بررسی روابط و تنوع درون گونه‌‌ای‌ Hordeum vulgare L. (جو زراعی و خودرو) در ایران با استفاده از داده‌های سیتولوژی

مقدمه

Hordeum، جنسی تک‌نیا با گونه‌های یک‌ساله یا چندساله در طایفة Triticeae است (Blattner, 2004). از نظر سطح پلوئیدی، این جنس دارای 28 تاکسون دیپلوئید (14x=2n=2)، 16 تاکسون تتراپلوئید (28x=4n=2) و 8 تاکسون هگزاپلوئید (42x=6n=2)، با عدد پایه کروموزومی 7x= است. در موارد نادری به علت از دست دادن یا مضاعف شدن کروموزوم‌ها، گونه‌هایی با اعداد کروموزومی آنیوپلوئید نیز مشاهده شده‌اند. گونه‌های دیپلوئید شامل گونه‌های زراعی و خودرو، ولی گونه‌های تتراپلوئید و هگزاپلوئید همگی خودرو هستند(Bothmer et al., 1991; Shewry, 1992). در جنس Hordeum الگوی روابط خویشاوندی به سبب حضور چندین ژنوم پیچیده است. در سطح دیپلوئیدی چهار ژنوم اصلی X، Y، I و H وجود دارند. دو گونة H. vulgare و H. bulbosum در داشتن ژنوم I که در هیچ یک از گونه‌های دیگر جنس Hordeum وجود ندارد مشترک هستند (Bothmer et al., 1991).

در مورد منشأ و مبدأ جو اختلاف نظرهای زیادی وجود دارد. منشأ این گیاه کوه‌های زاگرس در غرب ایران، آناتولی جنوبی و فلسطین ذکر شده است (Shewry, 1992). با آگاهی از وابستگی و ارتباط گونه‌های جنس Hordeum و نیز بین این جنس و سایر جنس‌ها، اطلاعات مهمّی را بر پایة صفات مورفولوژی، عدد کروموزومی، آنالیز کاریوتیپ‌ها، قابلیت تلاقی گونه‌ها، رفتار کروموزومی در میوز و جفت شدن کروموزوم‌ها در دورگه‌های بین گونه‌ای می‌توان به دست آورد. برای جو زراعی یک مسیر واضح یا یک شجره‌نامه مشخص نمی‌توان ترسیم کرد. از سال 1950 میلادی با اطلاعاتی که از طریق تاکسونومی، سیتوتاکسونومی، باستان‌شناسی، تاریخ، اکولوژی، جغرافیا و ژنتیک به دست آمده است، تعدادی مسیرهای تکاملی برای گونه‌های خودرو و زراعی جو و همچنین در مورد منشأ گونه‌های زراعی از جو خودرو
H. spontaneum C. Koch ارائه شده است
(Nilan, 1964).

گونة Hordeum vulgare L. دارای دو زیرگونة‌ subsp. vulgare L. به عنوان جو زراعی و زیرگونة subsp. spontaneum C. Koch به عنوان جو خودرو است. در مورد وضعیت تاکسونومیک جو زراعی و جو خودرو اختلاف نظر وجود داشته است؛ به طوری‌که در بررسی‌های اولیه، به صورت گونه‌‌های مجزا در نظر گرفته شده‌اند (Bor, 1970; Tutin et al., 1980; Komarov, 1985). اما بر اساس آخرین بازنگری این گونه‌ها به عنوان دو زیرگونه از گونة H. vulgareمعرفی شدند (Bothmer, 1991)

جو زراعی(Hordeum vulgare subsp. vulgare L.) از نظر اقتصادی مهم‌ترین تاکسون در این جنس محسوب شده، در تمام مناطق معتدل دنیا کشت می‌شود. این گونه از نظر غذایی، مرتعی و دارویی مصارف گوناگونی دارد و به دلیل دارا بودن سیکل کوتاه زندگی و خصوصیات مورفولوژیک، فیزیولوژیک و ژنتیکی مناسب به عنوان سیستم مدل برای آزمایش‌های مختلف به کار می‌رود. این زیرگونه دارای دو واریتة دوردیفه (distichon) و شش ردیفه (hexastichon) است.

جو خودرو(Hordeum vulgare subsp. spontaneum C. Koch) به عنوان خزانة وراثتی و اجدادی جو زراعی محسوب می‌شود و به تدریج و ضمن جهش و اهلی شدن، جوِ زراعی را تولید کرده است. این زیرگونه در رویشگاه‌های اولیة خود در هلال حاصلخیزی از ترکیه تا جنوب غرب آسیا رشد می‌کند (Harlan and Zohary, 1966). همچنین، در رویشگاه‌های ثانویه مانند نواحی مدیترانه‌ای، زمین‌های متروک و کنار جاده نیز رویش دارد. هلال حاصلخیزی به عنوان مرکز پیدایش و تنوع‌یابی جو خودرو معرفی شده و منطقة متنوعی از نظر آب و هوا، ارتفاع و رویشگاه‌ است. سازگاری‌های مورفولوژیک، فیزیولوژیک و عملکردی زیرگونة spontaneum متناسب با زیستگاه‌های مختلف در مهاجرت و استقرار این تاکسون در رویشگاه‌های اولیه و ثانویه در محدودة وسیعی از محیط‌های متنوع مؤثر بوده است. تنوع زیادی که در این زیرگونه مشاهده می شود، بیشتر به خاطر وجود درصد بالایی از دگرگشنی (بیش از 10-12%) نسبت به زیرگونة زراعی (معمولاً کمتر از 1%) در این گونه است. جو خودرو دارای محور سنبلة شکننده و شامل 2 ردیف سنبلک است. سنبلک‌ها بلند و سیخک پوشینة اولیه (Lemma) خاردار است.

در میان گیاهان طایفة Triticeae، مطالعات زیادی در زمینه سیتولوژی گونه‌های مختلف جنس Hordeum انجام شده است (Vahidy et al., 1993). مطالعات کروموزومی توسط Kihara در سال 1924 در گونة
H. vulgare انجام گرفت. وی نشان داد که این گونه‌، دیپلوئید (14 =x2 = n2) و دارای عدد پایه کروموزومی 7 = x است (Darlington and Wylie, 1961). Sheidai و Rashid (2007) سطح دیپلوئید و عدد پایه کروموزومی 7 = x را تأیید کردند، اما برخی از محققان آن را گونه‌ای تتراپلوئید (28 =x4 = n2) دانسته‌اند. اغلب کروموزوم‌های مشاهده شده در آن مطالعه متاسانتریک و ساب متاسانتریک بودند. آن‌ها معتقد بودند که تفاوت در فرمول کاریوتیپی به علت تغییرات ساختاری کروموزوم اتفاق می‌افتد.

کلیة بررسی‌های کروموزومی انجام شده در زیرگونة spontaneum ، آن را دیپلوئید با عدد پایه کروموزومی 7 x= دانسته‌اند. Morrison (1959) با ارائة کاریوتیپ برای H. spontaneum و مقایسة آن‌ با
H. vulgare نشان داد که کاریوتیپ آن‌ها به طور آشکار و دقیقی با یکدیگر مشابه‌اند، اما Oinuma (1953) توانست تفاوت‌هایی را در ساختار کروموزوم‌ها بین این گونه‌ها با یک پیش تیمار متفاوت نشان دهد. این پیش تیمار دمای پایین در هنگام جوانه زدن بذر بود که با استفاده از این روش Mechelke (1955) و Schwantiz و Pirson (1955) نشان دادند که کروموزوم‌های گونة زراعی بزرگتر از کروموزوم‌های گونه‌های خودرو است (Nilan, 1964). کاریوتیپ این زیرگونه دارای چهار جفت کروموزوم متاسانتریک، یک جفت کرومورزوم ساب متاسانتریک و دو جفت کروموزوم ماهواره‌دار است (Linde-Laursen et al., 1992).

در ایران نیز مطالعات مختلفی برای تعیین عدد پایه کروموزومی این دو زیرگونه به ویژه جو زراعی انجام شده است که آن‌ها را دیپلوئید با 14 کروموزوم معرفی کرده‌اند (صاحبی، 1380 و یزدان‌ستا، 1381).

در حال حاضر، مطالعة ویژگی‌های سیتولوژیکی گیاهان زراعی یک ضرورت محسوب می‌شود و جو نیز به عنوان یک غلة مهم از این امر مستثنی نیست. هدف از انجام این پژوهش ،انجام مطالعات کروموزومی، تهیه کاریوتیپ و تجزیه و تحلیل ژنوم جمعیت‌های مورد مطالعه و مقایسه و تفکیک آن‌ها بر اساس اطلاعات کاریوتیپی و کروموزومی است.

مواد و روش‌ها

مطالعة عدد کروموزومی بر پایة مشاهدة میتوز سلول‌های مریستمی انتهای ریشه که دارای قدرت تقسیم سریع و اندیس میتوزی بالا هستند، صورت گرفت. بدین منظور، در مجموع 30 جمعیت از تاکسون‌های متعلق به گونة H. vulgareبررسی گردیدند. این جمعیت‌ها از بین کلیة جمعیت‌های جمع‌آوری شده به عنوان شاخص، به گونه‌ای انتخاب شدند که در برگیرندة تمامی نواحی پراکش این گونه‌ها بودند. بنابراین، از هر جمعیت،10 بذر به صورت تصادفی انتخاب شد. بذرها را به مدت 24 ساعت روی کاغذ صافی مرطوب در ظرف پتری قرار داده، به منظور جذب آب در دمای اتاق (25 درجه سانتی‌گراد) و تاریکی قرار داده شدند. در این شرایط اکثر بذرها طی 2-3 روز جوانه زدند. سپس بذرهایی با طول ریشه 5/1- 2 سانتی‌متر انتخاب و در ساعت مناسب، ریشه‌ها از بذرها جدا گردید. مطالعه کروموزوم‌ها به روش له کردن مریستم انتهای ریشه (Squash Method) انجام گرفت. بدین منظور ریشه‌ها به مدت 6-4 ساعت در محلول آلفا برمونفتالین قرار داده شدند. برای حفظ شکل سلول‌ها ﻭ ﻣﺤﺘﻮﻳﺎﺕ ﺁﻧﻬﺎ ﻭ ﺟﻠﻮﮔﻴﺮﻱ ﺍﺯ ﺗﻐﻴﻴﺮﺍﺕ ﺍﺣﺘﻤﺎﻟﻲ ﺍﺯ ﻣﻮﺍﺩ ﺗﺜﺒﻴﺖﻛﻨﻨﺪﻩ، استفاده ﻣﻲﺷــﻮﺩ. از جمله محلول‌های تثبیت‌کننده محلول Levitskey بوده که حاوی کرومیک اسید 1% و فرمالدهید 10% به نسبت مساوی است(Sharma and Sharma, 1999). ریشه‌های خارج شده از آلفابرمونفتالین‌، پس از شستشو با آب مقطر، به مدت 24-36 ساعت در این محلول در یخچال قرار داده شد.

بعد از خروج ریشه‌ها از محلول تثبیت‌کننده، به مدت 3 ساعت ریشه‌ها با آب جاری شستشو داده شد و بعد از خشک کردن با کاغذ صافی، برای نگهداری ریشه‌ها به ﻣﺪﺕ طولانی، از ﺍﻟﻜﻞ ﺍﺗﻴﻠﻴﻚ ۷۰ ﺩﺭﺻﺪ استفاده شد. ﺑﺮﺍﻱ ﺗﻬﻴﻪ ﻧﻤﻮﻧﻪ ﻣﻴﻜﺮﻭﺳﻜﻮﭘﻲ ﻻﺯﻡ ﺍﺳﺖ ﺑﺎﻓﺖﻫﺎﻱ ﻣﺬﻛﻮﺭ ﺑﺮﺍﻱ ﺍﺳﻜﻮﺍﺵ ﺁﻣﺎﺩﻩ شوند و ﻧﻤﻚﻫﺎﻱ ﭘﻜﺘﻴﻜﻲ ﺩﻳﻮﺍﺭﻩ ﺳﻠﻮﻟﻲ ﺣﻞ ﺷﺪﻩ، ﺗﺎ ﺍمکان ﺩﺳﺘﻴﺎﺑﻲ ﺑﻪ ﺳــﻠﻮﻝﻫﺎﻱ ﻣﻨﻔﺮﺩ ﻭ ﭘﺮﺍﻛﻨﺪﻩ ﺍﺯ ﺗﻮﺩﻩ ﺳﻠﻮﻟﻲ ﻓﺮﺍﻫﻢ ﮔﺮﺩﺩ. بدین منظور، ریشه‌ها جهت هیدرولیز، به مدت 10 دقیقه در دمای 60 درجه سانتی‌گراد در محلول NaoH 1 نرمال، در حمام آب گرم قرار داده شد. مطالعة شکل و ساختمان کروموزوم‌ها از طریق مشاهدة میکروسکوپی و با استفاده ار محلول‌ها و روش‌های خاص رنگ‌آمیزی امکان‌پذیر است. برای رنگ‌آمیزی، ریشه‌ها به مدت 24 ساعت در دمای 30 درجه سانتی‌گراد در حمام آب گرم، در محلول هماتوکسیلین قرار گرفتند. برای مطالعه شکل و ساختار کروموزوم‎‌ها از روش له کردن آنزیمی استفاده شد. ابتدا ریشه‌ها 2 بار و هر بار به مدت 10 دقیقه در محلول بافر آنزیم قرار داده شد و سپس به مدت 30-40 دقیقه در آنزیم سلولاز- پکتیناز در دمای 37 درجه قرار داده شد.

برای تهیه اسلایدهای کروموزومی، قسمت بالای کلاهک ریشه‌ها (سلول‌های مریستمی) جدا گردید و برای ﻧﺮﻡ ﻛﺮﺩﻥ ﺑﻴﺸﺘﺮ ﺑﺎﻓﺖ ﻭ ﻧﻔﻮﺫ ﺑﻬﺘﺮ ﺭﻧﮓ، ﻳﻚ ﻗﻄﺮﻩ ﺍﺳﺘﻴﻚ ﺍﺳﻴﺪ 45% ﻧﻴﺰ ﺭﻭﻱ ﻧﻤﻮﻧﻪ ﺭﻳﺨﺘﻪ شد ﻭ ﺳﭙﺲ ﺑﺎ ﻛﺎﻏﺬ ﺻﺎﻓﻲ ﺧﺸﻚ ﮔﺮﺩید. ﻣﺰﻳﺖ ﺩﻳﮕﺮ ﺍﻳﻦ ﻋﻤﻞ ﺁﻥ ﺍﺳﺖ ﻛﻪ ﺭﻧﮓﻫﺎﻱ ﺍﺿﺎﻓﻲ ﺍﺯ ﺳﻄﺢ ﺳﻴﺘﻮﭘﻼﺳﻢ سلول ﭘﺎﻙ ﺷﺪﻩ، ﺳﻴﺘﻮﭘﻼﺳﻢ ﺷﻔﺎﻑ ﻭ ﺑﻲﺭﻧﮓ ﺑﻪ ﻧﻈﺮ ﻣﻲﺭﺳﺪ. در این مرحله سلول‌های مریستمی با سوزن از هم جدا شد. سپس بر روی سلول‌های جدا شده، لامل گذاشته شد و با فشار ملایم انگشت شست، سلول‌ها له شد. سپس به منظور بررسی کروموزوم‌ها، سلول‌های مریستمی در زیر میکروسکوپ مطالعه شدند (Agayev, 2003).

در این مطالعه، برای بررسی شکل و ساختار کروموزوم‌ها و تهیه کاریوتیپ، اسلایدهای کروموزومی تهیه شده  در مرحله متافازی تقسیم میتوز با استفاده از عدسی‌های 10، 20 و 40 بررسی و بهترین سلول متافازی انتخاب شد. سپس با عدسی 100 میکروسکوپ Olympus BX40 عکس‌برداری شدند.

شناسایی کروموزم‌ها در جو با اندازه‌گیری طول آن‌ها، نسبت بازوها و فرورفتگی‌های ثانویه انجام شده است (Noda and Kasha, 1978). در جمعیت‌هایی که مورد مطالعه سیتولوژی قرار گرفتند، طول کل کروموزوم، طول بازوی کوتاه، طول بازوی بلند و نسبت طول بازوی بلند به بازوی کوتاه اندازه‌گیری شد. به منظور دسته‌بندی کروموزوم‌ها و تعیین محل سانترومر کروموزوم‌ها از طرح Levan و همکاران (1965) استفاده گردید. همچنین به منظور مقایسة جمعیت‌ها میانگین طول بازوهای بلند و کوتاه، میانگین طول کروموزوم‌ها، عدد دیپلوئید، فرمول کاریوتیپی، شاخص TF%، AsI%، A₁، A₂ و ضریب تنوع‌پذیری طولی کروموزوم (CV) نیز به منظور مقایسة تقارن کاریوتیپ جمعیت‌ها در هر زیرگونه محاسبه شد (جدول‌های 1و 2).

مشاهدات

در این مطالعه 30 جمعیت‌ مختلف گونة
vulgare H. منتخب از سراسر نواحی پراکنش این گونه در ایران  بررسی شدند و نتایج نشان‌دهندة این مطلب است که کلیة جمعیت‌های مطالعه شده دارای سطح دیپلوئید، عدد پایة کروموزومی 7x= و عدد کروموزومی 14= x2= n2 هستند که نتایج مطالعات اولیه در مورد این گونه را تأیید می‌کند، در حالی‌که با سایر نتایج که H. vulgare subsp. vulgare را تتراپلوئید معرفی کرده‌اند مغایرت دارد. از نظر ریخت‌شناسی، طول بازوها، وجود یا عدم ماهواره و فرمول کاریوتیپ در جمعیت‌ها تا حدودی تنوع مشاهده شد، ولی عدد کروموزومی در جمعیت‌های مختلف ثابت است.

در جمعیت‌های مطالعه شده از گونة H. vulgare، کروموزوم‌ تلوسانتریک و ساب‌تلوسانتریک مشاهده نشد. در خصوص فرمول کاریوتیپی، نتایج این تحقیق نشان داد که تقریباً در اکثر جمعیت‌ها 2 جفت کروموزوم ماهواره‌دار وجود دارد. همچنین، در جمعیت‌های شمارة S40W و S81W مربوط به زیرگونة spontaneum کروموزوم ماهواره‌دار مشاهده نگردید و کاریوتیپ این دو جمعیت‌ به صورت 7 جفت کروموزوم متاسانتریک مشاهده شد.

در این گونه، در ارتباط با طول کل کروموزوم‌ها (طول ژنوم) و میانگین طول کل کروموزوم‌ها تنوع مشاهده گردید. اختلاف موجود در طول کروموزوم‌ها تا حدودی نشان‌دهندة تغییرات ساختاری کروموزوم‌هاست. چنین تفاوتی ممکن است تنها با مبادله^ء‌ یک قطعه صورت بگیرد.

بزرگ‌ترین کروموزوم، حداکثر طول ژنوم (72/158)، حداکثر میانگین طول کل کروموزوم‌ها (33/11) و حداکثر میانگین بازوی بلند (64/6) در جمعیت شمارة S93SW و کوچک‌ترین کروموزوم، حداقل طول کل کروموزوم‌ها (22/104)، حداقل میانگین طول کل کروموزوم‌ها (44/7)، حداقل میانگین بازوی کوتاه (01/3) و حداقل میانگین بازوی بلند (31/4) در جمعیت شمارة S33N، مشاهده شد. میانگین نسبت بازوی بلند به بازوی کوتاه در جمعیت شمارة D215NW، حداکثر (66/1) و در جمعیت S203W حداقل (21/1) بود (جدول 1).

مقایسة کاریوتیپ جمعیت‌های یک گونه از طریق مقایسة تقارن آنها انجام می‌گیرد. لذا در این مطالعه TF%  به عنوان شاخص تقارن محاسبه گردید. حداکثر TF% با اندازه‌ 45% در جمعیت شمارة S40W و حداقل میزانTF% ، 36% در جمعیت شمارة D215NW مشاهده شد (جدول 1). بنابراین، جمعیت متعلق به غرب کشور از زیرگونة spontaneum با فرمول کاریوتیپی 7m و بدون حضور ماهواره، متقارن‌ترین کاریوتیپ (تعداد کروموزوم‌هایی با سانترومر میانی در این جمعیت بیشتر از سایر جمعیت‌هاست) و جمعیت جمع‌آوری شده از شمال غرب کشور متعلق به زیرگونة vulgare با فرمول کاریوتیپی 4m+1sm نامتقارن‌ترین کاریوتیپ را در بین جمعیت‌های مطالعه شده نشان می‌دهد.

با توجه به نتایج به دست آمده برای ضریب A₁، زیرگونة vulgare واریتة hexastichon دارای نامتقارن‌ترین کاریوتیپ بوده، زیرگونة spontaneum بیشترین تقارن را نشان می‌دهد (جدول 2). بنابراین، این نظریه که جو خودرو به عنوان اجداد جو زراعی در نظر گرفته شده، تأیید می‌شود. ضریب A₂ نشان‌دهندة تنوع و نامتقارن بودن بین جمعیت‌های هر تاکسون است. طبق نتایج حاصل، زیرگونة spontaneum تنوع بیشتری بین جمعیت‌ها نشان می‌دهد که در نتیجة خودرو بودن و دگرگشنی این گونه نسبت به جو زراعی است.

پهنة میتوزی و کاریوتیپ مربوط به جمعیت‌های زیر گونة spontaneum در شکل 1 و جمعیت‌های متعلق به زیر گونة vulgare در شکل‌های 2 و3 نشان داده شده است.

جدول 1- تحلیل کاریوتیپ جمعیت های مختلف گونة H. vulgare

جدول 2- مقایسة میانگین ضریب تنوع‌پذیری و شاخص‌‌های تقارن در تاکسون‌های متعلق به H. vulgare

شکل 1- پهنه میتوزی وکاریوتیپ جمعیت‌ 206 زیرگونة vulgare subsp. spontaneum H.

شکل 2- پهنه میتوزی و کاریوتیپ جمعیت‌های‌ 71 زیرگونة vulgare subsp. vulgare var. distichon  H.

شکل 3- پهنه میتوزی و کاریوتیپ جمعیت‌‌ 12 گونة vulgare subsp. vulgare var. hexastichon  H.