مطالعه مقایسه‌ای اثر سلنیوم و نانوذرات سلنیوم بر شاخص‌های فیزیولوژیکی کالوس زعفران مزروعی (Crocus sativus L.)

مقدمه

زعفران مزرعی (Crocus sativus L.) گیاهی علفی از تیره زنبقیان و متعلق به جنس Crocus با حدود ۸۰ گونه است. این گیاه قابلیت رشد در شرایط مختلف محیطی از مناطق نیمه‌گرمسیری تا اقلیم مدیترانه‌ای را دارا است. زعفران علاوه بر ارزش اقتصادی بالا، به‌عنوان یکی از گیاهان دارویی مهم شناخته می‌شود و در طب سنتی کاربردهای متعددی دارد. همچنین این گیاه از نظر مصرف آب، یکی از کارآمدترین گیاهان زراعی در دنیا محسوب شده و از نظر نیاز به عناصر غذایی نیز، گیاهی کم‌توقع به شمار می‌رود ((Cardone et al., 2020. با وجود اهمیت بالای زعفران، این گیاه از نظر تکثیر و به نژادی با محدودیت‌های قابل توجهی مواجه است، زیرا گیاهی عقیم بوده و تکثیر آن به‌طور عمده توسط بنه انجام می‌شود که خود کندی تکثیر، کاهش کیفیت بنه‌ها و انتقال عوامل بیماری‌زا را در پی دارد. از این‌رو، توسعه سیستم‌های کشت بافت مناسب جهت تکثیر انبوه، افزایش رشد و تولید بنه‌های عاری از عوامل بیماری‌زا در این گیاه ارزشمند، از اهمیت ویژه‌ای برخوردار است (Chib et al., 2020). نتایج پژوهش‌های پیشین نشان داده­است که شرایط محیط کشت و ترکیب تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی نقش مهمی در موفقیت کشت بافت زعفران دارند. به‌طوری‌که بیشترین میزان القاء کالوس و باززایی شاخه در زعفران توسط محیط MS حاوی 5 درصد سوکروز و ۴ میلی‌گرم در لیتر TDZ و NAA گزارش شده­است (Ahmed et al., 2012). همچنین تولید ترکیبات ثانویه زعفران از طریق کشت کالوس، امکان تولید انبوه این ترکیبات ارزشمند را در شرایط کنترل‌شده فراهم نموده­است (Castillo et al., 2003). عوامل متعدد فیزیولوژی و عملکرد گیاهان را در شرایط کشت بافت تحت تأثیر قرار می­دهند که از جمله می‌توان به عناصر ریزمغذی در محیط کشت اشاره کرد. در میان عناصر غذایی، سلنیوم (Se) به علّت ویژگی­های فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی خود در دهه گذشته توجه زیست شناسان را جلب کرده­است. سلنیوم به عنوان یک عنصر مفید نقش مهمی در فیزیولوژی و متابولیسم گیاهان ایفا می‌کند. این عنصر در مقادیر کم موجب بهبود رشد، افزایش فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی و تنظیم فرآیندهای فیزیولوژیکی گیاهان می­شود، اما در سطوح بالا می­تواند سبب القای تنش اکسیداتیو شود (Thakur et al., 2023). از سوی دیگر، استفاده از عناصر غذایی به شـکل نـانوذرات بـه علّت خـواص فیزیکوشـیمیایی و سرعت بالای جـذب آن­ها از رویکردهای مهم در کشاورزی نوین اســت. در سال‌های اخیر، استفاده از نانوذرات سـلنیوم بـه علّت سمیت کم، سرعت جذب و فراهمی زیستی بالا و توانـایی قـوی در حذف رادیکال­های آزاد بیشـتر مورد توجه قـرار گرفته­است ( El-Ramady et al., 2015). نانوذرات سلنیوم می‌توانند از طریق تأثیر بر تکثیر سلولی، تمایز بافتی و تنظیم مسیرهای متابولیکی، بر پاسخ­های بیوشیمیایی گیاهان تأثیر بگذارند. پژوهش‌ها نشان دادند کاربرد سلنیوم و نانو‌سلنیوم موجب افزایش سرعت فتوسنتز، تجمع زیست‌توده (Farooq et al., 2022)، افزایش محتوای ترکیبات فنلی و پروتئین و در نهایت بهبود رشد و عملکرد گیاهان مختلف شده­است (Adhikary et al., 2022; Sher et al., 2022; Abdullahi et al., 2023; Huang et al., 2023; Ramezan et al., 2024). همچنین گزارش شده­است که نانوذرات سلنیوم به همراه محرک­های زیستی می‌توانند ارزش تغذیه‌ای و فعالیت‌های زیستی گیاهان را افزایش دهند (Almutairi et al., 2023)، با توجه به فقدان گزارش­های علمی در مورد اثر سلنیوم و نانوذرات سلنیوم بر شاخص‌های فیزیولوژیکی زعفران مزروعی، این پژوهش با هدف ارزیابی اولیه‌ الگوی پاسخ­های فیزیولوژیکی کالوس زعفران به دو شکل سلنیوم طراحی شد. در این پژوهش سیستم کشت کالوس به علّت کنترل‌پذیری بهتر شرایط محیطی، یکنواختی ژنتیکی بافت و امکان ارزیابی سریع پاسخ‌های سلولی به تیمارهای اعمال شده، به‌عنوان مدل آزمایشی اولیه انتخاب شد که می­تواند جهت پژوهش‌های بعدی در مورد مسیر بیوسنتزی آپوکاروتنوئیدهای شاخص زعفران نظیر کروسین نیز مورد استفاده قرار گیرد.

مواد و روش ها

آماده­سازی بنه­ها: بنه‌های زعفران مزروعی (Crocus sativus L.) از سازمان جهاد کشاورزی شهرستان ملایر خریداری و برای کشت بنه‌های سالم به قطر 5/2-۳ سانتی‌متر و وزن 8-7 گرم انتخاب شدند. ابتدا بنه‌ها پس از جدا کردن فلس‌های روی آن­ها با آب جاری شسته شدند. سپس بنه‌ها به مدت 5 دقیقه در اتانول۷۰ درصد و 10 دقیقه در محلول کلرید جیوه 1/0 درصد ضدعفونی و در نهایت سه بار با آب مقطر سترون شستشو داده شدند (Guang & Shi, 1995).

کشت بنه­ها: جهت کشت ریزنمونه‌های بنه از محیط کشت MS حاوی 3 درصد سوکروز (Murashige & Skoog, 1962) و یک میلی‌گرم در لیتر از هورمون­های BAP وNAA (5/5-8/7pH=) استفاده شد. قبل از انجام کشت، همه مواد و لوازم کشت در اتوکلاو با دمای ۱۲۰ درجه سانتی‌گراد و فشار یک اتمسفر به مدت ۱۵ دقیقه سترون شدند. کالوس‌ها هر ۲۱ روز یک‌بار در محیط کشت تازه با همان ترکیب هورمونی واکشت و در تاریکی نگه داری شدند. پس از 4 دوره‌ واکشت، کالوس‌ها به مدت 3 هفته به محیط کشتMS حاوی یک میلی­گرم در لیتر BAP و NAAو ۵ میلی‌گرم در لیتر سلنات سدیم یا نانوذرات ‌سلنیوم (با اندازه 20-35 نانومتر و خلوص ۹8 درصد، تهیه شده از پژوهشکده نانو دانشگاه شیراز) منتقل شدند. غلظت سلنیوم بر اساس پژوهش‌های پیشین کاربرد آن در شرایط در شیشه انتخاب شد و جهت مقایسه اثرات دو شکل مختلف آن، از غلظت یکسان آن­ها استفاده شد. پس از پایان دوره تیمار، کالوس­ها برداشت شده و پس از اندازه­گیری وزن تر و وزن خشک آن­ها با ترازوی دقیق، جهت انجام سنجش شاخص­های فیزیولوژیکی در فریزر ۸0- درجه سانتی‌گراد نگه­داری شدند.

ارزیابی شاخص­های فیزیولوژیکی

محتوای رنگیزه­های فتوسنتزی: ارزیابی محتوای کلروفیل a، کلروفیل b، کلروفیل کل و کاروتنوئیدها توسط روش Lichtentaler (1987) انجام شد. بدین منظور ۲/۰ گرم بافت تر کالوس در هاون چینی حاوی ۵ میلی­لیتر استون 80 درصد سائیده شد و سپس مخلوط حاصل با استفاده از کاغذ صافی واتمن شماره 1 صاف شد، سپس میزان جذب نوری نمونه­ها در طول موج های ۲/۶۶۳، ۸/۶۴۶ و۴۷۰ نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر UV- Visible مدل Perkin Elmer خوانده شد و در نهایت محتوای کلروفیل­ها و کاروتنوئیدها با استفاده از رابطه‌های (1 تا 4) محاسبه و بر حسب میلی­گرم بر گرم وزن تر کالوس بیان شد (Lichtentaler, 1987).

رابطه 1:

W × 1000V/ × ] (647A) 69/2 - (₆₆₃A) 7/12 [= کلروفیل a

رابطه 2:

W × 1000V/ × ] (₆₆₃A) 68/4 - (₆₄₇A) 9/22 [ = کلروفیل b   

رابطه 3:

W× 1000V/ × ] (₆₆₃A) 02/8 + (₆₄₇A) 2/20 [ = کلروفیل کل

رابطه 4:

198/ (Chlb × 02/85 – Chla × 82/1– ₄₈₀ A ×1000) = کاروتنوئیدها

محتوای فنل، فلاونوئید و آنتوسیانین کل: بدین منظور 5/0 گرم بافت تر کالوس با محلول استخراج (متانول حاوی 1 درصد HCl) سائیده شد و از عصاره حاصل برای سنجش محتوای فنل، فلاونوئید و آنتوسیانین کل استفاده شد. محتوای فنل کل به روش فولین سیوکالتو (McDonald et al., 2002) ارزیابی شد. میزان جذب نوری نمونه­ها در طول موج 760 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر خوانده شد. محتوای فنل کل توسط منحنی استاندارد اسید گالیک محاسبه و بر حسب میلی­گرم بر گرم وزن تر کالوس گزارش شد. برای سنجش محتوای فلاونوئیـد کـل از روش رنگ سنجی با کلرید آلومینیوم استفاده شد و میزان جذب نوری نمونه­هـا توسط دستگاه اسـپکتروفتومتردر طـول مـوج 498 نـانومتر خوانده شد. محتوای فلاونوئید کل با استفاده از منحنی استاندارد کوئرستین محاسبه و بر اساس میلی­گرم بر گرم وزن تر کالوس گزارش شد (Chang et al., 2002). سنجش محتوای آنتوسیانین کل به روش Wagner (1979) انجام شد. ابتدا 1/0 بافت برگ با 10 میلی لیتر متانول اسیدی (متانول حاوی 1 درصد HCl) در هاون چینی بطور کامل همگن شد. سوسپانسیون حاصل به مدت24 ساعت در تاریکی و در دمای اتاق قرار داده شد و سپس به مدت 10 دقیقه با سرعت 4000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. میزان جذب نمونه­ها توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 550 نانومتر خوانده شد. همچنین از متانول اسیدی به عنوان بلانک استفاده شد. در نهایت محتوای آنتوسیانین کل بر اساس رابطه زیر و توسط ضریب خاموشی معادلmM^-1 cm^-1 33000 محاسبه و بر حسب میلی­گرم بر گرم وزن تر کالوس بیان شد (رابطه 5).

A= εBC

A= میزان جذب خوانده شده در 550 نانومتر، ε= ضریب خاموشی، B= عرض کووت (یک سانتی‌متر) و C= غلظت برحسب مول در لیتر

محتوای پرولین: جهت ارزیابی محتوای پرولین، 3/0 گرم بافت تر کالوس با یک میلی­لیتر سولفوسالیسیلیک اسید 3 درصد سائیده شد و سپس سانتریفیوژ شد. در مرحله بعد سپس به 200 میکرولیتر از محلول رویی، 200 میکرولیتر نین­هیدرین و 200 میکرولیتر اسید استیک گلاسیال اضافه شد. نمونه­ها به مدت یک ساعت در دمای 100 درجه سانتی­گراد قرار گرفته و پس از خنک­شدن، 200 میکرولیتر تولوئن به آن­ها اضافه و به مدت 10 تا 15 ثانیه ورتکس شدند. در نهایت جذب نمونه­ها در طول موج 520 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر خوانده شد و محتوای پرولین بر حسب میکرو­مول بر گرم وزن تر کالوس بیان شد (Bates et al., 1973).

محتوای قند محلول: برای سنجش محتوای قند محلول از روش فنل- اسید سولفوریک استفاده شد (Dubious et al., 1956). بدین منظور، 02/0 گرم بافت خشک کالوس در3 میلی‌لیتر اتانول80 درصد (v/v) سائیده شد. محلول حاصل به مدت 15دقیقه با سرعت 5000 دور در دقیقه سانتریفیوژ و محلول رویی برداشت شد. به یک میلی‌لیتر از محلول رویی، یک میلی‌لیتر محلول فنل 5 درصد اضافه و به‌خوبی مخلوط شد. سپس 5 میلی‌لیتر اسید سولفوریک غلیظ به آن اضافه و به‌شدت مخلوط شد. نمونه‌ها به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق نگه­داری شد و در نهایت جذب نوری آن­ها در طول موج 480 نانومتر توسط دستگاه اســپکتروفتومتر خوانده شد. همچنین محتوای قند محلول نمونه‌ها با استفاده از منحنی استاندارد گلوکز محاسبه و برحسب میلی‌گرم برگرم وزن خشک کالوس بیان شد.

محتوای مالون­دی­آلدئید: برای سنجش محتوای مالون‌دی‌آلدئید (MDA) از روش Heath & Packer (1968) استفاده شد. ابتدا 2/0 گرم بافت تر کالوس در هاون چینی حاوی 5 میلی‌لیتر تری‌کلرو‌استیک اسید 1/0 درصد سائیده شد. عصاره حاصل به مدت 5 دقیقه با سرعت 6000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. سپس به یک میلی‌لیتر از محلول رویی، 5 میلی‌لیتر محلول تری‌کلرو‌استیک اسید 20 درصد حاوی 5/0 درصد تیوباربیتوریک اسید (TBA) اضافه شد. مخلوط حاصل به مدت 30 دقیقه در حمام آب گرم با دمای 95 درجه سانتی‌گراد حرارت داده شد و سپس بلافاصله در حمام یخ سرد شد. آنگاه میزان جذب محلول توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 523 نانومتر خوانده شد و محتوای مالون‌دی‌آلدئید بـر حسب میکرومول بر گرم وزن تر کالوس گزارش شد.

محتوای پراکسید هیدروژن: برای سنجش محتوای پراکسید هیدروژن، 5/0 گرم بافـت تر کـالوس با یک ‌میلی‌لیتر تری کلرواستیک اسید 1/0 درصد سائیده شـد. مخلـوط همگن به مدت 15 دقیقه با سرعت 12000 دور در دقیقه و در دمـای 4 درجـه سـانتی‌گـراد سانتریفیوژ شد. ســپس 700 میکرولیتـر از محلـول رویـی با 700 میکرولیتـر بـافر فسـفات پتاسیم 10 میلی‌مولار (7PH=) و700 میکرولیتر یدیـد پتاسـیم یک مـولار مخلوط شد. محتوای پراکسید هیدروژن توسط منحنی استاندارد تهیه شده از غلظت‌های مشخص H₂O₂ محاسبه و بر حسب میکرومول بر گرم وزن تر کالوس بیان شد (Nareshkumar et al., 2015).

محتوای پروتئین کل: برای ارزیابی محتوای پروتئین کل از روش برادفورد استفاده شد (Bradford, 1976). جهت تهیه عصاره پروتئینی، 5/0 گرم بافت تر کالوس در هاون چینی حاوی 7 میلی لیتر بافر فسفات سدیم (5/0 مولار، 7pH=) به مدت 30 ثانیه روی یخ سائیده شد. سپس نمونه­ها درسانتریفیوژ یخچال­دار با سرعت 12000 دور در دقیقه به مدت ۳0 دقیقه سانتریفیوژ شدند. پس از این مرحله، 1/0 میلی‌لیتر از فاز رویی برداشته شد و به آن 5 میلی‌لیتر معرف برادفورد اضافه شد. سپس محلول سریعاً ورتکس شد و به مدت 25 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد نگهداری شد. میزان جذب نوری محلول توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 595 نانومتر خوانده شد و محتوای پروتئین کل بر اساس منحنی استاندارد سرم آلبومین گاوی (BSA) محاسبه و بر اساس میلی­گرم بر گرم وزن تر کالوس گزارش شد.

فعالیــت آنزیم­های آنتی­اکسیدانی: از عصاره پروتئینی استخراج شده، جهت سنجش فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانی استفاده شد. ارزیابی فعالیــت آنــزیم پراکســیداز بر اساس روش MacAdam et al. (1992) انجـام شـد. مخلـوط واکنش شـامل 81/0 میلـی­لیتـر بـافر فسـفات پتاسـیم 100 میلـی­مـولار (7 =pH)، 20 میکرولیتـر عصـاره پروتئینی،90 میکرولیتر گایاکول 10 میلی‌مـولار و90 میکرولیتــر آب اکســیژنه 5 میلــی‌مــولار بــود. تغییرات جذب مخلوط واکنش در طـول مـوج 425 نـانومتر بـه مـدت 2 دقیقه (هر30 ثانیـه یک بار) توسط دستگاه اســپکتروفتومتر خوانده شــد. فعالیــت آنــزیم پراکسیداز بر حسـب تغییـرات جـذب در دقیقـه بـه ازای میلی­گرم پروتئین بیان شد. بــرای ارزیابی فعالیــت آنــزیم کاتــالاز از روش Chance & Maehly (1995) استفاده شد. بدین منظور از 250 میکرولیتر بافر فسـفات سـدیم 20 میلـی‌مـولار (7=pH) و 250 میکرولیتر آب اکسیژنه 15 میلی­مـولار به عنوان پذیرنده الکترون اسـتفاده شـد که سـپس 60 میکرولیتر عصاره پروتئینی در حمام یخ به آن ها اضـافه شد. تغییرات جذب نـوری مخلوط واکنش در طـول مـوج 240 نـانومتر به ﻣﺪﺕ ۲ ﺩﻗﻴﻘﻪ (ﻫﺮ 30 ﺛﺎﻧﻴﻪ ﻳﮏ ﺑﺎﺭ) توسط دستگاه اســپکتروفتومتر خوانده شـد. همچنین فعالیــت آنــزیم کاتالاز بر حسـب تغییـرات جـذب در دقیقـه بـه ازای میلی­گرم پروتئین بیان شد. برای ارزیابی فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز از روش Beauchamp & Fridovich (1971) استفاده شد. بدین منظور 3 میلی لیتر محلول واکنش شامل بافر فسفات 50 میکرومولار (7/8=pH)، متیونین 9/9 میکرومولار، نیتروبلوتترازولیوم (NBT) ­5/7 میکرومولار و تریتون-100 به عصاره افزوده شد. فعالیت آنــزیم سوپراکسید دیسموتاز بر حسب تغییرات NBT در برابر نور در طول موج 560 نانومتر توسط دستگاه اســپکتروفتومتر اندازه‌گیری شد و بر حسـب تغییـرات جـذب در دقیقـه بـه ازای میلی­گرم پروتئین بیان شد.

آنالیز آماری

آزمایش‌ها به صورت فاکتوریل در قالب طرح کامل تصادفی در 3 تکرار و تجزیه و تحلیل داده­ها با استفاده از نرم افزارآماری SPSS انجام شد. همچنین مقایسه میانگین­ها بر اساس آزمون چند دامنه­ای دانکن و در سطح احتمال 5 درصد (P ≤ 0.05) انجام شد.

نتایج و بحث

وزن تر و وزن خشک کالوس

بررسی ریخت‌شناسی کالوس­های زعفران مزروعی در تیمارهای مختلف نشان داد که سلنیوم بویژه در شکل نانو، موجب بهبود رشد و کیفیت ظاهری کالوس­ها شد (شکل 1). همچنین نتایج مقایسه میانگین وزن‌تر و وزن‌خشک کالوس نشان داد که اثر هر دو تیمار سلنیوم و نانوسلنیوم در غلظت 5 میلی­گرم در لیتر بر این دو شاخص معنی‌دار بود (جدول 1). بر اساس نتایج حاصل وزن‌تر کالوس از 23/4 گرم در تیمار شاهد، به 17/5 گرم در تیمار سلنیوم و به 93/5 گرم در تیمار نانوسلنیوم افزایش یافت. تغییرات وزن‌خشک کالوس نیز با الگویی مشابه از 830/0 گرم در تیمار شاهد، به 020/1 و 055/1 گرم به‌ترتیب در تیمارهای سلنیوم و نانوسلنیوم رسید، با این تفاوت که اختلاف میان دو تیمار سلنیوم و نانوسلنیوم معنی‌دار نبود (شکل 2). نتایج حاصل از پژوهش­های مختلف نشان داده­است که فاکتورهای مختلف فیزیولوژیکی کالوس (رشد، بیوسنتز رنگیزه­ها، فعالیت­های آنزیمی و شاخص‌های تنش اکسیداتیو) هر یک دامنه پاسخ وابسته به دوز اختصاصی خود را دارند و الزاماً هم‌زمان وارد فاز مهاری نمی‌شوند. در یک پژوهش بر روی کالوس گیاهSantalum album ، تیمار نانوسلنیوم موجب افزایش وزن ‌تر و ‌خشک کالوس شده و این افزایش به تحریک جذب عناصر غذایی و افزایش فعالیت متابولیکی سلول‌ها توسط نانوسلنیوم نسبت داده شده­است (Mazhar et al., 2024). همچنین در پژوهش دیگر بر روی کالوس گیاهDracocephalum kotschyi ، نانوذرات سلنیوم در مقایسه با سلنیت سدیم، عملکرد برتری در بهبود شاخص‌های رشدی و زیست‌توده کالوس نشان دادند که احتمالاً به علّت توانایی بیشتر این نانوذرات در جذب و توزیع یکنواخت‌تر آن­ها در بافت کالوس است (Khanizadeh et al., 2025). همچنین در کالوس گیاه Caralluma tuberculate، افزایش وزن‌تر هم‌زمان با افزایش فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی (سوپراکسید دیسموتاز، پراکسیداز و کاتالاز) تحت تیمار نانوسلنیوم گزارش شده­است که با نتایج پژوهش حاضر مطابقت دارد (Zahedi et al., 2019; Ali et al., 2023)

شکل 1- کالوس حاصل از کشت ریزنمونه بنه زعفران مزروعی (A) چهار ماه پس از واکشت در محیط کشت پایه MS حاوی یک میلی‌گرم در لیتر از هورمون­های BAP و NAA. (B) دو هفته پس از انتقال به محیط کشت پایه MS حاوی یک میلی‌گرم در لیتر از هورمون­های BAP و NAA ­و 5 میلی­گرم در لیتر سلنات سدیم. (C) دو هفته پس از انتقال به محیط کشت پایه MS حاوی یک میلی‌گرم در لیتر از هورمون­های BAP و NAA و 5 میلی­گرم در لیتر نانوذرات سلنیوم.

Figure 1- Saffron calli from corm explant (A) 4 months after subculture in MS medium supplemented with 1 mg L^-1 each of NAA and BAP. (B) 2 weeks after transfer to MS medium supplemented with 1 mg L^-1 each of NAA and BAP and 5 mg L^-1 sodium selenate. (C) 2 weeks after transfer to MS medium supplemented with 1 mg L^-1 each of NAA and BAP and 5 mg L^-1 selenium nanoparticles.

جدول 1- تجزیه واریانس اثر تیمارهای سلنیوم و نانوذرات سلنیوم بر شاخص­های فیزیولوژیکی کالوس زعفران مزروعی.

Table 1- Analysis of variance of the effects of selenium and selenium nanoparticles treatments on physiological indices of Crocus sativus calli.

S.O.V: منبع تغییرات، df: درجات آزادی، CV: ضریب تغییرات. ^** و ^ns به ترتیب بیانگر معنی‌دار بودن در سطح 5% و عدم معنی‌دار بودن است.

S.O.V: Source of variation, df: Degree of freedom, CV: Coefficient of variation. ** and ns represent significant at 5% probability level and not significant, respectively.

شکل 2- مقایسه میانگین اثر سلنیوم (Se) و نانوذرات سلنیوم (SeNPs) بر وزن تر (A) و وزن خشک (B) کالوس­های زعفران مزروعی.

Figure 2– Comparison of the effects of selenium (Se) and selenium nanoparticles (SeNPs) on the fresh (A) and dry (B) weights of Crocus sativus calli.

محتوای رنگیزه­های فتوسنتزی: نتایج مقایسه میانگین اثر تیمارهای سلنیوم و نانو‌سلنیوم بر محتوای رنگیزه‌های فتوسنتزی نشان داد که هر دو تیمار سلنیوم اثر معنی­داری بر محتوای رنگیزه‌های فتوسنتزی داشتند (جدول 1). بر اساس نتایج حاصل، بیشترین محتوای کلروفیل a، کلروفیل b، کلروفیل کل و کاروتنوئیدها در نمونه شاهد مشاهده شد و تیمارهای سلنیوم و نانوسلنیوم موجب کاهش محتوای رنگیزه­های فتوسنتزی شدند و نانوسلنیوم در مقایسه با سلنیوم، اثرات منفی بیشتری نشان داد (شکل 3). نتایج پژوهش­های مختلف نشان‌ داده­اند که پاسخ­های فیزیولوژیکی گیاهان به سلنیوم، به گونه گیاهی، شکل سلنیوم مورد استفاده و غلظت آن وابسته است؛ به­طوری که سلنیوم در غلظت پائین رشد گیاه را تحریک می‌کند، امّا در غلظت بالا می‌تواند به عنوان اکسیدان عمل کرده و عملکرد گیاه را کاهش دهد. نتایج پژوهشی بر روی کالوس­های گیاه فلفل نشان داد که غلظت پائین نانوسلنیوم اثرات محرک رشدی داشته، در حالی که غلظت‌های بالای آن (10 و۳۰ میلی‌گرم در لیتر) موجب سمیت شدید و ناهنجاری ساختاری برگ و ریشه شد (Sotoodehnia-Korani et al., 2020). همچنین در گیاهSesamum indicum ، نانو‌سلنیوم در غلظت کم سبب افزایش محتوای رنگیزه‌های فتوسنتزی و بهبود عملکرد فتوسنتزی شد، در حالی که در غلظت‌های زیاد موجب کاهش محتوای آن­ها و القاء تنش اکسیداتیو گردید (Ahmad et al., 2024). در پژوهش حاضر کاهش محتوای رنگیزه‌های فتوسنتزی بویژه در تیمار نانو‌سلنیوم، نشان‌دهنده اثر بازدارنده این نانوذرات درغلظت مورد استفاده بر سنتز یا پایداری این رنگیزه‌ها است. زیرا نانوذرات به علّت اندازه بسیار کوچک و سطح ویژه بالای خود می‌توانند بیشتر به درون سلول‌های گیاهی نفوذ کرده و با ایجاد اختلال در غشاها، افزایش تولید رادیکال‌های آزاد و آسیب به کلروپلاست‌ها، موجب کاهش سنتز یا تخریب رنگیزه‌های فتوسنتزی شوند (Sompura et al., 2026 ). همچنین همسو با نتایج حاصل از این پژوهش، گزارش شده­است که سلنات سدیم در غلظت­های بالا موجب کاهش محتوای کلروفیل در گیاه تنباکو شده که احتمالاً ناشی از کاهش سنتز پورفوبیلینوژن مورد نیاز برای بیوسنتز کلروفیل است (Saffar Yazdi et al., 2012; Zsiros et al., 2019). از سوی دیگر کاهش محتوای رنگیزه‌های فتوسنتزی پس از افزودن سلنیوم و به‌ ویژه نانوسلنیوم، به چندین دوره واکشت در محیط کشت و نگه­داری طولانی آن­ها در تاریکی نیز مرتبط است. رشد بافت کالوس در تاریکی مانع از تمایز پلاستیدها به کلروپلاست‌های بالغ شده و منجر به تشکیل اتیوپلاست‌ها می‌شود. در غیاب نور، مسیر بیوسنتز کلروفیل در مرحله کلیدی تبدیل پروتوکلروفیلید به کلروفیلید، به علّت عدم فعالیت آنزیم وابسته به نورِ پروتوکلروفیلید اکسیدوردوکتاز متوقف می‌شود. در چنین شرایطی، ورود سلنیوم و نانوذرات آن به عنوان یک الیسیتور غیرزیستی به سلول سیگنال داده و با ایجاد تخصیص مجدد در منابع کربنی و انرژی سلول، مسیرهای بیوسنتزی کلروفیل و کاروتنوئید را مستقل از نور تحت تأثیر قرار می­دهد. سلول‌های کالوس برای مقابله با این عامل خارجی، جریان انرژی و اسکلت‌های کربنی پیش‌ساز پلاستیدی را از مسیرهای فرعی بیوسنتز رنگیزه­های فتوسنتزی منحرف کرده و به سمت مسیر فنیل‌پروپانوئیدها جهت بیوسنتز متابولیت­های ثانویه فنلی سوق می‌دهند. در واقع، ارزیابی محتوای رنگیزه­های فتوسنتزی بعنوان شاخص­های حساس اولیه برای بررسی پاسخ متابولیکی کالوس به سلنیوم نشان می­دهد که این عنصر ممکن است با القاء تنش اکسیداتیو موجب کاهش محتوای رنگیزه­های فتوسنتزی و برعکس تقویت مسیر فنیل پروپانوئیدی شود. کاهش معنی‌دار محتوای رنگیزه­های فتوسنتزی در مقابل افزایش محتوای ترکیبات فنلی در تیمار سلنیوم بویژه در شکل نانو و در شرایط تاریکی، با یافته‌های Al-Khayri et al. (2023) همخوانی دارد.

شکل 3- مقایسه میانگین اثر سلنیوم (Se) و نانوذرات سلنیوم (SeNPs) بر محتوای کلروفیل a (A)، کلروفیل b (B)، کلروفیل کل (C) و کاروتنوئیدها (D) در کالوس­های زعفران مزروعی.

Figure 3– Comparison of the effects of selenium (Se) and selenium nanoparticles (SeNPs) on the content of chlorophyll a (A), chlorophyll b (B), total chlorophyll (C) and carotenoids (D) in Crocus sativus calli.

محتوای فنل، فلاونوئید و آنتوسیانین کل: نتایج مقایسه میانگین اثر تیمارهای سلنیوم و نانو‌سلنیوم بر محتوای ترکیبات فنلی زعفران مزروعی نشان داد که اعمال سلنیوم و نانو‌سلنیوم در غلظت ۵ میلی‌گرم در لیتر تأثیر معنی‌داری بر محتوای فنل، فلاونوئید و آنتوسیانین کل داشتند و موجب افزایش محتوای این ترکیبات شدند (جدول 1). همچنین بیشترین محتوای ترکیبات فنلی در تیمار نانو‌سلنیوم مشاهده شد (شکل 4). در این راستا، پژوهش انجام شده بر روی کالوس گیاهSantalum album  نشان داده­است که کاربرد نانو‌سلنیوم موجب افزایش معنی‌دار تولید متابولیت‌های ثانویه از جمله ترکیبات فنلی در این گیاه شده که نشان‌دهنده اثر احتمالی این نانوذرات در مسیرهای بیوسنتزی مرتبط با آنتی‌اکسیدان‌های فنلی است (Mazhar et al., 2024). افزایش محتوای ترکیبات فنلی در تیمارهای سلنیوم و نانوسلنیوم نشان‌دهنده نقش مؤثر این عنصر در تحریک مسیرهای دفاعی و متابولیکی گیاهان است. احتمال می رود سلنیوم می‌تواند توسط فعال‌سازی آنزیم فنیل‌آلانین آمونیالیاز(PAL) که آنزیم کلیدی مسیر سنتز ترکیبات فنلی محسوب می‌شود، منجر به افزایش تجمع فنل‌ها در گیاهان شود (El-Shalakany et al., 2010 ). همچنین، سلنیوم با تسریع مسیر بیوسنتزی فنیل‌پروپانوئیدها، می­تواند موجب افزایش تجمع فلاونوئیدها و سایر متابولیت‌های ثانویه مرتبط با سیستم آنتی‌اکسیدانی گیاه شود (Mimmo et al., 2017). نانوذرات سلنیوم در شرایط کشت بافت، با القاء تنش اکسیداتیو در محیط سلول­های کالوس سبب تولید گونه­های اکسیژن فعال می­شوند و با ایجاد اختلال در تعادل ردوکس سلولی، موجب تغییر در فعالیت آنزیم‌های دخیل در سنتز ترکیبات فنلی می­شوند. بنابراین به منظور خنثی­سازی اثرات سمی ایجاد شده، سنتز ترکیبات آنتی­اکسیدانی مختلف با اهداف دفاعی در سلول­های گیاهی دچار فراتنظیمی می­شوند. این نانوذرات بواسطه اندازه کوچک و سطح زیاد خود، به سهولت از مسیرهای آپوپلاستی و سیم پلاستی عبور می­کنند و منجر به برهم کنش­های الکترواستاتیکی بیشتری با غشاهای سلولی شده و اثرات بیشتری در فعال نمودن مسیرهای بیوسنتزی ترکیبات فنلی و میزان تولید محصول‌ها این مسیر بروز می­دهند (Rani et al., 2017; Zhang et al., 2022).

شکل 4- مقایسه میانگین اثر سلنیوم (Se) و نانوذرات سلنیوم (SeNPs) بر محتوای فنل (A) فلاونوئید (B) و آنتوسیانین کل (C) درکالوس­های زعفران مزروعی.

Figure 4 – Comparison of the effects of selenium (Se) and selenium nanoparticles (SeNPs) on the content of total phenol (A), flavonoid (B), and anthocyanin (C) in Crocus sativus calli.

پرولین: نتایج مقایسه میانگین اثر سلنیوم و نانوسلنیوم بر محتوای پرولین در کالوس زعفران مزروعی نشان داد که تیمارهای سلنیوم و نانو‌سلنیوم در غلظت ۵ میلی‌گرم در لیتر اثر معنی‌داری بر محتوای پرولین داشتند (جدول 1). بیشترین محتوای پرولین در تیمار 5 میلی­گرم در لیتر نانوسلنیوم مشاهده شد که به‌طور معنی‌داری از تیمار ‌سلنیوم بیشتر بود، هرچند ‌سلنیوم خود نیز موجب افزایش معنی‌دار محتوای پرولین نسبت به شاهد شد (شکل 5). پرولین به‌عنوان تنظیم‌کننده اسمزی، تثبیت ‌کننده ساختار پروتئین‌ها، حذف­­‌کننده رادیکال‌های آزاد و بازدارنده پراکسیداسیون لیپیدی غشاء، نقش مهمی در افزایش تحمل گیاه ایفا می‌کند (Zhao et al., 2020; Madebo et al., 2021). افزایش پرولین در نتیجه تیمار هر دو شکل سلنیوم در پژوهش حاضر با نتایج گزارش­‌شده در گیاه کلزا تحت تیمار نانو‌سلنیوم (Rezayian & Niknam, 2025)، گیاه جو تحت تیمار سلنات­سدیم (Akbulut & Cakir, 2010) و گیاه نعناع تحت تیمار نانو‌سلنیوم (Nazerieh et al., 2018) همخوانی دارد. بنابراین به نظر می­رسد این تیمارها توسط القاء بیان ژن‌های مسیر بیوسنتز پرولین به عنوان یک اسمولیت‌ سازگار، سبب حفظ آب سلولی کالوس­ها در شرایط درون شیشه شده‌است.

قند محلول: نتایج مقایسه میانگین اثر تیمارهای سلنیوم و نانو‌سلنیوم بر محتوای قند محلول کالوس زعفران مزروعی حاکی از اثر معنی‌دار تیمار سلنیوم و نانو‌سلنیوم در غلظت ۵ میلی‌گرم در لیتر بر محتوای قند محلول بود (جدول 1). بیشترین محتوای قند محلول در تیمار نانو‌سلنیوم مشاهده شد، هرچند تیمار سلنیوم نیز خود موجب افزایش محتوای قند محلول نسبت به شاهد شد (شکل 5). اثر نانوذرات سلنیوم در افزایش محتوای قند محلول در پژوهش‌های دیگر نیز گزارش شده است. به عنوان مثال، اسپری برگی نانوذرات سلنیوم در ژنوتیپ‌های گندم سبب افزایش معنی­دار محتوای قند محلول شده است (Ikram et al., 2020). به نظر می­رسد سلنیوم موجب افزایش محتوای قندهای محلول درگیاهان می­شود و این ترکیبات علاوه بر نقش اصلی خود (تولید انرژی)، به عنوان تنظیم‌کننده اسمزی منجر به حفظ تورژسانس سلول‌ها می­شوند (Hong et al., 2000). افزایش قابل­توجه و هم‌زمان محتوای پرولین و قندهای محلول در تیمار نانوسلنیوم در پژوهش حاضر که به کاهش تنش اکسیداتیو و برقراری مجدد پایداری سلولی کمک می کند، با یافته‌های Rezayian & Niknam, 2025 در گیاه کلزا همخوانی دارد.

مالون­دی­آلدئید: نتایج مقایسه میانگین اثر سلنیوم و نانوذرات سلنیوم بر محتوای مالون‌دی‌آلدئید (MDA) در کالوس زعفران مزروعی نشان داد که تیمار سلنیوم در غلظت 5 میلی­گرم در لیتر سبب کاهش محتوای مالون‌دی‌آلدئید و تقویت سیستم آنتی­اکسیدانی، در حالی که نانوسلنیوم منجر به افزایش معنی‌دار محتوای مالون‌دی‌آلدئید شد (جدول 1، شکل 5). این پدیده به وضوح بیانگر نقش نانوذرات به عنوان محرک‌ غیرزیستی است؛ به طوری که در غیاب تنش‌های محیطی، نانوذرات به علّت ابعاد کوچک و نفوذ ‌پذیری بالا، یک تنش اکسیداتیو ملایم و کنترل‌شده را در سلول القا می‌کنند که به عنوان پیام محرک عمل می‌کند. گزارش شده­است که سلنیوم در غلظت‌های پائین (حدود ۱ میلی‌گرم در لیتر) که بسته به نوع گونه گیاهی و شرایط رشد متغیر است، با تقویت هماهنگ سیستم دفاع آنتی‌اکسیدانی به‌ویژه آنزیم‌های کاتالاز و سوپراکسید دیسموتاز سبب حذف گونه‌های اکسیژن فعال، تعدیل پراکسیداسیون لیپیدها و حفظ یکپارچگی غشاء سلولی می‌شود (Hartikainen et al., 2005). پژوهش‌های متعددی کاهش معنی‌دار محتوای مالون‌دی‌آلدئید در اثر کاربرد سلنیوم در گیاهانی نظیر گل صدتومانی (Wang et al., 2024)، لوبیا سبز (Rady et al., 2021) و قهوه (Mateus et al., 2021) را گزارش کرده‌اند.

پراکسید هیدروژن: نتایج مقایسه میانگین اثر سلنیوم و نانوذرات سلنیوم بر محتوای پراکسید هیدروژن (H₂O₂) در کالوس زعفران مزروعی نشان داد که سلنیوم در غلظت ۵ میلی‌گرم در لیتر موجب کاهش محتوای H₂O₂نسبت به شاهد شد، اما نانو‌سلنیوم در همین غلظت سبب افزایش محتوای H₂O₂نسبت به تیمار سلنیوم و شاهد شد (جدول 1، شکل 5). بر اساس نتایج پژوهشگران؛ گزارش شده­است که سلنیوم در غلظت‌های پائین با تقویت سیستم‌ آنتی‌اکسیدانی و افزایش تجزیه H₂O₂، از ساختار غشاء سلولی محافظت می‌کند (Hartikainen et al., 2005)، اما افزایش غلظت آن به‌ویژه در شکل نانوذره که به سهولت از غشاها عبور می­کند، خود تنش­زا بوده و می‌تواند تعادل سیستم اکسیدانی و آنتی‌اکسیدانی را بر هم زند. در پژوهش حاضر افزایش معنی‌دار فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی تحت تیمار سلنیوم، سبب کاهش محتوای پراکسید هیدروژن در کالوس زعفران مزروعی شد، لیکن فرایند آسیب غشایی در اثر تیمار نانو‌سلنیوم آغاز شده که با افزایش شاخص مالون‌دی‌آلدئید همراه بود. این یافته­ها با نتایج پژوهش Beiramnvand et al. (2023) مطابقت داشته و نشان‌دهنده حساسیت کالوس زعفران مزروعی به غلظت سلنیوم در شکل نانوذره است. در واقع، تفاوت پاسخ کالوس‌های زعفران به غلظت یکسان دو شکل از سلنیوم، نشان‌دهنده حساسیت وابسته به دوز و شکل این عنصر است. در حالی که سلنیوم توده‌ای در این غلظت نقش حمایتی ایفا نموده و با مهار تولید رادیکال­های آزاد، محتوای MDA و H₂O₂ را کاهش داد، نانوسلنیوم در همین غلظت منجر به تحریک گونه­های فعال اکسیژن شد. این پدیده به ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی منحصربه‌فرد نانوذرات مربوط است؛ نانوذرات سلنیوم به دلیل نسبت سطح به حجم فوق‌العاده بالا، سطح باردار فعال و ابعاد نانومتری، سرعت جذب و فراهمی زیستی بسیار بالاتری در مقایسه با فرم توده‌ای دارند. در نتیجه غلظت ۵ میلی‌گرم در لیتر برای شکل نانو، یک دوز فراتر از آستانه تحمل تلقی شده و فراتر از ظرفیت هومئوستازی سلول‌های کالوس عمل کرده­است. این ورود بیش از حد نانوذرات به درون سلول‌ها، تعادل سیستم ردوکس را به نفع شرایط اکسیداتیو متمایل کرده و با آغاز پراکسیداسیون چربی‌های غشا، نشت یون‌ها و نهایتاً تخریب یکپارچگی غشاء سلولی را القا نموده_­است. این نتایج همسو با یافته‌های Sotoodehnia-Korani et al. (2020) در کالوس فلفل نشان دادند که دوزهای بالای نانوسلنیوم سبب سمیت شدید سلولی می­شود.

شکل 5- مقایسه میانگین اثر سلنیوم (Se) و نانوذرات سلنیوم (SeNPs) بر محتوای پراکسید هیدروژن (A)، پرولین(B) ، مالون­دی­آلدئید (C) و قند محلول(D) درکالوس­های زعفران مزروعی.

Figure 5 – Comparison of the effects of selenium (Se) and selenium nanoparticles (SeNPs) on the content of H₂O₂ (A), proline (B), MDA (C) and soluble sugars (D) in Crocus sativus calli.

محتوای پروتئین کل و فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانی: نتایج مقایسه میانگین اثر سلنیوم و نانوذرات سلنیوم بر محتوای پروتئین کل و فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی در کالوس زعفران مزروعی نشان داد که سلنیوم و نانو‌سلنیوم در غلظت ۵ میلی‌گرم در لیتر تأثیر معنی‌داری بر محتوای پروتئین کل و فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی داشتند (جدول 1). محتوای پروتئین کل تحت تأثیر هر دو شکل سلنیوم افزایش یافت که می‌تواند به علّت اثر این تیمارها بر تقویت وضعیت آنتی‌اکسیدانی سلول­ها جهت کاهش آسیب‌های اکسیداتیو، توسط افزایش سنتز و پایداری پروتئین‌ها است. همچنین نتایج پژوهش های انجام‌شده بر روی کالوس گیاهان Vigna unguiculata و Cardamin violifolia نشان داده‌است که نانوذرات سلنیوم می‌توانند بیان ژن‌های مرتبط با متابولیسم نیتروژن و سنتز پروتئین را تحریک نموده و محتوای پروتئین را افزایش دهند (Wu et al., 2020). همچنین بر اساس نتایج حاصل از این پژوهش، فعالیت آنزیم‌های کاتالاز، پراکسیداز و سوپراکسید دیسموتاز در پاسخ به سلنیوم و نانوسلنیوم در غلظت 5 میلی­گرم در لیتر افزایش یافت و بیشترین محتوای پروتئین و فعالیت آنزیم ها در تیمار نانو‌سلنیوم مشاهده شد (شکل 6). نتایج این پژوهش در مورد افزایش فعالیت آنزیم­های آنتی‌اکسیدانی با یافته‌های گزارش­‌شده در گیاهان نعناع فلفلی (Jafari & Moghaddam, 2023)، خیار (Mousavi et al., 2023 ) و شاهی (Wu et al., 2020) تحت تیمار سلنیوم و نانو‌سلنیوم هم‌راستا است. همچنین بر اساس یافته ها گزارش شده­است که نانوذرات سلنیوم به علت سطح ویژه بالا و قابلیت نفوذ بیشتر به سلول‌ها، توانایی بیشتری در تحریک سیستم‌های دفاعی گیاه نسبت به شکل‌های معمول سلنیوم دارند و این امر علت افزایش بیشتر فعالیت آنزیم‌های کاتالاز، پراکسیداز و سوپراکسید دیسموتاز در تیمار نانو‌سلنیوم را توجیه می­کند (Silva et al., 2020).

شکل 6- مقایسه میانگین اثر سلنیوم (Se) و نانوذرات سلنیوم (SeNPs) بر محتوای پروتئین کل (A) و فعالیت آنزیم­های کاتالاز (CAT) (B)، پراکسیداز (POD) (C) و سوپراکسید دیسموتاز (SOD) (D) درکالوس­های زعفران مزروعی.

Figure 6 – Comparison of the effects of selenium (Se) and selenium nanoparticles (SeNPs) on the content of total protein (A) and activity of the enzymes catalase (CAT), (B), peroxidase (POD) (C) and superoxide dismutase (SOD) (D) in Crocus sativus calli.

نتیجه‌گیری

یافته‌های این پژوهش نشان داد که سلنیوم و نانو‌سلنیوم تأثیر معنی‌داری بر شاخص­های فیزیولوژیکی کالوس زعفران مزروعی داشته و موجب افزایش محتوای ترکیبات فنلی، قند محلول، پرولین، پروتئین و فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدانی از جمله کاتالاز، پراکسیداز و سوپراکسید دیسموتاز، ولیکن کاهش محتوای رنگیزه‌های فتوسنتزی شدند. از سوی دیگر، سلنیوم سبب کاهش محتوای مالون­دی­آلدئید و پراکسید هیدروژن شد و از سوی دیگر؛ نانوسلنیوم آن­ها را افزایش داد. تفاوت در پاسخ‌های فیزیولوژیکی مشاهده شده، نشان‌دهنده حساسیت کالوس زعفران مزروعی به شکل فیزیکوشیمیایی عنصر سلنیوم (توده‌ای در برابر نانو) در غلظت مورد بررسی است. در مجموع، نتایج این پژوهش تأئید می‌کند که استفاده هدفمند از سلنیوم به‌ویژه در شکل نانو در غلظت مناسب می‌تواند به‌عنوان ابزاری مؤثر جهت تنظیم اکثر پاسخ‌های فیزیولوژیکی گیاهان مورد استفاده قرار گیرد.

تعارض منافع

در مورد این پژوهش که مستخرج از رساله دکتری نویسنده اول است، هیچ یک از پژوهشگران تعارض منافع ندارند.

تشکر و قدردانی

این پژوهش با حمایت مالی دانشگاه بوعلی سینا همدان انجام شده­است.