پاسخ‌های متابولیکی ناشی از نانو ذرات نقره در ریز جلبک سبز Dunaliella salina

مقدمه

نانوذرات، ذرات فلزی یا غیر­فلزی با ابعاد کمتر از 100 نانومتر هستند که به علّت ویژگی­های منحصربه فرد فیزیکوشیمیایی و زیستی به طور گسترده­ای در زمینه­های مختلف صنعتی، دارویی، پزشکی، کشاورزی و بیوتکنولوژی مورد استفاده قرار می­گیرند (Wang et al., 2018; Aminzai et al., 2024; Srinivasan & Rana, 2024). کاربردهای وسیع سبب افزایش تولید مهندسی شده نانوذرات شده است، به طوری که نانوذراتی با ترکیب شیمیایی یکسان و ویژگی­های کاربردی متفاوت تولید شده­اند (Azizian-Shermeh et al., 2017; Xiong et al., 2022). تولید گسترده نانوذرات منجر به آزاد شدن آنها در محیط زیست و بر همکنش آنها با موجودات زنده شده است. این مساله می تواند اثرات اکولوژیکی و زیست محیطی مختلفی ایجاد نموده و به عنوان یک تهدید برای اکوسیستم در نظر گرفته شود (Zou et al., 2017; Khan et al., 2021; Wang et al., 2024). این اثرات بسته به نوع، غلظت و اندازه نانوذره و همچنین نوع موجود زنده و مدت زمان قرارگیری آن در معرض نانوذرات می تواند متفاوت باشند (Lalau et al., 2015; Bandyopadhyay et al., 2015; ‎Aigbe & Osibote, 2024; Rajput et al., 2024).

نانوذرات نقره به علّت کاربرد گسترده در بسیاری از صنایع، یکی از تجاری­ترین و پرمصرفترین نانوذرات به حساب می آیند (Zou et al., 2016). این کاربرد گسترده احتمال انتشار این نانوذره را در محیط زیست افزایش داده و یک تهدید بالقوه برای سیستم­های زنده به حساب می­آید (Panyala et al., 2008; Impellitteri et al., 2009). علاوه بر باکتری­ها و جانوران، اثرات سمی این نانوذرات بر رشد و متابولیسم گیاهان مختلف مثل آرابیدوپسیس (Ma et al., 2010; Syu et al. 2014) ، (Yin et al., 2011)Lolium multiforum ، (Krishnaraj et al., 2012)Bacopa monnieri  و سایر گیاهان آبزی و جلبک ها مثل Wolffia globosa (Zou et al., 2017)، (Oukarroumet al., 2012a, 2012b) Chlorella vulgaris و Dunaliella tertiolecta گزارش شده است. این اثرات مخرب در سطوح مختلف سلولی، بیوشیمیایی و یا فیزیولوژیک مشاهده شده و شامل کاهش کارایی فتوسیستم II؛ ممانعت از جوانه زنی دانه، بیوسنتز کلروفیل، فعالیت چرخه کالوین؛ القای تنش اکسیداتیو و ممانعت از مسیر سیگنالی اتیلن است (Xu et al., 2010; Oukarroumet al., 2012a, 2012b; Syu et al., 2014). علاوه بر این، اثرات تحریک کننده نانوذرات نقره بر رشد ریشه Brassica juncea (Sharma et al., 2012) یا بر تقسیم سلولی، متابولیسم و مسیرهای سیگنالی هورمون اتیلن در آرابیدوپسیس (Syu et al. 2014) نیز گزارش شده­اند. با این وجود، درک دقیق پاسخ گیاهان به نانوذرات مهندسی شده از جمله نانوذرات نقره نیازمند بررسی سازوکار­های سمیت آنها بر روی گونه­های بیشتری است.

جلبک سبز تک سلولی Dunaliella یک میکروارگانیسم یوکاریوت فاقد دیواره سلولی بوده که در برابر تنش‌های غیر­زیستی تحمل خوبی نشان داده و به همین علّت اغلب به عنوان یک سیستم مدل در پژوهش‌های فیزیولوژی تنش مورد استفاده قرار می­گیرد (Avron & Ben-Amotz, 1992; Borowitzka, 2013; Barbosa et al., 2023). برخی از گونه­های این جلبک مثل D. salina و D. bardawil می­توانند به واسطه تجمع مقادیر بالای بتاکاروتن، شرایط نامساعد محیطی را تحمل کنند. این واکنش به عنوان پاسخ اصلی و رایج این گونه­ها تحت تنش اکسیداتیو گزارش شده است (Ben-Amotz et al., 1982; Shaish et al., 1993; Salguero et al., 2003; Einali & Shariati, 2015; Goswami et al., 2022). با این وجود، گونه­های Dunaliella که مقادیر اندکی بتاکاروتن ذخیره می­کنند، از قبیل D. viridis نیز به خوبی تنش اکسیداتیو را تحمل می­کنند که این امر می­تواند نشان دهنده دخالت سایر راهکارها از جمله آنزیم­های آنتی اکسیدان در تحمل تنش باشد (Jimenez & Pick, 1993; Haghjou et al., 2009). جلبک Dunaliella یک مدل بسیار مفید برای پژوهش‌های نانوذرات است، زیرا برخلاف اکثر ریزجلبک‌ها، فاقد دیواره سلولی سلولزی بوده و در عوض، تنها توسط یک غشای پلاسمایی و یک لایه خارج سلولی شبیه گلیکوکالیکس احاطه شده است. این امر سبب می‌شود که نسبت به برهمکنش‌ها و جذب نانوذرات-سلول حساس‌تر باشد (Johari et al., 2018; Bahador et al., 2019). جذب نانوذرات نقره توسط سلول‌های جلبکی مانند Dunaliella معمولاً توسط ترکیبی از فرآیندهای غیرفعال و فعال، شامل جذب سطحی روی سطح سلول از طریق برهمکنش‌های الکترواستاتیک، نیروهای وان در والس، اتصال به پلی‌ساکاریدها و پروتئین‌های خارج سلولی و یا نفوذ به غشاء شامل نفوذ مستقیم به غشاء، جذب شبه اندوسیتوز و انتقال توسط کانال‌های غشایی، رخ می‌دهد (Miao et al., 2010). از آنجایی که استفاده نانوذرات می تواند قابلیت تولید ترکیبات زیستی مهم اقتصادی توسط ریزجلبک‌ها را به شدت تحت تأثیر قرار دهد (Bahador et al., 2019; Nguyen et al., 2019; Yuan et al., 2023)، بنابراین تغییرات متابولیکی القا شده توسط نانوذرات نقره می­تواند بر میزان تولید و تجمع این ترکیبات زیستی با ارزش در ریزجلبک Dunaliella تأثیر­گذار بوده و بیانگر اهمیت تأثیر هر دو جنبه بیوتکنولوژیک و اکولوژیک نانوذرات باشد. بنابراین، هدف از پژوهش حاضر، بررسی پاسخ­های متابولیکی و آنتی اکسیدانی جلبک سبز D. salina به نانوذرات نقره به عنوان یک نانوذره پر­کاربرد است.

مواد و روش‌ها

بیوسنتز و مشخصه­یابی نانوذرات نقره

در این پژوهش، نانوذرات نقره توسط روش سنتز سبز توصیف شده توسط Azizian-Shermeh et al. (2017) توسط ترکیب محلول 1 میلی مولار نیترات نقره (AgNO₃) و عصاره آبی گیاه بابونه آلمانی (Matricaria comomilla) شامل برگ و گل به عنوان یک عامل احیاکننده در نسبت حجمی 2 به 1 در درجه حرارت اتاق سنتز شدند. گیاه بابونه از گلخانه جمع­آوری و بخش­های مورد استفاده به مدت یک هفته در دمای اتاق و دور از نور خورشید خشک شدند. عصاره آبی صاف شده با غلظت 5 درصد، از پودر تهیه شده از این بخش­ها از طریق افزودن آب مقطر و قرار گرفتن در دمای 50 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 دقیقه تهیه شد. ریخت شناسی نانوذرات نقره بیوسنتز شده توسط میکروسکوپ الکترونی عبوری  (TEM) تعیین شد. همچنین غلظت مولی نانوذرات نقره سنتز شده توسط رابطه (1) ارائه شده توسط (2007) Liu et al. محاسبه شد.

رابطه 1:                                               C = N_Total/NVN_A

که در این رابطه، N_total، معادل مقدار اولیه نمک نقره اضافه شده به محلول واکنش، N، میانگین تعداد اتم‌های نقره در هر نانوذره، V، حجم محلول واکنش بر حسب لیتر و N_A عدد آووگادرو است.

کشت جلبک و تیمارهای آزمایشی

جلبک Dunaliella salina سویه UTEX 200 از مجموعه کشت جلبک دانشگاه تگزاس آمریکا تهیه شد. سلول­های جلبکی در محلول غذایی تعدیل شده جانسون (pH=7.5) حاوی غلظت 5/1 مولار نمک NaCl، بر اساس روش­های ذکر شده در منابع پیشین کشت شدند (Johnson et al., 1968; Shariati & Lilley, 1994). سوسپانسیون­های جلبکی در اتاق کشت در دمای 25 درجه سانتی‌گراد با یک رژیم نوری 16 ساعت روشنایی (شدت نور 70 میکرومول فوتون بر متر مربع بر ثانیه) و 8 ساعت تاریکی روی شیکر (100 دور بر دقیقه) به صورت مداوم قرار گرفتند تا به مرحله لگاریتمی رشد برسند. سپس سوسپانسیون­ها با غلظت­های 0، 5، 15 و 25 پیکومولار نانوذرات نقره تیمار شدند. سوسپانسیون تیمار نشده با نانوذرات به عنوان کنترل در نظر گرفته شد. هر تیمار در سه تکرار و نمونه­برداری قبل از تیمار با نانوذرات نقره (به‌عنوان زمان صفر) و 48 ساعت پس از آن انجام شد.

شمارش سلولی، وزن تر و میزان رنگیزه­ها

شمارش سلول­های جلبکی توسط لام هموسایتومتر زیر میکروسکوپ نوری انجام شد (Schoen, 1988). رسوب جلبکی حاصل از سانتریفیوژ 30 میلی لیتر سوسپانسیون جلبکی برای مدت 10 دقیقه با نیروی g 2000، با استفاده از محیط کشت تازه حاوی 2/0 مولار نمک شستشو داده شده و پس از سانتریفیوژ دوباره، وزن تر آن تعیین شد (Haghjou et al., 2014). جهت استخراج رنگیزه­های فتوسنتزی شامل کلروفیل و بتاکاروتن، رسوب جلبکی حاصل از سانتریفیوژ یک میلی لیتر سوسپانسیون جلبکی برای مدت 5 دقیقه با نیروی g 2000 با 1 میلی لیتر استون 80 درصد مخلوط و پس از ورتکس شدید دوباره به مدت 2 دقیقه در نیروی g 10.000 سانتریفیوژ شد. جهت اندازه­گیری میزان کلروفیل­ها، جذب محلول رویی در طول موج های 663، 645 و 652 تعیین و غلظت کلروفیل­ها توسط روابط 2 تا 4 محاسبه شدند (Arnon, 1949).

رابطه 2:

Chl a (mg ml^-1) = 0.0127 A₆₆₃- 0.00269 A₆₄₅

رابطه 3:

Chl b (mg ml^-1) = 0.0229 A₆₄₅ - 0.00468 A₆₆₃       

رابطه 4: 

Total Chl (mg ml^-1) = A₆₅₂/34.5 

همچنین، جذب محلول رویی در طول موج 480 نانومتر نیز اندازه­گیری و مقدار بتاکاروتن توسط ضریب جذب برابر با 2273E_1cm^1% =  محاسبه شد (Ben-Amotz & Avron, 1983).

استخراج و اندازه­گیری قندهای محلول و نشاسته

قندهای محلول شامل قندهای احیاکننده، غیراحیاکننده و کل، از رسوب جلبکی (حاصل از 30 میلی لیتر سوسپانسیون جلبکی، همانطور که در بالا توصیف شد) رنگبری شده با استون، توسط اتانول 80% در دمای 70 درجه سانتی‌گراد به مدت 10 دقیقه استخراج شدند (Mirshekari et al., 2017). از عصاره­های اتانولی تغلیظ شده برای تعیین میزان قندهای محلول استفاده شد. قندهای احیاکننده بر اساس روش دی نیتروسالیسیلیک اسید توصیف شده توسط (1959) Miller در طول موج 575 نانومتر و توسط گلوکز به عنوان استاندارد اندازه­گیری شدند. قندهای غیراحیاکننده از طریق روش (1968) van Handle و پس از حذف قندهای احیاکننده از طریق افزودن محلول هیدروکسید پتاسیم 30 درصد به عصاره اتانولی و حرارت در 100 درجه سانتی‌گراد به مدت 10 دقیقه، در طول موج 620 نانومتر توسط سوکروز به عنوان استاندارد تعیین شدند. میزان قند محلول کل از مجموع قندهای احیاکننده و غیراحیاکننده به دست آمد. بقایای حاصل از استخراج قندهای محلول برای استخراج نشاسته با استفاده از روش اصلاح شده هیدرولیز اسیدی مورد استفاده قرار گرفتند (McCready et al., 1950; Mirshekari et al., 2017). بر اساس این روش، پس از افزودن اسید پرکلریک 52% به بقایای حاصل از استخراج قندهای محلول، میزان گلوکز حاصل از شکستن نشاسته موجود در بقایا از روش آنترون با استفاده از گلوکز به عنوان استاندارد اندازه­گیری شد (McCready et al., 1950). جهت انجام این کار، 2/0 میلی لیتر از عصاره حاصل از هیدرولیز اسیدی نشاسته با 3 میلی لیتر معرف آنترون (150 میلی­گرم آنترون در 100 میلی­لیتر اسید سولفوریک 13 مولار) مخلوط و پس از 20 دقیقه حرارت در 100 درجه سانتی‌گراد، میزان جذب نمونه در 620 نانومتر ثبت شد. غلظت نشاسته توسط اعمال ضریب 9/0 در مقدار گلوکز به دست آمده محاسبه شد (McCready et al., 1950).

تعیین مقادیر پروتئین کل و آمینواسید آزاد کل

استخراج پروتئین کل از رسوب جلبکی (حاصل از 30 میلی لیتر سوسپانسیون جلبکی) رنگبری شده با استون با استفاده از روش توصیف شده توسط (1997) Stone & Gifford  همراه با تغییراتی (Mirshekari et al., 2017) انجام شد. به‌طور خلاصه، 5/0 میلی لیتر بافر استخراج پروتئین کل (شامل 60 میلی مولار بافر تریس (pH=6.8)، 10% گلیسرول و 2% سدیم دودسیل سولفات) به رسوب جلبکی اضافه و مخلوط حاصل به مدت 60 دقیقه در دمای 90 درجه سانتی‌گراد قرار گرفت. پس از سانتریفیوژ با نیروی g 10.000 به مدت 15 دقیقه، میزان پروتئین کل عصاره حاصل طبق روش فولین توصیف شده توسط (1981) Markwell et al. در طول موج 750 نانومتر با استفاده از منحنی استاندارد آلبومین سرم گاوی تعیین شد. استخراج اسیدهای آمینه آزاد مشابه قندهای محلول انجام شد با این تفاوت که رسوب تازه جلبکی به جای رسوب رنگبری شده مورد استفاده قرار گرفت (Mirshekari et al., 2019). رنگ‌زدایی عصاره اتانولی غلیظ با افزودن کلروفرم به عصاره به نسبت 1 به 5 انجام شد. مقدار کل محتوای اسیدآمینه آزاد، با روش نین هیدرین (1955) Yemm et al. توسط گلیسین به عنوان استاندارد تعیین شد. بدین منظور، 1/0 میلی لیتر عصاره الکلی با 1 میلی لیتر اتانول 80 %، 1 میلی لیتر بافر سیترات (pH=5) و 2 میلی لیتر معرف نین هیدرین (1% نین هیدرین و 06/0% سیانید پتاسیم در استون) مخلوط و حجم نهایی با آب مقطر به 1/5 میلی لیتر رسید. مخلوط واکنش به مدت 15 دقیقه در دمای 100 درجه سانتی‌گراد قرار گرفته و جهت توقف واکنش به مدت 5 دقیقه در آب معمولی قرار داده شد. جذب هریک از نمونه­ها پس از افزودن 8 میلی لیتر آب مقطر، در طول موج 570 نانومتر خوانده شد.

استخراج و سنجش پروتئین­های محلول و آنزیم­ها

عصاره سلولی حاوی پروتئین­های محلول و آنزیم‌ها از رسوب تازه جلبکی (حاصل از 30 میلی لیتر سوسپانسیون جلبکی) با 1 میلی‌لیتر از بافر استخراج آنزیمی حاوی 100 میلی‌مولار بافر پتاسیم فسفات سرد (pH 7.0)، 10 درصد گلیسرول، 1 میلی‌مولار EDTA، 10 میلی‌مولار KCl، 1 میلی‌مولارMgSO₄ ، 1 میلی مولار فنیل متیل سولفونیل فلوراید (PMSF)، 50 میلی مولار 2- مرکاپتواتانول، 1/.% تریتون-X-100 و 1% پلی وینیل پلی پیرولیدون (PVPP) استخراج شد. برای استخراج آنزیم آسکوربات پراکسیداز (APX)، 5 میلی مولار آسکوربیک اسید به بافر استخراج اضافه شد. سوسپانسیون جلبکی برای دو دوره 30 ثانیه ای با فاصله زمانی دو دقیقه در معرض امواج اولتراسونیک قرار داده شده و سپس در دمای 4 درجه سانتی‌گراد به مدت 1 ساعت قرار گرفت. رنگ زدایی از مخلوط با افزودن 10 میلی­گرم زغال فعال و سانتریفیوژ به مدت 10 دقیقه در نیروی g 10.000 تحت دمای 4 درجه سانتی‌گراد انجام شد. مایع رویی (حاوی پروتئین­های محلول) برای تعیین فعالیت آنزیمی استفاده شد. محتوای پروتئین محلول بر اساس روش (1976) Bradford در طول موج 595 نانومتر با استفاده از منحنی استاندارد آلبومین سرم گاوی اندازه گیری شد. مقدار فعالیت آنزیم کاتالاز (CAT) با روش Lück (1965) تعیین شد. مخلوط واکنش (1 میلی لیتر) شامل 50 میلی­مولار بافر فسفات پتاسیم (pH 7.0)، 5/12 میلی­مولار H₂O₂، و 30 میکرولیتر عصاره آنزیمی بود. نرخ تجزیه هیدروژن پراکسید در مدت زمان یک دقیقه در240 نانومتر با استفاده از ضریب خاموشی cm² μmol⁻¹0394/0 تعیین شد. میزان فعالیت APX با روش (1992) Chen & Asada تعیین شد. مخلوط واکنش (1 میلی لیتر) شامل 50 میلی­مولار بافر فسفات پتاسیم (pH 7.0)، 1 میلی­مولار H₂O₂، 5/0 میلی­مولار آسکوربیک اسید و 50 میکرولیتر عصاره آنزیمی بود. میزان تولید دهیدروآسکوربات در مدت زمان یک دقیقه در290 نانومتر با فرض ضریب خاموشی cm² μmol⁻¹8/2 تعیین شد.

تجزیه و تحلیل آماری

نتایج به صورت میانگین و انحراف معیار (SD) سه اندازه­گیری از سه سوسپانسیون جلبکی مجزا بیان شد. تفاوت معنی‌دار آماری بین تیمارها توسط آنالیز واریانس (ANOVA) و آزمون دانکن در سطح 05/0 (0.05> P) تعیین شد.

نتایج و بحث

ویژگی­های نانوذرات نقره بیوسنتز شده:

تغییر رنگ مخلوط واکنش از قهوه­ای کم‌رنگ به قهوه‌ای به شدت تیره، بلافاصله پس از ترکیب نمک نیترات نقره و عصاره آبی گیاه، نشان‌دهنده تشکیل نانوذرات نقره است (شکل 1-A)، که می‌توان آن را به احیای یون‌های نقره توسط عصاره آبی برگ و گل گیاه بابونه آلمانی، به علّت سرشار بودن این بخش­ها از اسانس و ترکیبات طبیعی (Rehmat et al., 2020)، نسبت داد (Rajasekharreddy et al., 2010; Azizian-Shermeh et al., 2017). طیف جذبی نانوذرات نقره (شکل 1-B)، پیک جذب در 410 نانومتر را نشان داد که مربوط به رزونانس پلاسمون سطحی (SPR) نانوذرات نقره است (Kouvaris et al., 2012). همچنین در تصویر TEM، نانوذرات نقره به صورت ذرات منفرد پراکنده با شکل کروی همگن و اندازه 5 تا 20 نانومتر با اندازه متوسط ​​13 نانومتر مشاهده شدند (شکل 1-C). هیستوگرام توزیع اندازه نانوذرات نقره، نانوذراتی با بیشترین فراوانی با قطر 15 نانومتر را نشان داد (شکل 1-D).

شکل 1- تغییر رنگ (A)، طیف جذبی (B)، تصویر میکروسکوپ الکترونی گذاره (C) و توزیع اندازه نانوذرات (D) نقره سنتز شده از طریق ترکیب محلول 1 میلی‌مولار نیترات نقره (AgNO₃) و عصاره آبی برگ‌ها و گل‌های بابونه آلمانی (Matricaria comomilla) با نسبت 1:2 (حجمی/حجمی) در دمای اتاق.

Figure 1- Color change (A), Absorption spectrum  (B), Transmission electron microscope image (C) and particle size distribution (D) of synthesized AgNPs by combining 1 mM silver nitrate (AgNO₃) solution and the aqueous extract of leaves and flowers of German chamomile (Matricaria comomilla) at a ratio of 1: 2 (v/v) at room temperature.

تغییرات در تعداد سلول، وزن تر و میزان رنگیزه­های فتوسنتزی:

تعداد سلول­ها در پاسخ به غلظت­های مختلف نانوذرات نقره به ویژه در 15 و 25 پیکومولار در مقایسه با کنترل کاهش پیدا کرد (شکل 2-A). این امر بیانگر آن است که نانوذرات نقره می تواند بر تقسیم سلولی در غلظت­های بالا تأثیر داشته باشد، به عبارت دیگر، سلول­های جلبکی این غلظت­ها را به خوبی تحمل می کنند. اثرات منفی نانوذرات فلزی به ویژه نانوذرات نقره بر شاخص میتوزی و تقسیم سلولی گیاهان مختلف از جمله جلبک D. salina قبلاً نیز گزارش شده است (Fouad & Hafez, 2018; Bahador et al., 2019; Wang et al., 2020). بنابراین، نقطه هدف نانوذرات نقره در سلول­های جلبکی که موجب کاهش تعداد سلول­ها شده است می تواند چرخه و تقسیم سلولی باشد. با وجود این، گزارش­هایی در مورد نقش مثبت نانوذرات نقره به ویژه در غلظت­های پائین در بهبود تجمع پروتئین­های دخیل در چرخه سلولی در ریشه­های گیاه آرابیدوپسیس که منجر به افزایش طولی ریشه شده وجود دارد (Syu et al., 2014; Wang et al., 2020). این نقش مثبت در برخی دیگر از گیاهان نیز مشاهده شده است (Salama, 2012; Latif et al., 2017; Nghia et al., 2017). همچنین طبق پژوهش‌ها مشخص شده است که نانوذرات نقره با ریخت شناسی و اندازه­های مختلف که می­تواند به منشاء ساخت آنها مربوط باشد (Azizian-Shermeh et al., 2017)، پاسخ­های متفاوتی را در رشد گیاه و بیان ژن­ها در گیاهچه­های آرابیدوپسیس موجب شده­اند (Syu et al., 2014). همچنین اثرات متفاوت دو نوع نانوذره نقره سنتز شده توسط زیستی و شیمیایی بر صفات فیزیولوژیکی گیاه Eschscholzia californica نیز مشاهده شده است (Hajian et al., 2022). به این ترتیب، پاسخ­های متفاوت موجودات مختلف به نانوذرات نقره می­تواند ناشی از اختلاف در فرم­های این نانوذرات باشد. بر عکس، وزن تر سلول­های جلبکی به تدریج تحت تأثیر نانوذرات نقره افزایش یافته و در غلظت­های 15 و 25 پیکومولار افزایش معناداری نسبت به کنترل نشان دادند (شکل 2-B). مقایسه اثرات نانوذرات نقره بر تعداد و وزن تر سلول­های جلبکی (شکل 2) نشان می‌دهد که یک همبستگی منفی بین آنها وجود دارد. مشابه با نتایج ما، یک رابطه عکس بین تعدادسلول و وزن تر در D. tertiolecta در معرض تابش فرا بنفش (Garcia-Gomez et al., 2012)، D. viridis تیمار شده با مناداین (Haghjou et al., 2014)، D. bardawil در معرض پروپیل گالات (Einali, 2018)، D. salina  تحت کمبود نیتروژن (Mirshekari et al., 2019) و D. salina تیمار شده با نانوذرات نقره سنتز شده با عصاره برگ Momordica charantia (Bahador et al., 2019) گزارش شده است. به هر حال، بر خلاف پژوهش‌های ذکر شده که در آنها افزایش وزن تر ناشی از تجمع لیپیدها یا سایر متابولیت­ها است، در D. bardawil تیمار شده با نانوذرات اکسید مس (Bamary et al., 2025) فاکنورهای دیگری مثل سنتز گلیسرول ممکن است نقش داشته باشند. در پژوهش حاضر، فاکتورهایی مثل افزایش اگزوپلیمرهای خارجی سلول جلبک (شامل پلی­ساکاریدها، پروتئین­ها، لیپیدها، مواد موکوسی  و مواد پلیمری خارج سلولی) (Nguyen et al., 2020; Vargas-Estrada et al., 2020)، سنتز احتمالی گلیسرول یا لیپید، اختلال در قابلیت و سلامت غشاءها و همچنین اختلال در نفوذپذیری غشاء (Bhuvaneshwari et al., 2015; Wang et al., 2016) ممکن است در افزایش وزن تر سلول­ها دخیل باشند.  

شکل 2- تغییرات در تعداد (A) و وزن تر (B) سلول‌های Dunaliella salina تیمار شده با غلظت‌های مختلف نانوذرات نقره پس از ۴۸ ساعت نشان داده شده است. ستون‌ها میانگین ± انحراف معیار سه اندازه‌گیری جداگانه هستند. تغییرات آماری معنی‌دار بین تیمارهای مختلف در سطح معنی‌داری P < 0.05 با استفاده از آزمون دانکن تعیین و با حروف متفاوت نشان داده شده‌اند.

Figure 2- Changes in number (A) and fresh weight (B) of Dunaliella salina cells treated with different concentrations of phytosynthesized AgNPs are shown after 48 h. Columns are mean ± SD of three separate measurements. Statistically significant changes between different treatments at P < 0.05 were determined using Duncan’s test and indicated by different letters.

 میزان رنگیزه­های فتوسنتزی شامل کلروفیل a، b و کل در پاسخ به تیمارهای نانوذرات نقره به شدت کاهش نشان دادند، به عبارت دیگر، بیشترین کاهش در غلظت های 15 و 25 پیکومولار نانوذرات مشاهده شد (شکل‌های 3-A تا C). این کاهش بیانگر تأثیر منفی نانوذرات نقره بر سیستم فتوسنتزی سلول­های جلبکی است. اثر منفی نانوذرات نقره بر تجمع رنگیزه­ها نیز قبلاً گزارش شده است (Oukarroum et al., 2012b; Zou et al., 2017). با وجود این،گزارش­هایی در مورد تأثیر مثبت این نانوذرات بر میزان رنگیزه­ها و فتوسنتز نیز وجود دارد (Farghaly & Nafady, 2015; Latif et al., 2017; Sadak, 2019; Bahador et al., 2019). این اختلاف در میزان رنگیزه­ها در پاسخ به نانوذرات نقره می تواند بطور روشن بیان کننده آن باشد که اثر نانوذرات نقره بر فتوسنتز بسته به نوع و ویژگی­های نانوذره سنتز شده متفاوت است. نسبت کلروفیل a/b در همه تیمارهای نانوذرات به ویژه در غلظت 15 پیکومولار در مقایسه با کنترل به شدت کاهش پیدا کرد (شکل 3-D). این کاهش بیانگر حساسیت بیشتر کلروفیل a سلول­های جلبکی به نانوذرات نقره در مقایسه با کلروفیل b است. میزان بتاکاروتن سلول­های تیمار شده با غلظت­های 15 و 25 پیکومولار نانوذرات بیشترین کاهش را نسبت به کنترل نشان داد (شکل 3-E). از آنجا که بتاکاروتن یک آنتی اکسیدان بسیار مهم در اغلب سلول­های Dunaliella به شمار می­رود (Ben-Amotz & Avron, 1983; Jahnke & White, 2003; Mishra et al., 2008; Mishra & Jha, 2011; Einali, 2018)، کاهش مقدار آن تحت تأثیر نانوذرات نقره، حساسیت سیستم­های فتوسنتزی سلول­های جلبکی به این نانوذرات را بیشتر تأئید می کند.

شکل 3- تغییرات در محتوای کلروفیل a (A)، کلروفیل b (B)، کلروفیل کل (C)، نسبت کلروفیل a/b (D)، بتاکاروتن (E) و نسبت بتاکاروتن به کلروفیل کل (F) در سلول‌های Dunaliella salina تیمار شده با غلظت‌های مختلف نانوذرات نقره پس از 48 ساعت. نتایج میانگین ± انحراف معیار سه آزمایش جداگانه هستند. حروف متفاوت نشان دهنده تغییرات معنی‌دار بین تیمارهای مختلف در سطح معنی‌داری P < 0.05 بر اساس آزمون دانکن هستند.

Figure 3- Changes in the content of Chl a (A), Chl b (B), total Chl (C), Chl a/b (D), β-carotene (E), and the ratio of β-carotene to total Chl (F) in Dunaliella salina cells treated with different concentrations of AgNPs after 48 h. Results are the mean ± SD of three separate experiments. Different letters show significant changes between different treatments at P < 0.05 based on Duncan’s test.

با توجه به نقش محافظتی بتاکاروتن در حفظ کلروفیل در برابر رادیکال­های آزاد اکسیژن در این جلبک (Einali, 2018; Panjekobi & Einali, 2021)، چنین کاهشی در میزان بتاکاروتن می­تواند کاهش محتوای کلروفیل را در سلول­های تیمار شده با نانوذرات نقره توضیح دهد. به هر حال، این نتایج بر خلاف تأثیر مثبت نانوذرات نقره سنتز شده با عصاره برگ Momordica charantia بر میزان بتاکاروتن جلبک D. salina است (Bahador et al., 2019). این اختلاف می­تواند به تفاوت در ویژگی های نانوذرات ساخته شده نسبت داده شود. نسبت بتاکاروتن به کلروفیل کل در همه تیمارهای نانوذرات به ویژه غلظت­های 15 و 25 پیکومولار به صورت معنی دار کاهش پیدا کرد (شکل 3-F). کاهش این نسبت در سلول­های جلبکی، بیانگر حساسیت بیشتر رنگدانه بتاکاروتن به نانوذرات نقره در مقایسه با کلروفیل است.

تغییرات در میزان پروتئین کل، پروتئین محلول و آمینواسید آزاد کل:    

منظور از پروتئین کل، پروتئین‌های استخراج‌شده با بافر استخراج در حضور سدیم دودسیل سولفات است (Stone & Gifford, 1997; Einali & Sadeghipour, 2007)، در حالی که پروتئین محلول، پروتئین­های استخراج شده با بافر استخراج آنزیم است (Einali & Sadeghipour, 2007). مقدار پروتئین‌های سلول­های جلبکی استخراج‌شده با بافر استخراج پروتئین کل در حالت کنترل بیش از دو برابر بیشتر از پروتئین‌های استخراج‌شده با بافر استخراج آنزیمی بود (شکل 4-A و B). میزان پروتئین­های محلول و پروتئین کل سلول­های جلبکی تیمار شده با نانوذرات نقره نسبت به شاهد به شدت کاهش یافت و بیشترین کاهش در تیمار 25 پیکومولار مشاهده شد (شکل 4-A و B). محتوای آمینواسید آزاد کل تنها در غلظت 15 پیکومولار نانوذرات کاهش یافته و در سایر تیمارها نسبت به کنترل تغییر نکرد (شکل 4-C). این الگو می­تواند ناشی از تغییر در بازچرخ پروتئین (protein turnover) باشد. باز چرخ پروتئین یک فرایند مهم سلولی است که نقش بسیار مهمی در هموستازی آمینواسید، بازآرایی پروتئین­ها و تعادل آنزیمی در طول تنش را دارد (Hildebrandt, 2018). فعالیت­های مرتبط با بیوسنتز و شکسته شدن پروتئین­ها در شرایط تنش پیشتر مشخص شده است (Khedr et al., 2003; Hildebrandt et al., 2015; Huang & Jander, 2017; Hildebrandt, 2018; Mirshekari et al., 2019). از آنجا که تغییر در بازچرخ پروتئین با فعالیت­های پروتئولیتیک مرتبط است (Bahador et al., 2019; Mirshekari et al., 2019)، بنابراین این تغییرات پروتئینی و آمینواسیدی می­تواند نشان دهنده تغییر در فعالیت آنزیم­های پروتئازی در سلول­های جلبکی باشد. تغییر فرآیند بازچرخ پروتئین در نتیجه تغییر فعالیت­های پروتئولیتیک در سلول­های D. salina تیمار شده با نانوذرات نقره سنتز شده با عصاره برگ Momordica charantia نیز مشاهده شده است (Bahador et al., 2019).

شکل 4- تغییرات در سطوح پروتئین محلول (A)، پروتئین کل (B) و اسیدهای آمینه آزاد کل (C) سلول‌هایDunaliella salina  تیمار شده با غلظت‌های مختلف نانوذرات نقره پس از 48 ساعت. داده‌ها به صورت میانگین ± انحراف معیار سه اندازه‌گیری مستقل بیان شدند. حروف متفاوت نشان دهنده تغییرات معنی‌دار بین تیمارهای مختلف در سطح معنی‌داری P < 0.05  بر اساس آزمون دانکن هستند.

Figure 4- Changes in the levels of soluble protein (A), total protein (B) and total free amino acids (C) of Dunaliella salina cells treated with different concentrations of AgNPs after 48 h. Data were expressed as the mean ± SD of three independent measurements. Different letters indicate significant changes between different treatments at P < 0.05 based on Duncan’s test.

تغییرات در میزان قندهای محلول و نشاسته:

میزان قندهای محلول شامل قندهای احیاکننده، غیراحیاکننده و قند کل در تیمار 5 پیکومولار نانوذرات به صورت معنی­دار افزایش نشان داد، امّا در دوزهای بالاتر نانوذره به شدت کاهش پیدا کرد (شکل 5-A تا C). میزان قندهای احیاکننده در پاسخ به غلظت 25 پیکومولار نانوذره بیشترین کاهش را نشان داد (شکل 5-A)، در حالی که بیشترین کاهش قندهای غیر احیایی در تیمار 15 پیکومولار مشاهده شد (شکل 5-B).

شکل 5- تغییرات در میزان قندهای احیاکننده (A)، قندهای غیراحیاکننده (B)، قندهای محلول کل (C)، نسبت قندهای احیاکننده به غیراحیاکننده (D) و نشاسته(E)  سلول‌های Dunaliella salina  تیمار شده با غلظت‌های مختلف نانوذرات نقره پس از 48 ساعت. داده‌ها به صورت میانگین ± انحراف معیار سه اندازه‌گیری مستقل بیان شدند. حروف متفاوت نشان دهنده تغییرات معنی‌دار بین تیمارهای مختلف در سطح معنی‌داری P < 0.05 بر اساس آزمون دانکن هستند.

Figure 5- Changes in reducing sugars, RS (A), non-reducing sugars, NRS (B), total soluble sugars, TSS (C), RS/NRS ratio (D), and starch (E) contents of Dunaliella salina cells treated with different concentrations of AgNPs after 48 h. Values are the mean ± SD of three independent experiments. Different letters indicate statistically significant changes at P < 0.05 with Duncan’s test.

کاهش در میزان قند کل در هر دو غلظت 15 و 25 پیکومولار نانوذرات مشاهده شد (شکل 5-C). نسبت قندهای احیاکننده به غیر احیاکننده در غلظت های 5 و 25 پیکومولار نانوذرات به شدت کاهش نشان داد، امّا در تیمار 15 پیکومولار افزایش چشمگیری نسبت به کنترل نشان داد (شکل 5-D). 

افزایش این نسبت تنها در غلظت 15 پیکومولار نانوذره بیانگر کاهش بیشتر قندهای غیراحیاکننده در پاسخ به تیمار نانوذرات نقره نسبت به قندهای احیاکننده است. محتوای نشاسته در غلظت 5 پیکومولار نانوذرات تغییر معناداری پیدا نکرد، امّا در دوزهای بالاتر به شدت کاهش یافت و بیشترین کاهش در تیمار 25 پیکومولار مشاهده شد (شکل 5-E). افزایش میزان قندهای احیاکننده و غیراحیاکننده در غلظت پائین نانوذرات نقره نشان دهنده تأثیر این نانوذرات در متابولیسم قندها است. این تأثیر مثبت در سلول­های D. salina تیمار شده با نانوذرات نقره سنتز شده با عصاره برگ Momordica charantia نیز گزارش شده است (Bahador et al., 2019). با وجود این، کاهش تجمع قندهای محلول و نشاسته در مقادیر بالای نانوذرات نقره می­تواند نشان دهنده­ی تغییر در تسهیم کربن و استراتژی متابولیسم قندها در سلول تحت تأثیر نانوذرات نقره باشد. تغییر در تسهیم کربن در سلول­های Dunaliella تحت تأثیر نانوذرات نقره (Bahador et al., 2019)، نانوذرات اکسید مس (Bamary et al., 2025) و سایر تنش ها (Mirshekari et al., 2019; Bamary & Einali, 2022) قبلا گزارش شده است.

تغییرات در فعالیت­های آنزیمی:

فعالیت آنزیم­های کاتالاز و آسکوربات پراکسیداز در سلول­های جلبکی تیمار شده توسط نانوذرات نقره در مقایسه با کنترل به شدت کاهش نشان داد، به‌طوری که این کاهش در غلظت 5 پیکومولار نانوذره به ویژه برای آنزیم آسکوربات پراکسیداز شدیدتر بود (شکل 6). علّت احتمالی در این مورد، حساسیت این آنزیم­ها به ویژه آنزیم آسکوربات پراکسیداز به تجمع پراکسید هیدروژن است (Hiner et al., 2000). شواهد این احتمال از آنجا ناشی می شود که تیمار سلول­های Dunaliella با نانوذرات اکسید مس سبب افزایش پراکسید هیدروژن متناسب با غلظت نانوذره شده، امّا این الگو با تغییرات آنزیم­های آنتی اکسیدان کاتالاز و آسکوربات پراکسیداز کاملاً متضاد است، به‌طوری که با افزایش غلظت نانوذرات، فعالیت این آنزیم­ها کاهش یافته است (Bamary et al., 2025). همچنین، پاسخ غیرخطی نانوذرات به پدیده­های فیزیولوژیک از جمله فعالیت­های آنتی‌اکسیدانی و بنابراین ممانعت از آنزیم­های آنتی اکسیدان در مقادیر پائین نانوذرات نیز می­تواند در این امر دخیل باشد (Agathokleous et al., 2019).

شکل 6- تغییرات در فعالیت آنزیم­های کاتالاز (A) و آسکوربات پراکسیداز (B) سلول‌های Dunaliella salina  تیمار شده با غلظت‌های مختلف نانوذرات نقره پس از 48 ساعت. داده‌ها به صورت میانگین ± انحراف معیار سه اندازه‌گیری مستقل بیان شدند. حروف متفاوت نشان دهنده تغییرات معنی‌دار بین تیمارهای مختلف در سطح معنی‌داری P < 0.05 بر اساس آزمون دانکن هستند.

Figure 6- Changes in catalase, CAT (A) and ascorbate peroxidase, APX (B) activities of Dunaliella salina cells treated with different concentrations of AgNPs after 48 h. Values are the mean ± SD of three independent experiments. Different letters indicate statistically significant changes at P < 0.05 with Duncan’s test.

کاهش فعالیت­های آنزیمی در سلول­های جلبکی تحت تأثیر نانوذرات نقره می تواند به علّت تخریب پروتئین­های آنزیمی کاتالاز و آسکوربات پراکسیداز تحت تأثیر آنزیم­های پروتئازی و همچنین تغییر در بازچرخ پروتئین و کاهش بیوسنتز پروتئین­ها نسبت به تجزیه آنها باشد. مشابه این کاهش فعالیت آنزیمی، در گیاهچه­های گوجه فرنگی تیمار شده با نانوذرات نقره تحت شرایط in vitro مشاهده شده است (Razavizadeh, 2019). همچنین کاهش میزان پروتئین­های محلول سلول­های جلبکی تحت تأثیر نانوذرات نقره نیز نشان دهنده این مطلب است.

 همچنین نتایج مقایسه پاسخ­های بیوشیمیایی و متابولیکی سلول­های جلبک Dunaliella salina به نانوذرات نقره سنتز شده با دو گیاه خربزه تلخ (Bahador et al., 2019) Momordica charantia  و بابونه آلمانی Matricaria comomilla  در (جدول 1) نشان داده شده است.

جدول 1- مقایسه پاسخ­های بیوشیمیایی و متابولیکی سلول­های جلبک Dunaliella salina به نانوذرات نقره سنتز شده با دو گیاه خربزه تلخ (Bahador et al., 2019) Momordica charantia  و بابونه آلمانی Matricaria comomilla (پژوهش حاضر).

Table 1- Comparison of biochemical and metabolic responses of Dunaliella salina algae cells to silver nanoparticles synthesized with two plants, bitter melon, Momordica charantia (Bahador et al., 2019) and German chamomile, Matricaria comomilla (present study).

جمع بندی

نتایج حاصل از این پژوهش نشان دادند تیمار نانوذرات نقره سبب کاهش تعداد سلول، رنگیزه‌های فتوسنتزی، فعالیت‌های آنزیمی و میزان متابولیت‌ها شامل قندهای محلول، نشاسته، پروتئین‌ها و آمینواسیدهای آزاد می شود، امّا در عین حال وزن تر سلول‌های جلبکی افزایش می‌یابد. این امر نشان می‌دهد که تحمل تنش ناشی از نانوذرات نقره در سلول‌های جلبکی نه تنها توسط فعالیت‌های آنزیمی یا تجمع بتاکاروتن، بلکه احتمالاً به واسطه تغییر در تسهیم کربن القا می‌شود. به این ترتیب، به نظر می‌رسد که سازوکار تحمل جلبک به نانوذرات نقره با تغییرات متابولیکی همراه بوده و توسط هدایت جریان کربن به مسیرهای احتمالی دیگر مثل سنتز گلیسرول یا لیپید سبب القای تحمل جلبک به نانوذرات می‌شود. علاوه بر این، مقایسه نتایج حاضر با پژوهش‌های قبلی نشان می‌دهد که نوع سنتز و ویژگی‌های نانوذرات نقره می‌تواند نقش مهمی را در نوع پاسخ سلول‌های جلبکی ایفا نماید.