999).

نتایج حاصل از تعیین کمّی فلاونول‌های گیاهی: نتیجه حاصل از اندازه‌گیری میزان فلاونوییدها طبق روش کار در جدول 2 ارائه شده است.

جدول 1- ویژگی‌های ظاهری گیاهان C. ponticaوC. oxyacantha

شکل 1- خرده‌نگاری پودر اندام هوایی گیاه C. pontica. (1 از برگ در نمای عرضی با تریکوم غیر ترشحی نوک تیز؛ (2 اپیدرم برگ در نمای سطحی با شکل موّاج همراه با کریستال‌های اگزالات کلسیم؛ (3 اپیدرم برگ همراه با با روزنه های هوایی آنموسیتیک؛ (4 گرده‌های گل سه گوش با سطح خارجی پرزی، از نوع tricolpat؛ (5 بافت اپیدرم گلبرگ؛ (6 تریکوم‌های غیرترشحی، خمیده و کِرِم رنگ؛ (7 ذرات کریستال مکعبی به صورت منفرد؛ (8 بافت اندوتسیوم که در محلول کلرال هیدراته سرد قرمز رنگ است.

جدول 2-درصد فلاونول‌ها در گیاهان مورد بررسی