بررسی تأثیر محیط کشت، منبع آهن (Fe-EDHHA) و کاربرد سامانه کشت بیوراکتوری در ریزازدیادی پایه رویشی CAB 11E

مقدمه

گونه‌های مختلف جنس Prunus از مهم‌ترین گیاهان مثمر در سراسر جهان به‌شمار می‌آیند (Druart, 2013). در باغبانی نوین، ارقام مختلف گیلاس، آلبالو و آلو معمولاً بر روی پایه‌های رویشی پیوند می‌خورند (Hartmann et al., 2017). به عبارت دیگر، استفاده از پایه‌های رویشی از دو جنبه حائز اهمیت است؛ نخست آن‌که ارقام با رشد رویشی زیاد را می‌توان بر پایه‌های کوتاه‌تر پیوند زد و از این طریق، عملیات داشت، برداشت و مدیریت باغ را تسهیل کرد (Bolandi et al., 2016; De Salvador et al., 2001). دوم آن‌که این پایه‌ها، متناسب با هدف تولیدکننده، قابلیت سازگاری با شرایط اقلیمی و خاکی مختلف را داشته و می‌توانند مقاومت مناسبی در برابر آفات و بیماری‌ها از خود نشان دهند؛ ازاین‌رو، ارقام تجاری متناسب با شرایط هر منطقه بر روی آن‌ها پیوند زده می‌شوند (Sotirov & Dimitrova, 2022).

یکی از چالش‌های اصلی باغ‌های گیلاس در کشور، رشد رویشی بیش از حد درختان بر روی پایه‌های رایج است که عمدتاً از پایه‌های بذری آلبالوی تلخ تشکیل شده‌اند (Ganji Moghadam et al., 2008). به‌منظور دستیابی به درختانی کوتاه‌قد، یکنواخت و با عملکرد بالا، استفاده از پایه‌های رویشی پاکوتاه و نیمه‌پاکوتاه امری ضروری به‌شمار می‌آید (Gyeviki, 2005).

پایه‌های رویشی گیلاس و آلبالو معمولاً از گونه‌های Prunus avium،P. cerasus  و P. mahaleb یا از دورگه‌هایی میان این گونه‌ها و گونه‌های P. fruticosa، P. canescens، P. pseudocerasus،P. incisa ، P. dawyckensis و P. serrulata اصلاح و انتخاب می‌شوند (De Salvador et al., 2001). یکی از پایه‌های جدید معرفی‌شده، رقم CAB 11E است که در دانشگاه بولونیا (ایتالیا) اصلاح شده است. این پایه نیمه‌پاکوتاه بوده و از ویژگی‌هایی نظیر توانایی رشد در خاک‌های سنگین و مقاومت به بیماری فیتوفتورا برخوردار است. با این وجود، این پایه نسبت به خشکی حساس بوده و از گرده‌افشانی مطلوبی برخوردار است. از مهم‌ترین مزایای پایه‌های گروهCAB ، سازگاری بالای آن‌ها با ارقام تجاری مختلف گیلاس و آلبالو گزارش شده است (Sansavini & Lugli, 2009). روش‌های متداول تکثیر پایه‌های گیلاس شامل قلمه‌گیری و کشت بذری است. از سوی دیگر، این روش‌ها با محدودیت‌هایی از جمله ظرفیت محدود تکثیر، وابستگی به شرایط محیطی و دشواری دستیابی به تعداد زیاد گیاهچه‌های یکنواخت همراه هستند. افزون بر این، تکثیر توسط بذر منجر به بروز تنوع ژنتیکی در نسل جدید می‌شود که برای تولید پایه‌های یکنواخت مطلوب نیست. در مقابل، ریزازدیادی به‌عنوان روشی کارآمد و پیشرفته برای تکثیر پایه‌های رویشی مطرح است. این روش که مبتنی بر کشت بافت گیاهی است، مزایای متعددی از جمله تولید گیاهچه‌های همسان با گیاه مادری، تضمین سلامت و اصالت نهال‌ها، امکان تولید گیاهان عاری از ویروس (در صورت سلامت گیاه مادری)، کیفیت بالای گیاهچه‌ها و تولید انبوه از تعداد محدودی گیاه مادری را فراهم می‌آورد. ازاین‌رو، ریزازدیادی به یکی از روش‌های رایج در تکثیر پایه‌های رویشی در سطح جهان تبدیل شده است (Clapa et al., 2013; Druart, 2013; Sarropoulou et al., 2013).  Mahdavian et al.  (2011) گزارش کردند که محیط کشت DKW حاوی 5/0 میلی­گرم در لیتر BA بهترین محیط برای پرآوری پایه‌یSL-64  (Prunus mahaleb L.) است. همچنین، نتایج آن‌ها نشان داد که مناسب‌ترین محیط برای پرآوری و ریشه‌زایی پایه‌ی PHL-A به‌ترتیب محیط MS حاوی 5/0 میلی‌گرم در لیتر BA و محیط DKW بدون تنظیم‌کننده‌های رشد می‌باشد (Mahdavian et al., 2011). در پژوهش دیگر، جهت بررسی اثر پلی‌آمین‌ها بر ریزازدیادی پایه‌ی CAB-6P مشخص شد که بیشترین تعداد و درصد پرآوری شاخه در غلظت 1 میلی‌گرم در لیتر اسپرمیدین و بیشترین تعداد و درصد ریشه‌زایی به‌ترتیب در غلظت‌های 1 و 2 میلی‌گرم در لیتر پوترسین حاصل شد (Sarropoulou et al., 2013). در بسیاری از گیاهان زراعی نشان داده شده است که جایگزینی منبع متداول آهن شامل FeSO₄ به همراه نمک دی‌سدیم اسید اتیلن‌دی‌آمین‌تترااستیک (Na₂EDTA) به‌طور مستقیم با کمپلکس Fe-EDDHA، موجب بهبود تغذیه آهن در گیاه می‌شود (Molassiotis et al., 2003; Trejgell et al., 2012; Van der Salm et al., 1994). در میان پژوهش‌های منتشرشده، گزارش‌های متعددی درباره تأثیر جایگزینی ترکیبات آهن با کمپلکس Fe-EDDHA بر رشد و نمو درون‌شیشه‌ای (in vitro) گیاهان مختلف از جمله پاپایا، بلوبری، تمشک، فندق، زیتون، باپتیزیا و هلو وجود دارد (Hunková et al., 2018; Nikulina et al., 2020; Nikulina et al., 2021; Isachkin, 2020).به ظور کلی، از نظر نوع تغذیه و محل قرارگیری گیاهچه‌ها، کشت بافت به دو روش سنتی و بیوراکتوری انجام می‌شود. در روش سنتی، گیاهچه‌ها در محیط‌های نیمه‌جامد یا مایع در ظروف شیشه‌ای کشت شده و به‌طور مداوم در تماس با مواد غذایی قرار دارند (Nayyef et al., 2019). هرچند تولید گیاهان در شرایط درون‌شیشه‌ای نسبت به روش‌های سنتی تکثیر کارآمدتر است، امّا این فرایند همچنان پرهزینه، زمان‌بر و نیازمند نیروی انسانی زیاد است. جهت غلبه بر این محدودیت‌ها، استفاده از بیوراکتورهای گیاهی به‌عنوان روشی نوین برای مکانیزه کردن ریزازدیادی و کاهش هزینه‌ها مطرح شده است. نخستین گزارش استفاده از بیوراکتور در تکثیر گیاهان به سال 1981 و گیاه بگونیا باز می‌گردد (Takayama & Misawa, 1981). در گیاه زینتی Nerine که تکثیر طبیعی آن محدود است، استفاده از بیوراکتور موجب افزایش 6 تا 8 برابری رشد نسبت به محیط‌های مایع ثابت شد (Van der Salm et al., 1994). علاوه بر این، Akita et al. توسط یک بیوراکتور 500 لیتری موفق به تولید 6/64 کیلوگرم شاخساره از 460 گرم شاخساره اولیه گیاهچه استویا پس از یک ماه شدند (Akita et al., 1994). با توجه به افزایش نیاز کشور به پایه‌های رویشی عاری از ویروس و ناکافی بودن تولیدات موجود، توسعه و معرفی پایه‌های جدید ضروری به‌نظر می‌رسد. پایه‌ CAB 11E یکی از پایه‌های نوین است که می‌تواند برای برخی مناطق کشور مناسب باشد. از آن‌جا که این پایه به‌تازگی در ایتالیا اصلاح شده است، اطلاعات موجود درباره‌ی ریزازدیادی آن بسیار محدود است؛ بنابراین بررسی شرایط محیط کشت و روش مناسب برای تکثیر و سازگاری آن از اهمیت زیادی برخوردار است و می‌تواند نقش مؤثری در بهبود تولید پایه‌های رویشی ایفا کند. همچنین، در این پژوهش کشت گیاهچه‌ها در بیوراکتور با روش کشت سنتی مورد مقایسه قرار گرفته است.

مواد و روش ها

تهیه ریزنمونه و سترون سازی:

سرشـاخـه­هـای پــایه رویشی گیلاس و آلـبالـو، رقــم CAB E11 در فصل بهار، از بـاغ مادری برادران حسینی در شهرسـتان نظرآباد، اسـتان البرز ایران، جمع­آوری شدند. ریزنمونه‌ها شامل جوانه‌های جانبی و رأسی بوده و پس از شست‌وشوی اولیه با آب جاری، پیش‌سترون‌سازی آن‌ها با مایع ظرف‌شویی انجام گرفت. سپس ریزنمونه‌ها به‌ترتیب با اتانول 70 درصد به مدت 15 تا 30 ثانیه و هیپوکلریت سدیم 5/1 درصد به مدت 5 دقیقه سترون‌سازی شدند. پس از چند بار شست‌وشو با آب مقطر سترون، ریزنمونه‌ها به محیط کشت مرحله استقرار منتقل شدند. همه ریزنمونه‌ها در محیط کشت MS (Murashige & Skoog, 1962) حاوی 1 میلی­گرم بر لیتر هورمون BA کشت شدند. سطوح هورمونی مورد بررسی در این پژوهش بر اساس یافته‌ها و گزارش‌های پیشین در زمینه ریزازدیادی پایه‌های جنس Prunus و همچنین تجربیات و نتایج حاصل از فعالیت‌های آزمایشگاهی انجام‌شده پیش از اجرای این پژوهش در شرکت، انتخاب شدند.

پرآوری شاخه­ها:

ریزنمونه­های حاصل از رشد جوانه­ها به محیط­های کشت پایه MS، DKW (Driver et al., 1984) و WPM (Lloyd & Brent, 1980) حاوی 4 ترکیب هورمونی منتقل شدند (جدول 1). در این مرحله، برای هر تیمار ۵ شیشه کشت مورد استفاده قرار گرفت و در هر شیشه ۳ گیاهچه کشت شد؛ بنابراین، در مجموع ۱۵ گیاهچه برای هر تیمار مورد استفاده قرار گرفت. همچنین گیاهچه­ها به مدت 20 روز در دمای 2±22 درجه سانتی­گراد با طول روز 16 ساعت نگهداری شدند. در پایان این مرحله، طول شاخساره­ها و تعداد شاخساره اندازه­گیری شد. ضریب شاخه‌زایی به‌صورت میانگین تعداد شاخساره‌های جدید تولیدشده از هر ریزنمونه اولیه محاسبه شد؛ به‌طوری‌که شاخساره اولیه مورد استفاده به‌عنوان ریزنمونه در محاسبه لحاظ نشد و تنها شاخساره‌های جدید تشکیل‌شده طی دوره کشت شمارش شدند.

جدول 1- محیط‌های کشت پایه و ترکیب‌های هورمونی مورد استفاده در مرحله پرآوری شاخساره‌های پایه رویشی CAB 11E

Table 1- Basal culture media and plant growth regulator combinations used during the shoot multiplication stage of the CAB 11E rootstock

کشت در بیوراکتور:

بیوراکتورهـای مورد اسـتفاده در این پـژوهـش از نوع PLANTFORM (ایرلند) بودند. بیوراکتورها پیش از استفاده با اتوکلاو در دمای 121 درجه سانتی‌گراد به مدت 20 دقیقه سترون‌سازی شدند. در این مرحله از محیط کشت MS حاوی 1 میلی­گرم بـر لیتر BA و 1/0 میلی­گرم بـر لیتر IBA (بهترین محیط­کشت استفاده شده در کشت سنتی) بدون آگار در بیوراکتورها استفاده شد. در این آزمایش، چهار بیوراکتور، هر یک حاوی 30 گیاهچه (در مجموع 120 گیاهچه)، و چهار شیشه کشت سنتی، هر یک حاوی 3 گیاهچه (در مجموع 12 گیاهچه)، مورد استفاده قرار گرفتند؛ شرایط اتاق رشد مشابه شرایط کشت سنتی حفظ گردید. گیاهچه‌ها روزانه دو بار و هر بار به مدت 15 دقیقه تغذیه شده و هوادهی هر دو ساعت یک‌بار به مدت 15 دقیقه انجام گرفت. پس از گذشت 20 روز، گیاهچه‌ها برداشت شده و صفات رشدی مشابه مرحله قبل مورد ارزیابی و اندازه‌گیری قرار گرفتند (شکل 1).

شکل 1- کشت گیاهچه‌های پایه رویشی CAB 11E در سامانه بیوراکتور  PLANTFORM

Figure 1- Cultivation of CAB 11E rootstock plantlets in the PLANTFORM bioreactor system

ریشه­ زایی:

در این پژوهش محیط کشت VS (Van der Salm) که به‌عنوان یک نسخه اصلاح‌شده از محیط MS شناخته می‌شود و در آن FeSO₄ با کلات آهن قوی‌تر Fe-EDDHA جایگزین شده است، مورد استفاده قرار گرفت. ریشه‌زایی ساقه‌های طویل‌شده حاصل از مرحله پرآوری، در محیط‌های کشت پـایه MS و VS (Van der Salm et al., 1994) بـا غـلظت کامـل و نـصف غلظت عناصر درشت‌مغذی انجام شد. هر یک از این محیط‌ها حاوی سه غلظت 5/0، 1 و 5/1 میلی­گـرم بـر لیتر هورمون IBA بودند. همچنین برای هر تیمار 5 شیشه و در هر شیشه 7 گیاهچه کشت شد. پـس از 20 روز، طـول ریشه­هـای تشکیل شـده بـه 5 تـا 10 میلی­مـتر رسید و گیاهچه­ها برای مرحله سازگاری آماده شدند. ازسوی دیگر، جهت سازگاری، گیاهچه‌ها به بستری شـامل 35 درصد پیت­ماس، 35 درصد پرلیت و 30 درصـد کوکوپیت منتقل شدند. pH این بسـتر 5/5 بوده، از زهکشی مناسب و هدایت الکتریکی (EC) بسیار پائینی برخوردار بود.

بررسی­های آماری:

داده‌های حاصل از آزمایش‌ها توسط تجزیه واریانس مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. آزمایش‌های مربوط به بررسی اثر محیط کشت و ترکیب هورمونی بر طول شاخساره و ضریب شاخه‌زایی و همچنین اثر محیط کشت و IBA بر ریشه‌زایی، به‌صورت آزمایش‌های فاکتوریل در قالب طرح کامل تصادفی انجام شدند. همچنین در آزمایش مربوط به مقایسه سیستم‌های کشت، اثر سیستم کشت شامل دو سطح بیوراکتور و کشت سنتی بر طول شاخساره و ضریب شاخه‌زایی، در قالب طرح کامل تصادفی بررسی شد. در تحلیل‌های آماری، شیشه کشت یا بیوراکتور به‌عنوان واحد آزمایشی در نظر گرفته شد و میانگین صفات اندازه‌گیری‌شده در گیاهچه‌های موجود در هر واحد به‌عنوان یک مشاهده مستقل وارد تجزیه واریانس شد. داده‌ها با استفاده از نرم‌افزار R تجزیه و تحلیل شدند و مقایسه میانگین‌ها توسط آزمون چنددامنه‌ای دانکن انجام گرفت. همچنین نمودارها توسط نرم‌افزارGraphPad Prism ، نسخه 8، رسم شدند.

نتایج

نتایج حاصل از تجزیه واریانس داده‌ها نشان داد که اثر متقابل محیط­کشت و هورمون بر طول شاخساره و ضریب شاخه‌زایی در سطح 1 درصد (P≤0.01) معنی­دار بود (جدول 2). بیشترین ضریب شاخه­زایی مـربـوط بـه محیط کشت MS3 بـا 1 میلی­گرم بـر لیتر BA و 1/0 میلی­گرم بـر لیتر IBA بود که میانگین ضریب شـاخه­زایی 4/4 را نشان داد (شکل a 2 و 3). همچنین، گیاهچه‌های این تیمار با میانگین طول شاخساره 57/3 سانتی‌متر، بیشترین رشد طولی را به خود اختصاص دادند. با وجود این، بر اساس نتایج آزمون دانکن، اختلاف معنی‌داری بین این تیمار و محیط کشت MS1 با میانگین طول شاخساره 43/3 سانتی‌متر مشاهده نشد (شکل b 2). به‌طور کلی، در مقایسه عملکرد محیط­های پایه مختلف، محیط پایه MS کارایی بالاتری نسـبت بـه محیط­های DKW و WPM نشان داد.

جدول 2- نتایج تجزیه واریانس اثر محیط کشت و ترکیب هورمونی بر طول شاخساره و ضریب شاخه زایی

Table 2- Analysis of variance for the effects of culture medium and hormone composition on shoot length and shoot proliferation rate

شکل 2- ضریب شاخه‌زایی (a) و طول شاخساره (b) گیاهچه‌های پایه رویشی CAB 11E در محیط‌های پرآوری MS، WPM و DKW حاوی غلظت‌های مختلف BA و IBA. در هر محیط پایه، کدهای 1 تا 4 به‌ترتیب مربوط به 0.5، 1، 1 و 2 میلی‌گرم بر لیتر BA همراه با 0، 0، 1/0 و صفر میلی‌گرم بر لیتر IBA هستند. نوارهای خطا، انحراف معیار (SD) و حروف متفاوت، تفاوت آماری معنی‌دار بین تیمارها بر اساس آزمون دانکن در سطح احتمال 1 درصد (P≤0.01)  را نشان می‌دهند.

Figure 2- Shoot multiplication rate (a) and shoot length (b) of CAB 11E rootstock plantlets cultured on MS, WPM, and DKW multiplication media containing different concentrations of BA and IBA. Within each basal medium, codes 1–4 correspond to 0.5, 1, 1, and 2 mg L⁻¹ BA combined with 0, 0, 0.1, and 0 mg L⁻¹ IBA, respectively. Error bars represent standard deviation (SD), and different letters indicate statistically significant differences among treatments according to Duncan’s multiple range test at P≤0.01.

شکل 3- گیاهچه‌های پایه رویشی CAB 11E در شیشه‌های کشت تحت تیمارهای مختلف محیط کشت و ترکیبات هورمونی در مرحله پرآوری

Figure 3- CAB 11E rootstock plantlets cultured in jars under different culture media and plant growth regulator combinations during the shoot multiplication stage

نتایج تجزیه واریانس همچنین بیانگر آن بود که نوع سیستم کشت (بیوراکتور در مقایسه با کشت سنتی) اثر معنی‌داری بر ضریب شاخه‌زایی داشت (P≤0.01) در­حالی­که اثر آن بر طول شاخساره معنی­دار نبود (جدول 3). میانگین ضریب شاخه‌زایی (تعداد شاخساره به ازای هر ریزنمونه) در کشت بیوراکتوری 50/14 و در کشت سنتی 08/4 بود. بر این اساس، ضریب شاخه‌زایی در بیوراکتور حدود 55/3 برابر کشت سنتی بود (شکل‌های 4 و 5).

جدول 3- نتایج تجزیه واریانس اثر سیستم کشت (بیوراکتور و کشت سنتی) بر طول شاخساره و ضریب شاخه‌زایی

Table 3- Analysis of variance for the effect of culture system (bioreactor and conventional culture) on shoot length and shoot proliferation rate

شکل 4- ضریب شاخه‌زایی در سیستم‌های کشت بیوراکتور و کشت سنتی. ستون‌ها میانگین ± انحراف معیار را نشان می‌دهند. حروف متفاوت نشان‌دهنده تفاوت‌های آماری معنی‌دار بین میانگین‌ها بر اساس آزمون دانکن در سطح احتمال 1 درصد (P≤0.01) است.

Figure 4- Shoot proliferation rate in the bioreactor and conventional culture systems. Data are presented as mean ± standard deviation (SD). Different letters indicate statistically significant differences among means according to Duncan’s multiple range test at P≤0.01.

شکل 5- گیاهچه‌های پایه رویشی CAB 11E کشت‌شده در سامانه بیوراکتور PLANTFORM

Figure 5- CAB 11E rootstock plantlets cultured in the PLANTFORM bioreactor system

ساقه‌های طویل‌شده به‌منظور القای ریشه‌زایی به محیط‌های کشت پایه MS و VS با غلظت کامل و نصف غلظت عناصر درشت‌مغذی منتقل شدند که هر یک حاوی سه غلظت 5/0، 1 و 5/1 میلی­گرم بر لیتر هورمون IBA بودند. نتایج حاصل از تجزیه واریانس داده‌ها نشان داد که اثر متقابل هورمون و محیط کشت بر درصد ریشه­زایی معنی­دار بود (01/0P<) (جدول 4). بررسی مقایسه میانگین‌ها نشان داد که اگرچه افزایش غلظت IBA در برخی تیمارها موجب بهبود درصد ریشه‌زایی شد، امّا اختلاف بین غلظت‌های مختلف هورمون چندان چشمگیر نبود. در مقابل، نوع محیط کشت و به‌ویژه منبع آهن نقش تعیین‌کننده‌تری در القای ریشه‌زایی داشت. محیط VS که در آن FeSO₄ با کلات پایدارتر Fe-EDDHA  جایگزین شده است، در تمامی سطوح هورمونی درصد ریشه‌زایی بالاتری نسبت به محیط MS نشان داد. همچنین کاهش غلظت عناصر درشت‌مغذی به نصف، به‌طور معنی‌داری موجب افزایش ریشه‌زایی شد که احتمالاً به علت کاهش تنش اسمزی و بهبود جذب عناصر غذایی، به‌ویژه آهن، بوده است. بیشترین درصد ریشه‌زایی (1/97 درصد) در محیط VS با نصف غلظت عناصر درشت‌مغذی و 1 میلی‌گرم بر لیتر IBA مشاهده شد، در­حالی­که کمترین میزان (4/31) در محیط MS با غلظت عناصر درشت‌مغذی و 5/0 میلی­گرم بر لیتر IBA به‌دست آمد (شکل‌های 6 و 7). به نظر می‌رسد پایداری بیشتر و فراهمی بالاتر آهن در فرم Fe-EDDHA در محیط VS نسبت به FeSO₄ موجود در MS، می­تواند نقش مؤثرتری در بهبود فرایند ریشه‌زایی نسبت به تغییرات جزئی در غلظت هورمون داشته است.

جدول 4- نتایج تجزیه واریانس اثر محیط‌های کشت MS و VS با غلظت کامل و نصف غلظت عناصر درشت‌مغذی و غلظت IBA بر درصد ریشه‌زایی پایه رویشی CAB 11E

Table 4- Analysis of variance for the effects of MS and VS media with full- and half-strength macronutrients and IBA concentration on rooting percentage of CAB 11E rootstock

شکل 6- درصد ریشه‌زایی گیاهچه‌های پایه رویشی CAB 11E در محیط‌های کشت MS و VS با غلظت کامل و نصف غلظت عناصر درشت‌مغذی و غلظت‌های مختلف IBA. کدهای RMS1–RMS3، RVS1–RVS3، RHalfMS1–RHalfMS3 و RHalfVS1–RHalfVS3 به‌ترتیب نشان‌دهنده محیط‌های MS و VS با غلظت کامل و نصف غلظت عناصر درشت‌مغذی، همراه با 5/0، 1 و.5/1 میلی‌گرم بر لیتر IBA هستند. نوارهای خطا، انحراف معیار (SD) را نشان می‌دهند و حروف متفاوت نشان‌دهنده تفاوت آماری معنی‌دار بین تیمارها بر اساس آزمون دانکن در سطح احتمال 1 درصد(P≤0.01)  هستند.

Figure 6- Rooting percentage of CAB 11E rootstock plantlets cultured on MS and VS media containing full- and half-strength macronutrients and different concentrations of IBA. The codes RMS1–RMS3, RVS1–RVS3, RHalfMS1–RHalfMS3, and RHalfVS1–RHalfVS3 represent MS and VS media with full- and half-strength macronutrients, respectively, supplemented with 0.5, 1, and 1.5 mg L⁻¹ IBA. Error bars represent standard deviation (SD), and different letters indicate statistically significant differences among treatments according to Duncan’s multiple range test at P≤0.01.

شکل 7- ریشه‌دهی گیاهچه‌های پایه رویشی CAB 11E در محیط کشت VS حاوی نصف غلظت عناصر درشت­مغذی و 1 میلی‌گرم بر لیتر IBA. (RHalfVS2)

Figure 7- Rooting of CAB 11E rootstock plantlets in VS medium containing half-strength macronutrients and 1 mg L⁻¹ IBA (RHalfVS2)

بر اساس یافته‌ها، گیاهـانی که مـرحـله شـاخـه زایی را در بیوراکتور و شیشه طی کرده بودند، پس از ریشه‌دار شدن به مرحله سازگاری منتقل شدند. گیاهچه­های حاصل از بیوراکتور پس از 15 روز به‌طور کامل سازگار شدند، در­حالی­که گیاهچه‌های کشت‌شده به روش سنتی پس از 20 روز به‌طور کامل از پوشش سلفونی خارج شدند (شکل 8). تنها تفاوت مشاهده‌شده در عملکرد گیاهچه‌های ریشه‌دار در این مرحله، مدت زمان مورد نیاز برای سازگاری بین گیاهان پرآوری شده در بیوراکتور و گیاهان حاصل از کشت سنتی بود. فرایند سازگاری بدون تلفات انجام شد و درصد بقا در هر دو تیمار 100 درصد بود.

شکل 8- گیاهچه‌های پایه رویشی CAB 11E پس از سازگاری در شرایط گلخانه‌ای

Figure 8- Acclimatized CAB 11E rootstock plantlets under greenhouse conditions

بحث

پایه‌های درختان میوه نقش کلیدی در پاسخ‌گویی به نیازهای تولید، ایجاد باغ‌های یکنواخت و دستیابی به عملکرد بالا ایفا می‌کنند. با توجه به تفرق صفات ژنتیکی در دانه­رست حاصل از بذر، استفاده از پایه‌های رویشی به‌جای پایه‌های بذری از اهمیت ویژه‌ای برخوردار است (Hartmann et al., 2017). ازاین‌رو، در بسیاری از کشورها برنامه‌های اصلاح پایه‌ها متناسب با شرایط اقلیمی و اهداف تولیدکنندگان، با هدف دستیابی به ژنوتیپ‌هایی دارای صفات مطلوب طراحی و اجرا می‌شوند. پایه‌های رویشی به علّت القای زودباردهی، کنترل رشد رویشی (پاکوتاهی) و افزایش عملکرد، نسبت به پایه‌های بذری برتری قابل توجهی دارند (Arab & Shekafandeh, 2016). در این راستا، ریزازدیادی به‌عنوان کارآمدترین روش برای تکثیر انبوه، یکنواخت و سالم پایه‌های رویشی شناخته می‌شود(Sarikhani-khorami & Chehregani Rad, 2025). در پژوهش حاضر، توان ریزازدیادی پایه جدید CAB 11E مورد بررسی قرار گرفت و شرایط کشت آن بهینه‌سازی شد. همچنین سترون‌سازی موفق ریزنمونه‌ها از مراحل حساس ریزازدیادی به‌شمار می‌رود و انتخاب ماده ضدعفونی‌کننده، غلظت و مدت زمان تیمار باید متناسب با گونه گیاهی تنظیم شود. مواد مختلفی از جمله الکل، هیپوکلریت کلسیم، هیپوکلریت سدیم، کلرید جیوه و استون برای سترون‌سازی مواد گیاهی گزارش شده است (Boudabous et al., 2010). در این پژوهش، استفاده از اتانول و هیپوکلریت سدیم منجر به استقرار موفق ریزنمونه‌ها شد که با نتایج گزارش‌شده توسط Mastari Farahani et al. در سال (2021) همخوانی دارد. از سوی دیگر، محیط کشت MS یکی از پرکاربردترین محیط‌های پایه در کشت بافت گیاهی است و کارایی بالای آن در بسیاری از گونه‌های باغبانی به اثبات رسیده است. غلظت بالای نیتروژن و پتاسیم در این محیط، آن را به گزینه‌ای مناسب برای رشد و تکثیر گیاهان تبدیل کرده است (Safarnejad et al., 2016; Al-Eqabi & Al-Amery, 2025). در پژوهش حاضر نیز محیط کشت MS برای استقرار ریزنمونه‌ها مورد استفاده قرار گرفت. همچنین (2017) Sharma et al. در پژوهشی بر روی پایه Gisela5، بیشترین درصد استقرار (75 درصد) را در محیط MS حاوی 5/0 میلی­گرم بر لیتر BA و 5/0 میلی­گرم­بر لیتر GA3 گزارش کردند که نشان‌دهنده مناسب بودن این محیط برای پایه‌های جنس Prunus است. در مقابل، پژوهش (2025) Jonoubi et al. بالاترین درصد استقرار برای P. avium L. را محیط کشت WPM حاوی 1 میلی­گرم بر لیتر BA و 1/0 میلی­گرم بر لیتر IBA مشاهده کردند، که نتایج آن با یافته‌های مطالعه حاضر متفاوت است. مرحله شاخه‌زایی یکی از مهم‌ترین مراحل در ریزازدیادی پایه‌های رویشی محسوب می‌شود که کارایی آن تحت تأثیر برهم‌کنش ترکیب هورمونی و ترکیب یونی محیط کشت قرار دارد و معمولاً شاخص‌هایی نظیر ضریب شاخه‌زایی و رشد طولی شاخساره برای ارزیابی آن مورد استفاده قرار می‌گیرند (Sharma et al., 2017). در پژوهش حاضر، اثر متقابل محیط کشت و ترکیب هورمونی بر طول شاخساره و ضریب شاخه‌زایی معنی‌دار بود و بهترین عملکرد در محیط کشت MS حاوی 1 میلی‌گرم در لیتر BA و 1/0 میلی‌گرم در لیتر IBA مشاهده شد. هم‌افزایی مشاهده‌شده بین BA وIBA را می‌توان در چارچوب تعادل اکسین–سیتوکینین تفسیر کرد. بر اساس نظریه کلاسیک (1957) Skoog & Miller، نسبت اکسین به سیتوکینین یکی از عوامل تعیین‌کننده در جهت‌دهی ریخت­زایی در شرایط کشت درون‌شیشه‌ای است. سیتوکینین‌ها با تحریک تقسیم سلولی در ناحیه مریستم رأسی و فعال‌سازی ژن‌های مرتبط با چرخه سلولی موجب افزایش جوانه‌زایی جانبی می‌شوند، در حالی‌که حضور مقادیر کم اکسین با حفظ سازمان مریستمی و تنظیم انتقال قطبی اکسین، رشد طولی شاخساره‌ها را بهبود می‌بخشد (Taiz et al., 2015). بنابراین، حضور همزمان BA و IBA احتمالاً با ایجاد تعادل هورمونی مطلوب، سبب افزایش ضریب شاخه‌زایی و رشد طولی در رقم CAB E11 شده است. یافته‌های این پژوهش با نتایج  (2013) Sulusoglu & Cavusoglu  در P. laurocerasus همخوانی دارد؛ به‌طوری که افزودن IBA به محیط حاوی BA موجب افزایش قابل توجه ضریب شاخه‌زایی و رشد طولی شاخساره شد. همچنین (2017)Sharma et al.  در پژوهشی بر روی پایه Gisela5 گزارش کردند که حضور همزمان BA، GA3 و IBA بیشترین ضریب شاخه‌زایی را به‌دنبال داشت. نقش سیتوکینین BA در تحریک تقسیم سلولی در ناحیه مریستم رأسی و اثر هم‌افزایی آن با اکسین‌ها در بهبود شاخه‌زایی به‌خوبی شناخته شده است (Al-Eqabi & Al-Amery, 2025). با توجه به یافته‌ها، تغییرمحیط کشت پایه نیز یکی از راه‌های بهبود کیفیت و کمیت تولید‌های کشت بـافتی است. در پژوهش حاضر، محیط MSنسبت به محیط‌های DKW و WPM عملکرد بهتری نشان داد که این تفاوت را می‌توان به ترکیب نمکی و قدرت یونی بالاتر محیط MS نسبت داد. محیط MS دارای غلظت بالاتری از عناصر درشت‌مغذی، به‌ویژه نیتروژن کل (به‌صورت NH₄⁺ و(NO₃⁻ ، پتاسیم و کلسیم است که تقسیم سلولی و رشد رویشی را تقویت می‌کند(George et al., 2008)؛ نسبت آمونیوم به نیترات در این محیط بر تنظیم pH، جذب عناصر و متابولیسم نیتروژن اثرگذار است و می‌تواند در افزایش کارایی شاخه‌زایی نقش داشته باشد. در مقابل، محیط WPM با قدرت یونی پایین‌تر برای گونه‌های چوبی طراحی شده است (Lloyd & Brent, 1980) و ممکن است از نظر تأمین نیتروژن برای رقم مورد یررسی محدودکننده‌تر باشد.

همچنین پژوهش‌های پیشین نشان داد بالاترین میزان تکثیر شاخه و بیشترین تعداد شاخه‌های باززایی شده پایه رویشی GiSelA 17 توسط محیط کشت MS حاوی BAP (75/0 میلی‌گرم در لیتر) حاصل شد. در مقابل، کمترین میزان تکثیر و تعداد شاخه در محیط کشت WPM با BAP (25/0 میلی‌گرم در لیتر) و IBA (01/0 میلی‌گرم در لیتر) ثبت شد. بـرای شاخه‌زایی گیاهچه­های P. mahaleb آنها را در سه محیطMS ، WPM، وLP  (Quoirin & Lepoivre, 1977) با ترکیب هورمونی یکسان کشت کردند. در این پژوهش، ضریب شاخه­زایی در محیط کشت  LPضعیفترین عملکرد را داشت و محیط­هـای WPM و MS بدون تفاوت معنی­دار، به ترتیب بالاترین ضرایب شاخه­زایی را داشتند (Sota & Kongjika, 2014). یافته‌های این پژوهش با نتایج قبلی مطابقت دارد، که حداکثر تکثیر شاخه و تعداد شاخه درP. dulcis کشت شده در محیط کشت MS مشاهده شد (Kodad et al., 2021). در این پژوهش، با توجه بـه نتایج به دسـت آمده می­توان گفت که در کل محیط کشت MS تـأثیرمـثبت معنی­داری روی شاخه­زایی و پرآوری گیاهچه­هـای رقـم CAB E11 داشـته اسـت. از طرف دیگر، همانند بعضی از پژوهش‌های پیشین، حضور همزمان BA و IBA نیز سبب بهبود عملکرد گیاهچه­ها در این مرحله شده است. استفاده از بیوراکتورهای غوطه‌وری موقت PLANTFORM در ریزازدیادی گیاهان مختلف نتایج متفاوتی را نشان داده است. در برخی پژوهش‌ها، مانند بررسی (2020)Abahmane  بر روی ارقام مجول و Boufeggous نخل خرما، تفاوت معنی‌داری در ضریب شاخه‌زایی نسبت به کشت سنتی گزارش نشد؛ از سوی دیگر، (2019) Nayyef et al.  افزایش معنی‌دار شاخه‌زایی را در رقم برخی مشاهده کردند. همچنین در ریزازدیادی سیب‌زمینی نیز، کشت در بیوراکتور PLANTFORMموجب افزایش قابل توجه ضریب شاخه‌زایی نسبت به کشت شیشه‌ای شد. همچنین طول شاخ‌ها در این سیستم نسبت به روش سنتی افزایش قابل توجهی داشت (Al-Shareefi et al., 2020).

نتایج پژوهش حاضر نشان داد که استفاده از بیوراکتور تأثیر معنی‌داری بر طول شاخساره‌ها نداشت، امّا ضریب شاخه‌زایی به‌طور قابل توجهی افزایش یافت. این یافته احتمالاً ناشی از ترکیبی از عوامل عملیاتی و فیزیولوژیک سیستم غوطه‌وری موقت است. عواملی مانند هوادهی مناسب، زمان و تعداد دفعات غوطه‌وری، حجم محیط مایع و حجم محفظه کشت می‌توانند رشد جانبی شاخه‌ها را تحریک کنند. همان‌طور که (2002) Etienne & Berthouly اشاره کرده است، کارایی سیستم‌های غوطه‌وری موقت ناشی از تهویه مناسب بافت‌ها و تماس متناوب و کامل سطح بافت با محیط مایع است؛ ویژگی‌ مهمی است که در سایر سیستم‌های کشت مایع به‌طور همزمان وجود ندارد. تنظیم زمان و تناوب غوطه‌وری نقش مهمی در جذب مواد غذایی، کنترل هایپرهیدریسیته و بهبود کیفیت شاخساره­ها دارد. علاوه بر این، تهویه اجباری و تجدید کامل اتمسفر در بیوراکتور می‌تواند با کاهش رطوبت نسبی و افزایش تعرق، گیاهچه‌ها را برای شرایط برون‌شیشه‌ای آماده‌تر سازد (Teisson & Alvard, 1995). گیاهان حاصل از سیستم‌های غوطه‌وری موقت معمولاً در مرحله سازگاری عملکرد بهتری نسبت به گیاهان تولیدشده در محیط‌های نیمه‌جامد یا مایع ایستا نشان می‌دهند (Etienne & Berthouly, 2002). این برتری می‌تواند به آمادگی فیزیولوژیک بیشتر گیاهچه‌های حاصل از سیستم غوطه‌وری موقت برای انتقال به شرایط برون‌شیشه‌ای نسبت داده شود؛ زیرا تهویه و تبادل گاز مناسب‌تر در این سامانه می‌تواند به تنظیم بهتر روابط آبی و تبادل گاز گیاهچه‌ها کمک کرده و سازگاری آن‌ها را تسهیل کند (Etienne & Berthouly, 2002). در همین راستا، (1999)  Escalona et al. بازده سازگاری 90 تا 100 درصد را برای آناناس گزارش کردند که مستقیماً از سیستم بیوراکتوری به گلخانه منتقل شده بودند. نتایج پژوهش حاضر نیز نشاندهنده کارایی بالای بیوراکتور PLANTFORM  در بهبود ریزازدیادی و سازگاری پایه رویشی CAB 11E است. از سوی دیگر، فرآیند ریشه‌زایی یکی از مراحل کلیدی در پروتکل‌های ریزازدیادی محسوب می‌شود و نقش اساسی در استقرار موفق گیاهچه‌ها پس از انتقال به شرایط خاک دارد. ریشه‌ها را می‌توان نتیجه جریان یک‌سویه اکسین از ساقه دانست، در­حالی­که اکسین برون‌زاد به‌عنوان القاکننده تشکیل پریموردیوم‌های ریشه‌های نابجا از سلول‌های مستعد در هیپوکوتیل یا ساقه‌های تازه‌ تشکیل‌شده عمل می‌کند (Pasternak & Steinmacher, 2024). در پژوهش حاضر، بالاترین درصد ریشه‌زایی (1/97 درصد) در محیط VS با نصف غلظت عناصر غذایی و غلظت 1 میلی‌گرم بر لیتر IBA مشاهده شد. این نتیجه نشان می‌دهد که کاهش غلظت عناصر معدنی محیط کشت، در کنار تأمین مناسب اکسین، می‌تواند شرایط مطلوب‌تری برای القای ریشه‌زایی فراهم کند. در همین راستا، (2025)Manzoor et al.  گزارش کردند که در پایهGiSelA 17 ، بیشترین میزان ریشه‌زایی در محیط کشت ½MS حاوی 3 میلی‌گرم بر لیتر IBA حاصل شد که بیانگر وابستگی پاسخ ریشه‌زایی به ژنوتیپ و غلظت اکسین است. در پژوهش دیگری بر روی پایه‌های مختلف جنس Prunus، برای ریشه‌زایی از محیط کشت MS با غلظت کامل و نصف مواد درشت‌مغذی و ریزمغذی استفاده شد. در نیمی از تیمارها، 200 میلی‌گرم بر لیتر Fe-EDDHA به‌عنوان منبع آهن به کار رفت که همان منبع آهن محیط کشت VS در این پژوهش است. همچنین غلظت‌های مختلف IBA مورد استفاده قرار گرفت نتایج نشان داد که در تعدادی از ارقام، افزودن Fe-EDDHA تأثیر مثبت و معنی‌داری بر ریشه‌زایی داشت (Ognjanov et al., 2014). علاوه­بر­این، اثر منابع مختلف آهن شامل منابع آلی (Fe-EDTA و Fe-EDDHA) و منبع معدنی (FeCl₃) بر ریشه‌زایی پایه GF-677 در شرایط درون‌شیشه‌ای بررسی شد. بیشترین ریشه‌زایی (100 درصد) در ریزنمونه‌های تغذیه‌شده با Fe-EDDHA مشاهده شد، از سوی دیگر، در غیاب آهن یا در حضور FeCl₃، میزان ریشه‌زایی به‌طور قابل توجهی کاهش یافت. جالب توجه آن‌که در ریزنمونه‌های تغذیه‌شده باFe-EDTA ، علی‌رغم محتوای بالای آهن و کاهش شدید کلروفیل در پایان آزمایش، هیچ‌گونه ریشه‌زایی مشاهده نشد (Molassiotis et al., 2003). این نتایج بر نقش تعیین‌کننده نوع منبع آهن در فرآیند ریشه‌زایی و کارایی فیزیولوژیک آن در گیاهچه‌های درون‌شیشه‌ای تأکید می‌کند. در یک پژوهش مقدماتی، پنج نوع کلات آهن شامل Fe(III)-EDTA، Fe(III)-DTPA، Fe(III)-EDDHA، Fe(III)-HEDP  و Fe(II)-HEDP در غلظت‌های مختلف در محیط MS بررسی شدند. نتایج نشان دادند پیچ‌امین‌الدوله آبی رقم «Lulia» نسبت به نوع کلات آهن پاسخ انتخابی دارد. اصلاح محیط غذایی با کلات‌های مؤثر موجب بهبود وضعیت فیزیولوژیک گیاه و افزایش بقای گیاهچه‌ها در مرحله سازگاری شد. در مرحله ریشه‌زایی، تیمار Fe(III)-EDDHA بیشترین تأثیر را نشان داد و سبب افزایش معنی‌دار درصد ریشه‌زایی، تعداد شاخساره و تعداد ریشه شد (Glinushkin et al., 2023).

در پژوهش حاضر نیز تغییر منبع آهن در محیط کشت موجب بهبود ریشه‌دهی شد. از سوی دیگر، حضور IBA تأثیر مثبتی بر ریشه‌دهی گیاهچه‌ها داشت. با این وجود، به‌جز سازگاری سریع‌تر گیاهچه‌های حاصل از پرآوری در بیورآکتور، تفاوت چشمگیری در میزان سازگاری گیاهچه‌ها مشاهده نشد. همچنین در این پژوهش، علی‌رغم عدم تغذیه تکمیلی گیاهان در مرحله سازگاری، به علت سبکی بستر مورد استفاده، شرایط کنترل‌شده بخش سازگاری گلخانه و نیز پایش مستمر وضعیت گیاهان، بازده سازگاری بسیار بالایی به دست آمد.

نتیجه‌گیری

به‌طور کلی، این پژوهش نشان می‌دهد که موفقیت ریزازدیادی پایه CAB 11E به بهینه‌سازی هم‌زمان ترکیب محیط کشت، تنظیم‌کننده‌های رشد و سیستم تکثیر وابسته است. در این راستا، محیط MS حاوی 1 میلی‌گرم بر لیتر BA و 1/0 میلی‌گرم بر لیتر IBA و در مرحله ریشه‌زایی، محیط VS با نصف غلظت عناصر درشت‌مغذی و 1 میلی‌گرم بر لیترIBA، به‌ترتیب بهترین پاسخ‌های تکثیر و ریشه‌زایی را ایجاد کردند. همچنین، استفاده از سیستم بیوراکتور با افزایش ضریب شاخه‌زایی و کاهش مدت زمان سازگاری، کارایی تکثیر را نسبت به کشت سنتی بهبود داد. بر این اساس، پروتکل بهینه ارائه‌شده در این پژوهش می‌تواند به‌عنوان روشی قابل اعتماد و مقیاس‌پذیر برای تولید انبوه گیاهچه‌های یکنواخت و باکیفیت پایه CAB 11E مورد استفاده قرار گیرد.

سپاسگزاری

بدین‌وسیله نویسندگان مراتب قدردانی و تشکر خود را از شرکت سلول فناور دارو اعلام می‌دارند که انجام کارهای عملی این پژوهش با همکاری و فراهم‌سازی امکانات آزمایشگاهی آن شرکت امکان‌پذیر شد. حمایت‌ها و همکاری‌های علمی و فنی این مجموعه نقش مهمی در پیشبرد و تکمیل این پژوهش داشته است. همچنین نویسندگان از معاونت پژوهش و فناوری دانشگاه خوارزمی به علّت حمایت‌های علمی و پژوهشی صمیمانه قدردانی می‌کنند.