پایش و شناسایی مولکولی کمپیلوباکتر در منابع دامی و آبی بهبهان با تمرکز بر ژن‌های حدت flaA و virB11

مقدمه

کمپیلوباکتر یکی از مهم‌ترین و شایع‌ترین باکتری‌های بیماری‌زای منتقله از غذا در سراسر جهان به شمار می‌رود. این باکتری‌ها سالانه موجب صدها میلیون مورد عفونت گوارشی و در برخی موارد بروز عوارض ثانویه مانند سندرم گیلن–باره[1]، آرتریت واکنشی[2] و عوارض نورولوژیک می‌شوند (1). از میان گونه‌های متعدد این جنس، دو گونه‌ کمپیلوباکتر ژژونی[3] و کمپیلوباکتر کولی[4] عامل اصلی کمپیلوباکتریوز انسانی هستند (2). مسیرهای انتقال این باکتری‌ها به انسان شامل مصرف گوشت یا محصولات دامی آلوده، تماس مستقیم با حیوانات ناقل و آب‌های آلوده است (3، 4). طیور اهلی، به‌ویژه مرغ، مخزن اصلی کمپیلوباکتر محسوب می‌شوند؛ مطالعات نشان داده‌اند بین 30 تا 90 درصد از جمعیت‌های طیور در نقاط مختلف جهان از این باکتری‌ها کلونیزه شده‌اند (5). افزون بر طیور، نشخوارکنندگان (گاو، گوسفند و بز) به‌عنوان منابع مهم ثانویه معرفی شده‌اند؛ زیرا باکتری‌ها قادرند در محیط، آب آشامیدنی دام و کودها مدت طولانی زنده بمانند و موجب انتقال محیطی و متقاطع شوند (6، 7). در ایران نیز الگوهای مشابهی گزارش شده‌اند؛ به‌ویژه در مناطق جنوب‌غرب کشور که شرایط گرم‌ومرطوب و سبک سنتی پرورش دام منجر به افزایش بقای کمپیلوباکتر در محیط و دامداری‌ها شده است (8، 9). بیماری‌زایی کمپیلوباکتر حاصل مجموعه‌ای از ژن‌های حدت است که نقش آنها در مراحل مختلف عفونت ازجمله چسبندگی، تهاجم، کلونیزاسیون، بقا و فرار از سیستم ایمنی میزبان اثبات شده است (10). ژن cadF پروتئینی را کد می‌کند که با اتصال به فیبرونکتین سلول‌های اپیتلیال روده، ورود اولیه باکتری را تسهیل می‌کند. ژن ciaB در ورود فعال به سلول‌های میزبان نقش دارد و با القای پاسخ التهابی در بافت روده مرتبط است (11). ژن‌های cdtA, cdtB و cdtC مسئول تولید توکسین سیتولتی هستند که با آسیب DNA و توقف چرخه سلولی موجب تخریب سلول‌های میزبان می‌شود (12). یکی دیگر از ژن‌های مهم، pldA است که با کدکردن فسفولیپاز A، موجب پایداری غشایی، مقاومت در برابر استرس اکسیداتیو و حفظ بقای باکتری در محیط می‌شود (7). همچنین وجود ژن racR که در تنظیم بیان ژن‌های مرتبط با چسبندگی و تهاجم نقش دارد، در افزایش توان بیماری‌زایی جدایه‌ها تأثیرگذار است (13). یکی از جنبه‌های نوین مطالعات روی کمپیلوباکترها، بررسی سیستم‌های ترشحی است که امکان تزریق مستقیم پروتئین‌های مؤثر بیماری‌زا به سلول میزبان را فراهم می‌کند. سیستم ترشحی نوع III (T3SS) در برخی گونه‌های کمپیلوباکتر حضور دارد و در فرایند تهاجم و چسبندگی فعال نقش دارد. ژن flaA که فلاژلین A را کد می‌کند، علاوه بر تحرک، در تعامل با سیستم T3SS و ایجاد التهاب روده مؤثر است و در اغلب جدایه‌های بیماری‌زا یافت می‌شود (12، 14). در مقابل، سیستم ترشحی نوع IV (T4SS) که انتقال پلاسمیدها و ژن‌های حدت میان سلول‌های باکتریایی را تسهیل می‌کند، توسط ژن‌هایی ازجمله virB11 کدگذاری می‌شود. مطالعات نشان داده‌اند حضور ژن virB11 در جدایه‌های انسانی و محیطی کمپیلوباکتر نادر است؛ اما وجود آن با افزایش بالقوه انتقال فاکتورهای ویروالنس و مقاومت آنتی‌بیوتیکی همراه است (3)؛ بنابراین، بررسی هم‌زمان این دو ژن در جدایه‌های حیوانی می‌تواند شاخصی از توان بیماری‌زایی و خطر انتقال بین‌گونه‌ای باشد. در سال‌های اخیر، مقاومت آنتی‌بیوتیکی در گونه‌های کمپیلوباکتر رو به افزایش بوده و این موضوع نگرانی جدی در سطح جهانی ایجاد کرده است (2، 15). مقاومت به ماکرولیدها (مانند اریترومایسین)، فلوروکینولون‌ها (مانند سیپروفلوکساسین) و تتراسایکلین‌ها به‌ویژه در جدایه‌های دامی شایع است. ژن‌های اختصاصی مقاومت ازجمله cmeA، cmeB، cmeC و blaOXA-61 در انتقال و بقا در محیط نقش دارند و اغلب در کنار ژن‌های بیماری‌زایی مشاهده می‌شوند. این هم‌زمانی موجب افزایش خطر انتقال سوش‌های مقاوم و شدیداً بیماری‌زا از منابع دامی به انسان شده است (10). در ایران، مطالعات بسیاری در زمینه شیوع کمپیلوباکتر در طیور صنعتی و محصولات گوشتی انجام شده است (8، 9)؛اما مطالعات بر منابع دام‌های بومی و سنتی که در سامانه‌های غیرصنعتی پرورش یافته‌اند هنوز محدود است. جدایه‌های حاصل از حیوانات بومی در جنوب ایران دارای تفاوت‌های ژنتیکی قابل توجه با جدایه‌های صنعتی هستند و برخی از آنها واجد ژن‌های تهاجمی مانند cadF و pldA با فراوانی بالا بوده‌اند (8). امامی و همکاران (2023) نیز اشاره کرده‌اند تماس مکرر حیوانات آزادچر با منابع آبی و انسانی، موجب افزایش تبادل ژن‌های بیماری‌زایی و مقاومت در میان گونه‌های دامی و انسانی شده است (9). همچنین، مطالعات اخیر نشان داده‌اند شرایط اقلیمی نیمه‌گرمسیری ایران باعث تسهیل بقا و انتقال افقی پلاسمیدهای مقاوم حاوی ژن‌های T4SS مانند virB11 بین جدایه‌های متفاوت کمپیلوباکتر شده است (16). این امر اهمیت بررسی دقیق‌تر سیستم‌های ترشحی و ژن‌های حدت در جدایه‌های حیوانات بومی را برای برنامه‌ریزی کنترل بیماری در کشور دوچندان می‌کند.

با توجه به اهمیت روزافزون کمپیلوباکترها در چرخه زئونوتیک، کمبود اطلاعات درباره جدایه‌های حاصل از حیوانات بومی ایران و نقش احتمالی آنها در انتقال بیماری به انسان، مطالعه حاضر با هدف بررسی شیوع ژن‌های حدت و سیستم‌های ترشحی (flaA و (virB11 در جدایه‌های کمپیلوباکتر ژژونی و کمپیلوباکتر کولی جداشده از حیوانات بومی (مرغ، گاو، گوسفند، بز و منابع آب) انجام شد. همچنین ارتباط بین نوع میزبان، گونه باکتری و وجود ژن‌های بیماری‌زایی و ترشحی ارزیابی شد تا تصویر دقیق‌تری از توان اپیدمیولوژیک این جدایه‌ها در شرایط کشور ارائه شود.

 مواد و روش‌ها

طراحی مطالعه و جامعه آماری

این مطالعه از نوع تجربی - آزمایشگاهی و مقطعی[5] بود که با هدف بررسی ویژگی‌های مولکولی و فنوتیپی کمپیلوباکترهای جداشده از حیوانات بومی در شهرستان بهبهان استان خوزستان در سال 1403 انجام شد. جامعه آماری شامل 4875 رأس گاو و گوسفند و حدود 505000 قطعه مرغ موجود در دامداری‌ها و مرغداری‌های منطقه مطالعه‌شده بود. حجم نمونه براساس جدول کرجسی و مورگان تعیین شد و تعداد 400 نمونه انتخاب شدند (17). نمونه‌گیری به روش تصادفی خوشه‌ای چندمرحله‌ای انجام شد؛ به‌طوری‌که ابتدا از میان چهار بخش شهرستان بهبهان (مرکزی، آغاجری، زیدون و تشان) دو بخش به‌صورت تصادفی انتخاب شدند. سپس از هر بخش دو دامداری و دو مرغداری انتخاب شد. از هر واحد پرورشی نیز به‌طور تصادفی 50 نمونه شامل مدفوع گاو، گوسفند، بز، مدفوع طیور و نمونه‌های محیطی (آب یا فاضلاب) جمع‌آوری شد. در بررسی اولیه، 8 نمونه به‌دلیل آلودگی یا عدم رعایت شرایط انتقال استریل حذف شدند و در نهایت 392 نمونه برای بررسی‌های آزمایشگاهی استفاده شدند. در این تحقیق متغیر وابسته پتانسیل بیماری‌زایی کمپیلوباکتر و متغیرهای مستقل شامل حضور ژن‌های سیستم‌های ترشحی (T3SS و T4SS) و مقاومت آنتی‌بیوتیکی بودند.

 جمع‌آوری نمونه‌ها

نمونه‌های مدفوع از بخش میانی مدفوع تازه دام‌ها با استفاده از ظروف استریل درب‌دار جمع‌آوری شد. درباره مرغداری‌ها علاوه بر نمونه مدفوع، نمونه‌هایی از فاضلاب و خونابه‌های حاصل از کشتار نیز جمع‌آوری شدند. تمام نمونه‌ها در شرایط زنجیره سرد 4 درجه سانتی‌گراد و در مدت کمتر از 4 ساعت به آزمایشگاه منتقل شدند. نمونه‌گیری در ساعات 8 تا 10 صبح انجام شد؛ زیرا در این زمان احتمال دفع مدفوع تازه در دام‌ها بیشتر بوده و همچنین دمای محیط هنوز بالا نرفته است که این امر می‌تواند بر بقای باکتری‌های حساس مانند کمپیلوباکتر تأثیرگذار باشد (18).

 جداسازی و کشت کمپیلوباکتر

به‌منظور جداسازی کمپیلوباکتر از روش غنی‌سازی میکروآئروفیلیک با استفاده از دستگاه [6]KB استفاده شد. در این روش، دو لوله پلاستیکی به‌وسیله یک لوله شیشه‌ای خمیده به یکدیگر متصل شدند. در لوله اول 2 گرم نمونه مدفوع با 5 میلی‌لیتر سرم فیزیولوژی استریل مخلوط شد و در لوله دوم 5 میلی‌لیتر محیط کشت نوترینت براث قرار گرفت. مجموعه لوله‌ها به مدت 48 ساعت در دمای 4 درجه سانتی‌گراد نگهداری شد تا شرایط مناسب برای رشد کمپیلوباکتر فراهم شود. پس از این مرحله، از بخش میانی محیط کشت، برداشت و روی محیط‌های بلاد آگار و مولر - هینتون آگار به روش خطی کشت داده شد. پلیت‌ها در شرایط میکروآئروفیلیک (5 درصد O₂ ، 10 درصد CO₂ و 85 درصد N₂) در دمای 37 درجه سانتی‌گراد به مدت 72 ساعت انکوبه شدند (19).

 شناسایی فنوتیپی جدایه‌ها

شناسایی اولیه جدایه‌های مشکوک به کمپیلوباکتر براساس ویژگی‌های مورفولوژیک، رنگ‌آمیزی گرم و آزمون‌های بیوشیمیایی استاندارد انجام شد. کلنی‌های کمپیلوباکتر روی محیط بلاد آگار به صورت کلنی‌های خاکستری، مرطوب، براق و برجسته مشاهده شدند. در رنگ‌آمیزی گرم، سلول‌ها به‌صورت باسیل‌های خمیده گرم منفی با آرایش S شکل یا بال مرغی دیده شدند (20). برای تأیید هویت جدایه‌ها از آزمون‌های اکسیداز، آزمون کاتالاز، هیدرولیز هیپورات، احیای نیترات، تست اوره‌آز، آزمون متیل رد (MR)، آزمون ووژس‑پروسکوئر (VP)، تست ایندول، آزمون اکسیداتیو – فرمنتاتیو (O/F)، هیدرولیز ایندوکسیل استات، تولید سولفید هیدروژن در محیط TSI استفاده شد. همچنین رشد باکتری در دماهای 25، 30، 37 و 42 درجه سانتی‌گراد، رشد در حضور 1 درصد گلیسین و 5/1 درصد و 5/3 درصد NaCl بررسی شد. حساسیت اولیه گونه‌ها نیز با استفاده از دیسک‌های نالیدیکسیک اسید 30 میکروگرم و سفالوتین 30 میکروگرم ارزیابی شد (21).

 استخراج DNA

برای استخراج DNA ژنومی از کیت استخراج DNA ستون – محور (یکتا تجهیز آزما، ایران) استفاده شد. ابتدا سلول‌های باکتریایی توسط سانتریفیوژ رسوب داده شدند. سپس مراحل لیز سلولی با لیزوزیم و پروتئیناز K انجام گرفت و DNA با استفاده از ستون سیلیکا خالص‌سازی شد. DNA استخراج‌شده در دمای 20- درجه سانتی‌گراد تا زمان انجام PCR نگهداری شد.

 ارزیابی کیفیت و کمیت DNA

کیفیت و غلظت DNA استخراج‌شده با استفاده از دستگاه NanoDrop spectrophotometer اندازه‌گیری شد. نسبت جذب A260/A280 برای تمامی نمونه‌ها بین 8/1 تا 2 بود که نشان‌دهنده خلوص مناسب DNA است (22). همچنین کیفیت DNA با الکتروفورز روی ژل آگارز 1 درصد بررسی شد.

 شناسایی مولکولی کمپیلوباکتر

برای تأیید جنس کمپیلوباکتر از تکنیک PCR با هدف ژن 16S rRNA استفاده شد. پرایمرهای استفاده‌شده:

Forward: 27F    AGAGTTTGATCMTGGCTCAG

Reverse: 1492R    CGGTTACCTTGTTACGACTT 

محصول مورد انتظار: 1490 bp (23).

 شناسایی ژن‌های سیستم ترشحی

برای بررسی ژن‌های مرتبط با سیستم‌های ترشحی، از PCR اختصاصی برای دو ژن flaA و virB11 استفاده شد؛ به‌طوری‌که ژن flaA به‌عنوان ژن مرتبط با سیستم ترشحی نوع III و ژن virB11 به‌عنوان ژن مرتبط با سیستم ترشحی نوع IV در نظر گرفته شد. طراحی پرایمرهای استفاده‌شده براساس مطالعات پیشین انجام گرفت (24).

اندازه قطعات تکثیرشده برای ژن flaA برابر با bp 1077 و برای ژن virB11 برابر با bp 470 بود (24). محصولات PCR سپس بر روی ژل آگارز 2 درصد در بافر TBE الکتروفورز شدند. فرایند الکتروفورز در ولتاژ 80 ولت به مدت 45 دقیقه انجام شد و در پایان، باندها پس از رنگ‌آمیزی با اتیدیوم بروماید با استفاده از دستگاه UV transilluminator مشاهده و ثبت شدند.

تحلیل آماری

تحلیل داده‌ها با استفاده از نرم‌افزار SPSS نسخه 22 انجام شد. ابتدا شاخص‌های توصیفی برای متغیرها محاسبه شدند. سپس ارتباط بین وجود ژن‌های ویرولانس، سیستم‌های ترشحی و مقاومت آنتی‌بیوتیکی با استفاده از آزمون‌های کای دو[7]و آزمون دقیق فیشر[8] بررسی شد. سطح معنی‌داری آماری p کمتر از 05/0 در نظر گرفته شد.

 نتایج

تعداد نمونه‌های جمع‌آوری‌شده

درمجموع 392 نمونه از منابع مختلف شامل مرغ، گاو، گوسفند و بز و آب جمع‌آوری شد. بیشترین تعداد نمونه از مرغ و کمترین تعداد از آب به دست آمد.

نتایج رنگ‌آمیزی گرم و آزمون‌های بیوشیمیایی

براساس بررسی‌های اولیه شامل رنگ‌آمیزی گرم و آزمون‌های بیوشیمیایی، 50 نمونه به‌عنوان جدایه‌های مشکوک به کمپیلوباکتر شناسایی شدند. شکل 1 نمایی از باسیل‌های گرم منفی خمیده را نشان می‌دهد.

برای تأیید شناسایی اولیه، PCR با پرایمرهای اختصاصی ژن 16S rRNA انجام شد. تمامی 50 جدایه باند اختصاصی در ناحیه bp 1490 نشان دادند. نمونه‌ای از نتایج PCR در شکل 2 ارائه شده است. محصولات PCR برای توالی‌یابی به شرکت ماکروژن کشور کره جنوبی ارسال شدند.

تحلیل توالی ژن 16S rRNA

نتایج مقایسه توالی ژن 16S rRNA جدایه‌ها با داده‌های بانک ژنی NCBI نشان داد جدایه‌ها متعلق به دو گونه کمپیلوباکتر ژژونی و کمپیلوباکتر کولی هستند. جزئیات مربوط به دسترسی ژنی و گونه‌های شناسایی‌شده در جدول 1 ذکر شده است.

شکل 1: نمایی از باسیل‌های خمیده گرم منفی کمپیلوباکتر (رنگ‌آمیزی گرم، X 1000)

Figure 1. Microscopic view of curved, Gram‑negative Campylobacter bacilli (Gram staining, ×1000)

 نتایج واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR)

شکل 2: ژل الکتروفورز برای مشاهده ژن 16S rRNA  کمپیلوباکترهای جداشده از نمونه‌ها. ستون c: مارکر وزن مولکولی (لدر) bp 100، ستون C-: کنترل منفی، چاهک‌های 1 تا 50: نمونه‌های جداشده

Figure 2. Gel electrophoresis for visualization of the 16S rRNA gene in Campylobacter isolates from the samples. Lane C: 100 bp molecular weight marker (DNA ladder); lane C−: negative control; lanes 1–50: isolated samples.

جدول 1: تأیید شناسایی کمپیلوباکترهای جداشده از نمونه‌های مدفوع مرغ، گاو، گوسفند و بز و آب براساس توالی‌یابی ژن 16Sr RNA

Table 1. Confirmation of Campylobacter isolates from chicken, cattle, sheep, goat feces and water samples based on 16S rRNA gene sequencing.

P: مرغ، C: گاو، S: گوسفند و بز، W: آب

شیوع کمپیلوباکتر در نمونه‌ها

بررسی نمونه‌های جمع‌آوری‌شده از منابع مختلف شامل مرغ، گاو، گوسفند و بز و آب نشان داد از مجموع 392 نمونه بررسی‌شده، 50 نمونه به جنس کمپیلوباکتر ژژونی تعلق داشتند که شیوع کلی آن 8/12 درصد بود. بیشترین میزان جداسازی کمپیلوباکتر در نمونه‌های مرغ مشاهده شد؛ به‌طوری‌که از 182 نمونه مرغ، 37 جدایه شناسایی شد و شیوعی معادل 3/20 درصد را نشان داد. در نمونه‌های گاو از مجموع 141 نمونه، 8 جدایه کمپیلوباکتر به دست آمد که بیان‌کننده شیوع 7/5 درصدی بود. همچنین در نمونه‌های گوسفند و بز از 41 نمونه بررسی‌شده، 2 جدایه کمپیلوباکتر شناسایی شدند که شیوع 9/4 درصد را نشان دادند. در نمونه‌های آب نیز از مجموع 28 نمونه، 3 جدایه کمپیلوباکتر جداسازی شدند که میزان شیوع آن 7/10 درصد بودند. درمجموع، نتایج نشان دادند مرغ مهم‌ترین منبع جداسازی کمپیلوباکتر در میان نمونه‌های بررسی‌شده بوده است.

 توزیع گونه‌ای جدایه‌های کمپیلوباکتر

بررسی‌های مولکولی انجام‌شده روی جدایه‌های کمپیلوباکتر نشان دادند این جدایه‌ها متعلق به دو گونه کمپیلوباکتر ژژونی و کمپیلوباکتر کولی هستند. درمجموع 36 جدایه (72 درصد) به گونه کمپیلوباکتر ژژونی و 14 جدایه (28 درصد) به گونه کمپیلوباکتر کولی تعلق داشتند. در نمونه‌های مرغ، 29 جدایه به گونه کمپیلوباکتر ژژونی و 8 جدایه به گونه کمپیلوباکتر کولی شناسایی شد. در نمونه‌های گاو، هریک از دو گونه کمپیلوباکتر ژژونی و کمپیلوباکتر کولی به تعداد 4 جدایه مشاهده شد. در نمونه‌های گوسفند و بز، یک جدایه کمپیلوباکتر ژژونی و یک جدایه کمپیلوباکتر کولی شناسایی شدند. همچنین در نمونه‌های آب، 2 جدایه متعلق به کمپیلوباکتر ژژونی و یک جدایه مربوط به کمپیلوباکتر کولی بودند. به‌طور کلی، نتایج نشان دادند گونه کمپیلوباکتر ژژونی گونه غالب در میان جدایه‌های کمپیلوباکتر بوده و در بیشتر منابع نمونه‌گیری فراوانی بیشتری نسبت به کمپیلوباکتر کولی داشته است.

 ارتباط بین جدایه‌های کمپیلوباکتر و نوع میزبان

نتایج تحلیل آماری نشان دادند بین نوع نمونه و توزیع جدایه‌های کمپیلوباکتر ارتباط معنی‌داری وجود نداشت (۰٫۰۵ P>).

توزیع گونه‌های کمپیلوباکتر براساس نوع میزبان در جدول 2 رائه شده است. همان‌گونه که در این جدول مشاهده می‌شود، بیشترین فراوانی جدایه‌ها مربوط به گونه کمپیلوباکتر ژژونی بوده است و بخش عمده‌ای از این جدایه‌ها از نمونه‌های مرغ جدا شده‌اند. همچنین گونه کمپیلوباکتر کولی نیز در هر دو منبع مرغ و دام مشاهده شدند.

جدول 2: جدول توافقی ارتباط بین جدایه‌های کمپیلوباکتر و نوع میزبان

Table 2. Association between Campylobacter isolates and host type

جدول 3. ارتباط بین جدایه‌های کمپیلوباکتر و نوع میزبان براساس آزمون کای‌دو پیرسون

Table 3. Association between Campylobacter isolates and host type based on Pearson’s chi-square test

به‌منظور بررسی ارتباط بین نوع جدایه‌های کمپیلوباکتر و نوع میزبان، آزمون کای‌دو پیرسون انجام شد. نتایج این آزمون در جدول 3 نشان داده شده است. براساس نتایج آزمون آماری، بین نوع جدایه‌های کمپیلوباکتر و نوع میزبان ارتباط معنی‌داری مشاهده نشد (۰٫۰۵ P>).

ارزیابی ژن‌های سیستم‌های ترشحی

برای بررسی ژن‌های مرتبط با سیستم‌های ترشحی، PCR اختصاصی برای ژن‌های flaA و virB11 انجام شد. نمونه‌ای از نتایج الکتروفورز در شکل‌های 3 و 4 مشاهده می‌شود.

شکل 3:تشخیص ژن flaA جدایه‌های کمپیلوباکتر. ستونc: مارکر وزن مولکولی (لدر) bp 100، ستون C- کنترل منفی، چاهک‌های 1 تا 50: نمونه‌های جداشده

Figure 3. Agarose gel electrophoresis for detection of the flaA gene in Campylobacter isolates. Lane C: 100 bp DNA ladder (molecular weight marker); Lane C−: negative control; Lanes 1–50: Campylobacter isolates.

شکل 4: تشخیص ژن virB11 جدایه‌های کمپیلوباکتر. ستونc: مارکر وزن مولکولی (لدر) bp 100، ستون C- کنترل منفی، چاهک‌های 1 تا 50: نمونه‌های جداشده

Figure 4. Agarose gel electrophoresis of the virB11 gene in Campylobacter isolates. Lane C: 100 bp DNA ladder (molecular weight marker); Lane C−: negative control; Lanes 1–50: Campylobacter isolates.

جدول 4: شیوع 4 ژن‌ مرتبط با سیستم ترشحی در جدایه‌های کمپیلوباکتر ژژونی و کمپیلوباکتر کولی جداشده از تمام نمونه‌ها

Table 4. Prevalence of four secretion system-associated genes in Campylobacter jejuni and Campylobacter coli isolates recovered from all samples

جدول 5: شیوع 4 ژن‌ مرتبط با سیستم‌های ترشحی در جدایه‌های کمپیلوباکتر ژژونی و کمپیلوباکتر کولی بحسب نوع نمونه

Table 5. Prevalence of secretion system–associated genes in Campylobacter jejuni and Campylobacter coli isolates according to sample type

شیوع ژن‌های مرتبط با سیستم‌های ترشحی

نتایج نشان دادند ژن flaA در بخش قابل توجهی از جدایه‌ها شناسایی شد؛ درحالی‌که ژن virB11 در هیچ‌یک از جدایه‌ها وجود نداشت. همان‌طور که در جدول 4 ارائه شده، ژن flaA بیشترین فراوانی را داشته است.

بررسی شیوع این ژن‌ها برحسب نوع نمونه نیز در جدول 5 آمده است و نشان می‌دهد ژن flaA بیشترین فراوانی را در جدایه‌های جداشده از مرغ داشته است.

 ارتباط بین کمپیلوباکتر و ژن flaA

نتایج مربوط به توزیع ژن flaA در میان جدایه‌های کمپیلوباکتر ژژونی و کمپیلوباکتر کولی در جدول 6 ارائه شده است. همان‌گونه که در این جدول مشاهده می‌شود، حضور ژن flaA در میان جدایه‌ها متغیر بوده و الگوی توزیع آن بین دو گونه متفاوت است. به‌منظور بررسی ارتباط معنی‌دار بین نوع کمپیلوباکتر و وجود ژن flaA، آزمون کای‌دو پیرسون انجام شد. نتایج این آزمون در جدول 6 نشان داده شده است. براساس مقدار P گزارش‌شده (۰٫۰۵P<)، ارتباط بین نوع کمپیلوباکتر و وجود ژن flaA معنی‌دار بود؛ بنابراین، وجود این ژن با نوع گونه کمپیلوباکتر ارتباط آماری قابل توجهی نشان داد.

نتایج آزمون کای‌دو پیرسون برای بررسی ارتباط بین جدایه‌های کمپیلوباکتر و حضور یا عدم حضور ژن flaA در جدول 7 ارائه شده است.

ارتباط بین کمپیلوباکتر و ژن virB11

نتایج مربوط به بررسی ژن virB11 در جدایه‌های کمپیلوباکتر در جدول 8 ارائه شده است. همان‌گونه که در جدول 8 مشاهده می‌شود، هیچ‌یک از جدایه‌های بررسی‌شده دارای ژن virB11 نبودند. به‌دلیل عدم وجود فراوانی‌های قابل محاسبه در خانه‌های جدول، امکان انجام آزمون کای‌دو برای بررسی رابطه بین وجود ژن virB11 و نوع گونه کمپیلوباکتر وجود نداشت؛ با این حال، براساس داده‌های جدول 8، به نظر می‌رسد میان نوع کمپیلوباکتر و ژن virB11 ارتباطی مشاهده نمی‌شود.

جدول 6: جدول توافقی ارتباط بین جدایه‌های کمپیلوباکتر با ژن flaA

Table 6. Contingency table showing the association between Campylobacter isolates and the flaA gene

جدول 7: جدول نتایج آزمون کای‌دو پیرسون بین جدایه‌های کمپیلوباکتر و ژن flaA

Table 7. Results of Pearson’s chi-square test for the association between Campylobacter isolates and the flaA gene

جدول 8: جدول توافقی ارتباط بین جدایه‌های کمپیلوباکتر با ژن virB11

Table 8. Contingency table showing the association between Campylobacter isolates and the virB11 gene

بحث

کمپیلوباکترها از مهم‌ترین عوامل باکتریایی ایجادکننده گاستروآنتریت در انسان محسوب می‌شوند و به‌ویژه از طریق مواد غذایی با منشأ حیوانی منتقل می‌شوند. در مطالعه حاضر، از مجموع 392 نمونه جمع‌آوری‌شده از منابع مختلف شامل مرغ، گاو، گوسفند و بز و آب، تعداد 50 جدایه متعلق به جنس کمپیلوباکتر شناسایی شد که شیوع کلی ۱۲٫۸درصد را نشان داد. بیشترین میزان جداسازی در نمونه‌های مرغ مشاهده شد (۲۰٫۳ درصد)؛ در حالی‌که در نمونه‌های دام و آب میزان پایین‌تری گزارش شد. این نتایج با یافته‌های بسیاری از مطالعات بین‌المللی همخوانی دارد که طیور را مهم‌ترین مخزن طبیعی کمپیلوباکتر معرفی کرده‌اند و نقش اساسی آن را در انتقال عفونت به انسان نشان داده‌اند (1، 2). علت این موضوع را می‌توان در شرایط زیستی روده طیور، دمای بدن نسبتاً بالا، تراکم بالای نگهداری در مزارع صنعتی و احتمال آلودگی متقاطع در مراحل کشتار و فرآوری جست‌وجو کرد (25).

مطالعات متعددی در نقاط مختلف جهان نیز شیوع بالای کمپیلوباکتر در طیور را گزارش کرده‌اند؛ برای مثال، هامفری و همکاران (2008) نشان دادند بیش از 60 درصد گله‌های مرغ گوشتی در برخی کشورهای اروپایی به کمپیلوباکتر آلوده هستند (18). همچنین در مطالعه‌ای دیگر گزارش شد آلودگی گوشت مرغ در زنجیره تولید می‌تواند نقش مهمی در انتقال این باکتری به مصرف‌کنندگان داشته باشد (10)؛ بنابراین، یافته‌های مطالعه حاضر مبنی بر شیوع بیشتر کمپیلوباکتر در مرغ با روند جهانی گزارش‌شده در مطالعات پیشین هم‌خوانی دارد و اهمیت کنترل بهداشتی در صنعت طیور را برجسته می‌کند. در بررسی گونه‌ای جدایه‌ها، نتایج نشان دادند کمپیلوباکتر ژژونی یا فراوانی 72 درصد گونه غالب بوده است و کمپیلوباکتر کولی با 28 درصد در رتبه بعدی قرار دارد. این الگوی توزیع با بسیاری از مطالعات اپیدمیولوژیک مطابقت دارد که کمپیلوباکتر ژژونی را عامل اصلی کمپیلوباکتریوز انسانی معرفی کرده‌اند و سهم آن را در عفونت‌های انسانی بین ۷۰ تا ۹۰ درصد گزارش کرده‌اند (2، 26). توانایی بیشتر این گونه در کلونیزاسیون دستگاه گوارش طیور، قابلیت سازگاری با شرایط محیطی و وجود مجموعه‌ای از عوامل حدت مؤثر می‌تواند از دلایل غالب بودن آن باشد (26).

در مطالعه حاضر، اگرچه بیشترین فراوانی جدایه‌ها در نمونه‌های مرغ مشاهده شد، آزمون آماری کای‌دو نشان داد بین نوع میزبان و گونه کمپیلوباکتر ارتباط آماری معنی‌داری وجود ندارد (05/0 <P). این نتیجه بیان می‌کند هر دو گونه کمپیلوباکتر ژژونی و کمپیلوباکتر کولی می‌توانند در منابع مختلف حیوانی حضور داشته باشند و دام‌ها نیز می‌توانند به‌عنوان مخازن بالقوه این باکتری عمل کنند. مطالعات اپیدمیولوژیک پیشین نیز نشان داده‌اند توزیع گونه‌های کمپیلوباکتر در میزبان‌های مختلف به عوامل متعددی ازجمله شرایط اقلیمی، شیوه‌های پرورش دام، مدیریت بهداشتی و حتی تفاوت‌های ژنتیکی سویه‌ها وابسته است (1، 26).

در این مطالعه، حضور کمپیلوباکتر در نمونه‌های آب نیز مشاهده شد، هرچند میزان آن نسبتاً پایین بود. وجود این باکتری در منابع آب می‌تواند نشان‌دهنده آلودگی محیطی ناشی از دفع فضولات حیوانی یا ورود پساب‌های دامداری و کشتارگاه‌ها به منابع آب باشد. برخی مطالعات نشان داده‌اند کمپیلوباکتر می‌تواند برای مدت معینی در محیط‌های آبی زنده بماند و از این طریق در چرخه انتقال بیماری نقش داشته باشد (27)؛ بنابراین، پایش میکروبی منابع آب از نظر حضور این باکتری می‌تواند از نظر بهداشت عمومی اهمیت داشته باشد.

در بخش بررسی ژن‌های مرتبط با سیستم‌های ترشحی، نتایج نشان دادند ژن flaA در 66 درصد جدایه‌ها وجود دارد. ژن flaA یکی از ژن‌های کلیدی در ساختار فلاژل کمپیلوباکتر است که نقش مهمی در حرکت باکتری، کلونیزاسیون روده میزبان و توانایی تهاجم به سلول‌های اپی‌تلیال دارد (10). وجود این ژن در درصد قابل توجهی از جدایه‌ها نشان‌دهنده پتانسیل بیماری‌زایی بالای این سویه‌ها است. مطالعات مختلف نشان داده‌اند حضور ژن‌های مرتبط با فلاژل در کمپیلوباکتر با افزایش توانایی کلونیزاسیون و انتقال در زنجیره غذایی مرتبط است (28). در مقابل، ژن virB11 که به سیستم ترشحی نوع چهارم T4SS مرتبط است، در هیچ‌یک از جدایه‌های بررسی‌شده شناسایی نشد. سیستم‌های ترشحی نوع چهارم در برخی سویه‌های کمپیلوباکتر در انتقال عوامل حدت و DNA نقش دارند و ممکن است در افزایش بیماری‌زایی دخیل باشند (26)؛ با این حال، حضور این ژن‌ها در میان سویه‌های مختلف کمپیلوباکتر بسیار متغیر گزارش شده است و در بسیاری از مطالعات نیز فراوانی پایین یا حتی عدم حضور آن گزارش شده است؛ بنابراین، عدم شناسایی ژن virB11 در مطالعه حاضر ممکن است نشان‌دهنده ویژگی‌های ژنتیکی خاص سویه‌های منطقه مطالعه‌شده باشد.

از نتایج مهم این پژوهش، وجود ارتباط آماری معنی‌دار بین گونه کمپیلوباکتر و حضور ژن flaA بود (۰٫۰۵ P>). این یافته نشان می‌دهند توزیع این ژن در میان گونه‌های مختلف کمپیلوباکتر یکسان نیست و احتمالاً در گونه کمپیلوباکتر ژژونی فراوانی بیشتری دارد. از آنجا که این ژن در حرکت‌پذیری و تهاجم باکتری نقش دارد، وجود آن می‌تواند در افزایش توان بیماری‌زایی سویه‌ها مؤثر باشد (25). برخی مطالعات نیز نشان داده‌اند تفاوت در توزیع ژن‌های حدت میان گونه‌های مختلف کمپیلوباکتر می‌تواند در تفاوت‌های اپیدمیولوژیک و بالینی عفونت‌ها نقش داشته باشد (28).

از دیدگاه بهداشت عمومی، نتایج این مطالعه اهمیت کنترل آلودگی کمپیلوباکتر در زنجیره تولید مواد غذایی، به‌ویژه در صنعت طیور را برجسته می‌کند. اجرای برنامه‌های ایمنی زیستی در مزارع پرورش طیور، رعایت اصول بهداشتی در کشتارگاه‌ها، کنترل آلودگی متقاطع در فرآوری مواد غذایی و نظارت مستمر بر کیفیت آب می‌تواند نقش مهمی در کاهش شیوع این باکتری داشته باشد (29). علاوه بر این، استفاده از روش‌های مولکولی پیشرفته برای شناسایی ژن‌های حدت و تعیین الگوهای ژنتیکی سویه‌ها می‌تواند به درک بهتر اپیدمیولوژی این باکتری و طراحی راهکارهای پیشگیرانه کمک کند. یک مطالعه نشان داد بیشترین آلودگی کمپیلوباکتر در نمونه‌های مرغ مشاهده شد و پس از آن گاو، آب و در نهایت گوسفند و بز قرار گرفتند؛ این یافته نقش مهم طیور را به‌عنوان مخزن اصلی این باکتری در انتقال به انسان برجسته می‌کند (30). همچنین، شناسایی ژن‌های بیماری‌زایی cadF، ciaB، cdtA، cdtB، cdtC و pldA نشان داد جدایه‌های به‌دست‌آمده دارای پتانسیل بالای تهاجمی و بیماری‌زایی هستند (30). درمجموع، یافته‌های این پژوهش نشان می‌دهند کمپیلوباکتر همچنان به‌عنوان یک عامل مهم بیماری‌زا در منابع حیوانی حضور دارد و طیور نقش اساسی در چرخه انتقال آن دارند؛ بنابراین، پایش مداوم این باکتری در منابع غذایی و محیطی و بررسی عوامل حدت آن می‌تواند در کنترل عفونت‌های ناشی از کمپیلوباکتر و ارتقای سلامت عمومی مؤثر باشد.

نتیجه‌گیری

نتایج این مطالعه نشان دادند از میان ۳۹۲ نمونه بررسی‌شده، ۵۰ جدایه کمپیلوباکتر شناسایی شد که شیوع کلی آن ۱۲٫۸ درصد بود. بیشترین میزان جداسازی مربوط به نمونه‌های مرغ بود که نشان‌دهنده نقش مهم طیور به‌عنوان مخزن اصلی این باکتری است. در بررسی گونه‌ای، کمپیلوباکتر ژژونی گونه غالب شناخته شد و پس از آن کمپیلوباکتر کولی قرار داشت. همچنین بررسی ژن‌های مرتبط با سیستم‌های ترشحی نشان داد ژن flaA در بخش قابل توجهی از جدایه‌ها وجود دارد و بین نوع گونه و حضور این ژن ارتباط آماری معنی‌داری مشاهده شد؛ درحالی‌که ژن virB11 در هیچ‌یک از جدایه‌ها شناسایی نشد. این یافته‌ها نشان می‌دهند سویه‌های بررسی‌شده از نظر عوامل حدت دارای تنوع ژنتیکی بوده‌اند و برخی از آنها دارای پتانسیل بیماری‌زایی بالاتری هستند. با توجه به اهمیت کمپیلوباکتر به‌عنوان یکی از عوامل مهم بیماری‌های منتقله از غذا، تقویت برنامه‌های بهداشتی در زنجیره تولید طیور، پایش میکروبی منابع غذایی و محیطی و انجام مطالعات مولکولی گسترده‌تر برای شناسایی عوامل حدت و مسیرهای انتقال این باکتری ضروری به نظر می‌رسد.

[1]Guillain-Barre syndrome

[2] Reactive arthritis

[3] Campylobacter jejuni

[4] Campylobacter coli

[5]- cross‑sectional experimental study

[6] Kappadnis‑Baserisalehi

[7] Chi‑square

[8] Fisher’s exact test