مقایسه صفات ریخت شناسی و فیزیولوژیکی سه اکوتیپ گیاه دارویی کلپوره Teucrium polium L. در شرایط تنش خشکی و بررسی بیان ژنهای متحمل به تنش خشکی MYB و LEA در اکوتیپ متحمل

مقدمه

تعیین نیاز آبی گیاه یکی از مهم‌ترین عوامل مؤثر بر کیفیت و کمیت محصولات گیاهی است. خشکی به‌عنوان یکی از اصلی‌ترین عوامل محدودکننده رشد، توسعه و پراکنش گونه‌های گیاهی عمل می‌کند، زیرا کاهش آب قابل دسترس در خاک فرآیندهای رشد ریشه و بخش‌های هوایی گیاه را مختل می‌کند (Farooq et al., 2009). تنش خشکی سبب ایجاد شرایط اسمزی و تنش اکسیداتیو در گیاهان می‌شود و پاسخ‌های حفاظتی متعددی را تحریک می‌کند (Farooq et al., 2009; Hasanuzzaman et al., 2022). در پاسخ به چنین شرایطی، گیاهان اقدام به افزایش قندهای محلول و سایر ترکیبات تنظیم‌کننده اسمزی می‌کنند تا فشار تورگور را حفظ نمایند، علیرغم آنکه این واکنش ممکن است رشد گیاه را کاهش دهد (Thomas & Gausling, 2000). پژوهش های اخیر نشان دادند این پاسخ در گیاهان دارویی شامل تجمع پرولین، بتائین و قندهای محلول است که منجر به افزایش مقاومت به خشکی می شود (Sami et al.,2016). مقاومت به خشکی در گونه‌های گیاهی متفاوت بوده و این تنوع به سازگاری‌های ریخت شناسی و فیزیولوژیکی آن‌ها بستگی دارد. برای مثال، افزایش عمق یا ارتفاع ریشه یکی از سازوکار‌هایی است که می‌تواند مقاومت گیاه به تنش خشکی را ارتقاء دهد ( Thomas & Gausling, 2000).

علاوه بر آن، گیاهان مقاوم در شرایط خشکی، ترکیبات تنظیم‌کننده اسمزی مانند پروتئین‌ها و پرولین را ذخیره می‌کنند (Reddy et al., 2004). همچنین در سطح مولکولی، گیاهان توسط گیرنده‌هایی مانند گیرنده اسید آبسزیک، هگزوکینازها و کانال‌های یونی، تنش را شناسایی می‌کنند (Yamaguchi & Shinozaki. 2006) و سپس سیگنال تنش توسط مسیرهای سرین‑ترئونین کینازها، فسفاتازها و پروتئین‌کینازهای وابسته به کلسیم منتقل می‌شود (Ahuja et al., 2010). به دنبال این مراحل، بیان ژن‌هایی که کدکننده پروتئین‌های (Late Embryogenesis Abundant) LEA، دهیدرین، گونه‌های اکسیژن واکنشگر(ROS)، و فاکتورهای رونویسی مانند ‎MYB، ‎WRKY، ‎NAC، ‎ERF/AP2، ‎DREB2  و ‎bZIP  هستند، تغییر می‌کند تا سازوکار‌های پاسخ به تنش فعال شود و هموستازی سلولی بازسازی شود (Baldoni & Cominelli, 2015). درصورتی‌که این فرآیندها دچار اختلال شوند، آسیب‌های غیرقابل‌برگشت در هموستازی سلولی و غشاها رخ می‌دهد و این منجر به مرگ سلولی و کاهش محصول می‌شود (Farooq et al., 2009). پژوهش‌های جدید نشان دادند بیان ژن‌های LEA،MYB  و DREB در گیاهان دارویی تحت تنش خشکی شدید به طور قابل توجهی افزایش می‌یابد و نقش مهمی در تجمع اسمولیت‌ها، بسته شدن روزنه‌ها و افزایش تحمل به خشکی دارد (Tunnacliffe & Wise 2007; Yamaguchi & Shinozaki, 2006; Gill & Tuteja, 2010). پژوهش های ترانسکریپتوم در گونه‌های مختلف نشان داده‌اند که پاسخ ژنومی به تنش خشکی متنوع است و بسته به گونه، ژنوتیپ و شرایط محیطی متفاوت می باشد (Lenka et al., 2011). برای گیاهان دارویی نیز، بررسی پاسخ‌های ریخت شناسی، فیزیولوژیکی و ژنتیکی به‌ویژه در شرایط کم‌آبی اهمیت ویژه دارد؛ از جمله کاهش رشد در گونه‌هایی مانند ریحان، جعفری و ریحان بنفش گزارش شده است(Moeini et al., 2006; Petropoulos et al., 2008). بررسی‌های اخیر در گیاهان دارویی مانند نعناع، ریحان و آویشن نیز نشان داده‌اند که پاسخ‌های ریخت شناسی و فیزیولوژیکی متنوع بوده و با ژنوتیپ و شدت خشکی ارتباط دارد (Yamaguchi & Shinozaki, 2006; Selmar & Kleinwächter, 2013).

در سال‌های اخیر، پژوهش های متعددی به بررسی اثر تنش خشکی بر ویژگی‌های ریخت شناسی، فیزیولوژیکی و مولکولی گیاهان زراعی و دارویی پرداخته‌اند. نتایج این پژوهش‌ها نشان دادند تنش خشکی موجب کاهش رشد رویشی، سطح برگ، وزن خشک و محتوای نسبی آب گیاه می‌شود و در مقابل، فعالیت سیستم آنتی‌اکسیدانی و تجمع ترکیبات تنظیم‌کننده اسمزی افزایش می‌یابد (Farooq et al., 2009; Flexas et al., 2014). همچنین گزارش شده است که فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی نظیر سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز و پراکسیداز در شرایط کم‌آبی افزایش یافته و نقش مهمی در کاهش آسیب‌های ناشی از تجمع گونه‌های اکسیژن واکنش گر ایفا می‌کنند (Gill & Tuteja, 2010).

در گیاهان دارویی، تنش خشکی علاوه بر تأثیر بر رشد، می‌تواند کیفیت و کمیت متابولیت‌های ثانویه را نیز تحت تأثیر قرار دهد. پژوهش‌ها بر روی گیاهانی نظیر نعناع، ریحان، آویشن و مریم‌گلی نشان داده‌اند که خشکی ملایم در برخی موارد سبب افزایش ترکیبات فنولی، فلاونوئیدها و اسانس‌ها می‌شود، با وجود این، خشکی شدید منجر به کاهش عملکرد و افت کیفیت دارویی گیاه می‌شود (Bettaieb et al., 2011; Selmar & Kleinwächter, 2013). از سوی دیگر، شدت پاسخ گیاهان دارویی به تنش خشکی به گونه، اکوتیپ و شرایط محیطی بستگی دارد.

گیاه کلپوره ( ‎Teucrium spp.‎)، از خانواده ‎Lamiaceae‎ با بیش از ۳۰۰ گونه در سراسر جهان، به‌ویژه در ایران و لبنان وجود دارد (Abdollahi et al., 2003; Bahramikia & Yazdanparast, 2012). این جنس دارای تنوع غنی از ترکیبات ثانویه شامل مونوترپن‌ها، سزکوئی‌ترپن‌ها، استرول‌ها، ساپونین‌ها، فلاونوئیدها و دی‌ترپن‌هاست که کاربردهای دارویی و اکولوژیکی چشم‌گیری دارند (Perez‑Alonso et al., 1993; Sadeghi et al., 2022). با وجود اهمیت آن، اطلاعات کمی درباره واکنش این گیاه به تنش خشکی موجود است (Flexas et al., 2014). با وجود انجام پژوهش‌های متعدد در مورد گیاهان دارویی مختلف، یافته های محدودی به بررسی جامع پاسخ‌های ریخت‌شناسی، فیزیولوژیکی و مولکولی جنس Teucrium در شرایط تنش خشکی پرداخته‌اند و به‌ویژه مقایسه اکوتیپ‌های مختلف این گیاه از نظر سازوکارهای تحمل خشکی کمتر مورد توجه قرار گرفته است. این خلأ پژوهشی ضرورت انجام پژوهش‌های دقیق‌تر در این زمینه را برجسته می‌سازد. پژوهش‌های جدید نشان دادند پاسخ اکوتیپ های مختلف Teucrium تحت تنش خشکی متفاوت است (Flexas et al., 2014). به عبارت دیگر، این پژوهش، با هدف مقایسه پاسخ سه اکوتیپ کلپوره از نظر ریخت شناسی و فیزیولوژیکی و مولکولی در شرایط تنش خشکی انجام شده است.

مواد و روش ها

پژوهش حاضر به صورت آزمایش فاکتوریل در قالب طرح کامل تصادفی در سه تکرار در گلخانه ای در شهرکرمان تحت شرایط دمایی 26 درجه سانتی‌گراد و رطوبت 30 درصد انجام شد. دمای گلخانه در طول دوره آزمایش در محدوده 2 ± 26 درجه سانتی‌گراد تنظیم وکنترل شد.گیاهان تحت فتوپریود 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی پرورش یافتند. شدت نور در حدود 300–250 میکرومول فوتون بر متر مربع بر ثانیه تأمین شد.

 تیمارهای رطوبتی شامل 100 درصد ظرفیت مزرعه به عنوان شاهد، 70 درصد و 40 درصد ظرفیت زراعی به عنوان تنش خشکی اعمال شدند. بذرهای سه اکوتیپ مورد پژوهش از مناطق مختلف استان کرمان جمع‌آوری شدند. مشخصات جغرافیایی و اقلیمی هر اکوتیپ در جدول 1 ارائه شده است. برای کاشت بذرها ابتدا بذور با سدیم هیپوکلراید 1/0 درصد ضدعفونی و سپس با آب مقطر شستشو داده شدند. بذرهای ضدعفونی شده به مدت یک ساعت در آب مقطر قرار گرفتند. از گلدان‌های مناسب به قطر 10 سانتی‌متر و ارتفاع 15 سانتی‌متر و حاوی خاک با نسبت ماسه: رس: خاک برگ (۲:۱:۱) استفاده شد. سطح خاک با فوم عایق‌بندی شد تا تبادل حرارتی با محیط کاهش یابد. در هرگلدان پنج بذر کشت شدند که نهایتا پس از فرآیند تنک کردن، دوگیاه در هرگلدان باقی ماند. گلدان‌ها هر سه روز یکبار با آب آبیاری شدند و برای بهتر شدن و سریعتر شدن رشد گیاه، هفته‌ای یک بار به گلدان‌ها محلول غذایی هوگلند با رقت (1 به 3 ) داده شد. اعمال تنش خشکی به مدت 10 دوره به میزان 70 درصد و 40 درصد ظرفیت زراعی انجام گرفت. اعمال تنش خشکی پس از استقرار کامل گیاهچه‌ها انجام شد ( در مرحله 6 تا 8 برگی و حدود 45 روز پس از کاشت). آبیاری به‌صورت هر سه روز یک‌بار انجام شد و اعمال تنش به مدت 30 روز (شامل 10 نوبت آبیاری) ادامه یافت. رطوبت خاک به‌صورت وزنی و بر اساس ظرفیت زراعی تعیین و کنترل شد، به‌طوری‌که رطوبت خاک در تیمارهای تنش در سطوح ۷۰ درصد (تنش ملایم) و ۴۰ درصد (تنش شدید) ظرفیت زراعی حفظ شد، از سوی دیگر، تیمار شاهد در سطح ۱۰۰ درصد ظرفیت زراعی نگه داشته شد. تنظیم رطوبت خاک در هر دوره با اندازه‌گیری وزن گلدان‌ها و جبران آب از دست‌رفته انجام شد.

جدول 1- مشخصات جغرافیایی و اقلیمی اکوتیپ‌های Teucrium polium مورد بررسی

Table 1. Geographical and climatic characteristics of the studied Teucrium polium ecotypes

صفات مورفوفیزیولوژیکی

ویژگی‌های ریخت‌شناسی مورد بررسی در این پژوهش شامل طول ساقه و طول ریشه بود و همچنین ویژگی‌های فیزیولوژیکی شامل کلروفیل کل است. در پایان فصل رشد و در مرحله رسیدگی فیزیولوژیکی، طول ساقه و طول ریشه با خط کش اندازه‌گیری شد.

برای محاسبه میزان کلروفیل از روشLichtenthaler (1987) استفاده شد. در این روش 2/0 گرم از برگ های تازه گیاه در هاون چینی حاوی 15 میلی‌لیتر استن 80 درصد سائیده شد و پس از صاف کردن جذب آن با دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج‌های 646، 663 و 470 نانومتر خوانده شد. بر اساس فرمول های زیر مقدار کلروفیل کل به دست آمد.

(A 64679/2 -A 663 25/12) = کلروفیل a

(A 6631/5 -A 646 21/21) = کلروفیل b

کلروفیل a + کلروفیلb  = کلروفیل کل

صفات بیوشیمیایی

برای اندازه‌گیری پرولین از (1973) Bates et al. استفاده شد. 02/0 گرم از بافت تازه را در ده میلی‌لیتر محلول سه درصد اسید سولفوسالیسیلیک سائیده و مخلوط یکنواختی تهیه شد. عصاره حاصل توسط سانتریفیوژ به مدت 5 دقیقه در g10000 سانتریفیوژ شد. سپس دو میلی‌لیتر از مایع رویی با دو میلی لیتر معرف نین هیدرین و دو میلی‌لیتر اسید استیک خالص مخلوط شده و یک ساعت در دمای 100 درجه سانتی‌گراد حمام آب گرم، قرار گرفت. بعد از این مدت، جهت قطع انجام کلیه واکنش ها، لوله‌های محتوی مخلوط در حمام یخ، سرد شدند. سپس چهار میلی‌لیتر تولوئن به مخلوط اضافه شده و لوله‌ها به خوبی تکان داده شد. با ثابت نگه داشتن لوله‌ها به مدت 15-20 دقیقه دو لایه کاملا مجزا در آنها تشکیل شد. از لایه رنگی فوقانی که حاوی تولوئن و پرولین بود برای اندازه‌گیری غلظت پرولین استفاده شد. جذب مقدار مشخصی از این ماده رنگی در طول موج 520 نانومتر تعیین شد. نتایج حاصل از اندازه‌گیری مقدار پرولین برحسب میلی‌گرم بر گرم وزن تر محاسبه وارائه شد. برای سنجش پروتئین از روشBradford  (1976) استفاده شد. برای تهیه عصاره پروتئینی، 500 گرم بافت تازه برگ گیاه که در 5 میلی‌لیتر بافر پتاسیم فسفات 50 میلی‌مولار حاوی 1 درصد پلی‌وینیل‌پیرولیدین و EDTA  1 میلی‌مولار بود آسیاب شد و سپس سانتریفیوز شد(تمام مراحل استخراج در یخ انجام شد). غلظت پروتئین با روشBradford  (1976) تعیین شد. برای این منظور، ۱۰۰ میکرولیتر از عصاره پروتئینی به ۵ میلی‌لیتر معرف Bradford اضافه و فوراً ورتکس شد. پس از ۱۰ دقیقه، جذب نوری نمونه‌ها در ۵۹۵ نانومتر با استفاده از اسپکتروفتومتر اندازه‌گیری شد. همچنین غلظت پروتئین توسط منحنی استاندارد BSA محاسبه شد.

فعالیت آنزیم سوپر اکسید دیسموتاز با روش مهار احیای NBT تعیین شد (Giannopolitis & Ries, 1977). 2/0 گرم بافت تازه در ۵ میلی‌لیتر بافر فسفات ۵۰ میلی‌مولار(pH=7.8) حاوی EDTA 1 میلی‌مولار و PVP 1 درصد همگن شد. عصاره سانتریفیوژ و سپس با مخلوط NBT، متیونین، ریبوفلاوین و بافر فسفات واکنش داده شد. پس از ۱۰ دقیقه در معرض نور فلورسنت، شدت رنگ آبی فورمازان در طول موج ۵۶۰ نانومتر با اسپکتروفتومتر ( CE 7200، شرکت Cecil Instruments Ltd، انگلستان) خواندهشد. همچنین فعالیت آنزیم کاتالاز بر اساس کاهش جذب H₂O₂ در طول موج ۲۴۰ نانومتر طی ۶۰ ثانیه اندازه‌گیری شد (Aebi, 1984). 2/0گرم بافت تازه در ۵ میلی‌لیتر بافر فسفات ۵۰ میلی‌مولار (pH=7.8) همگن شد و پس از سانتریفیوژ، با 1/0 میلی‌لیترH₂O₂ ۳۰ میلی‌مولار واکنش داده شد.

 فعالیت آنزیم پراکسیداز بر اساس روش (Chance & Maehly, 1955) توسط محلول گایاکول ۲۰ میلی‌مولار و H₂O₂ ۴۰ میلی‌مولار سنجیده شد. 2/0گرم بافت تازه در ۵ میلی‌لیتر بافر فسفات ۵۰ میلی‌مولار (pH=6) حاوی 1 درصد PVP همگن شد و پس از سانتریفیوژ، تغییر جذب در طول موج ۴۷۰ نانومتر با اسپکتروفتومتر( CE 7200، شرکتCecil Instruments Ltd، انگلستان)  ثبت شد. فعالیت POD بر اساس ضریب خاموشی گایاکول محاسبه شد. برای اندازه‌گیری پراکسیداسیون لیپیدها، روش تیوباربیتوریک اسید (TBA ) استفاده شد (Heath & Packer, 1968 ). 2/0گرم بافت تازه در ۵ میلی‌لیتر محلولTCA ۱۰ درصد همگن شد و پس از سانتریفیوژ ۱۰ دقیقه‌ای در 10000 g، ۲ میلی‌لیتر از مایع رویی با ۲ میلی‌لیتر محلولTBA ۱ درصد درTCA ۲۰ درصد مخلوط شد و به مدت ۳۰ دقیقه در حمام آب ۹۵ درجه سانتی‌گراد قرار گرفت. پس از سرد شدن در حمام یخ و سانتریفیوژ مجدد، جذب محلول شفاف در طول موج‌های ۵۳۲ و ۶۰۰ نانومتر با اسپکتروفتومتر ( CE 7200، شرکت Cecil Instruments Ltd، انگلستان) خوانده شد و میزان MDA بر حسب نانومول بر گرم وزن تر محاسبه شد.

صفات مولکولی

استخراج RNA

 برای بررسی بیان ژن‌ها ابتدا جهت استخراج RNA، یک میکرولیتر از بافر بایوزول (Biozol، شرکت Fermentas، آلمان) داخل لوله ریخته شد و 1/0 گرم برگ سائیده شده به آن اضافه شد. سپس نمونه با دست تکان داده شد و 10 تا 15 دقیقه در دمای اتاق قرار داده شد. 200 میکرولیتر کلروفرم به میکروتیوب اضافه شد و بعد از 5-4 بار تکان دادن در داخل فریزر 20- درجه سانتی‌گراد به مدت زمان 20 دقیقه قرار داده شد. بعد از بیرون آوردن نمونه از فریزر مجددا به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد با دور 12000 در دقیقه سانتریفیوژ شد. پس از سانتریفیوژ، قسمت شفاف بالای لوله حذف شد و پلت ایجاد شده جدا شد و 1 میلی لیتر اتانول به آن اضافه شد.لوله‌ها به مدت 5 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد با دور 12000 در دقیقه سانتریفیوژ شدند و دوباره فاز بالایی حذف و پلت RNA در دمای اتاق خشک شد. در نهایت 50 میکرولیتر آب مقطر، به پلت ایجاد شده اضافه شد. غلظت و خلوص RNA جدا شده با خواندن جذب(A ) بر روی اسپکتروفتومتر فرابنفش(NanoDrop 2000، شرکت Thermo Scientific، آمریکا) در طول موج‌های 260 و 280 نانومتر ارزیابی شد.

سنتز cDNA

از کیت سنتز cDNA پارس توس و بر اساس دستورالعمل شرکت برای سنتز cDNA استفاده شد. البته قبل از سنتز cDNA و جهت حذف DNA ژنومی که ممکن است به همراه RNA استخراج شود، RNA استخراج شده با آنزیم DNAse (Fermentase, USA) I تیمار شدند.

انجام واکنش PCR Real-Time

جهت بررسی تغییرات احتمالی بیان ژن در شرایط تنش خشکی، واکنش‌های Real-Time PCR برای هر ژن در ۳ تکرار طراحی شد. آزمایش‌های Real-Time PCR توسط معرف سایبرگرین شرکت آریا طوس در دستگاه ترموسایکلر شرکت ABI انجام شد. توسط 5/1 میکرولیتر از هر نمونه cDNA و 10 میکرولیتر از هر آغازگر( مشخصات آغازگرها در جدول 2 آورده شده است)، واکنش Real-Time به صورت زیر انجام شد: 95 درجه سانتی‌گراد به مدت 7 دقیقه و به دنبال آن 40 دوره 95 درجه سانتی‌گراد برای 15 ثانیه، 65 درجه سانتی‌گراد برای 20 ثانیه و 72 درجه سانتی‌گراد برای 35 ثانیه انجام شد. مقادیر CT (چرخه آستانه) توسط روش‌های ∆∆CT 2 مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. برای ارزیابی ثبات بیان ژنها از نرم افزار micPCR ( شرکت Bio Molecular Systems، استرالیا) استفاده شد. همچنین، ژن اکتین به عنوان کنترل داخلی و جهت نرمال کردن داده های حاصل از دستگاه Real-Time PCR انتخاب شد. برای اندازه‌گیری تغییرات بیان ژن‌های LEA وMYB و همچنین آنالیز بیان نسبی این ژن‌ها، به ترتیب از روش های ^−ΔΔCt  2 و^-ΔCt 2 استفاده شد

جدول 2- اسامی و توالی آغازگرهای مورد استفاده برای بررسی بیان ژن ها

Table 2- Names and sequences of primers used to examine gene expression

آنالیزهای آماری

داده‌های حاصل توسط نرم‌افزار SPSS مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. تجزیه واریانس با فرض نرمال بودن داده ها و یکنواختی واریانس ها صورت گرفت. همچنین تحلیل واریانس بر اساس آزمایش فاکتوریل در قالب طرح کامل تصادفی انجام شد. مقایسه میانگین تیمار‌ها با استفاده از آزمون دانکن در سطح احتمال 5 درصد صورت گرفت.

نتایج

تجزیه واریانس صفات مورد بررسی نشان داد اثرات ساده فاکتورهای اکوتیپ و تنش خشکی در اکثر صفات معنی دار است . اثرات متقابل اکوتیپ در تنش خشکی در همه صفات معنی دار شد(جدول 3). آزمون مقایسه میانگین تیمارها به روش دانکن در سطح احتمال 5% صورت گرفت و نتایج در شکل های 1تا 9 آورده شده است.

نتایج جدول تجزیه واریانس نشان دادند تنش خشکی تأثیر معنی داری بر طول ساقه دارد. افزایش شدت تنش خشکی سبب کاهش معنی دار طول ساقه شد. مقایسه نمونه‌های مناطق مختلف نشان داد که بیشترین طول ساقه تحت تنش ۴۰ درصد مربوط به اکوتیپ رفسنجان بود، در حالی که کمترین طول ساقه (۰.۴۳ ± ۱۲ سانتی‌متر) در اکوتیپ سرچشمه مشاهده شد (شکل ۱). این نتایج نشان می‌دهد که واکنش ریخت‌شناسی گیاهان کلپوره به خشکی می‌تواند به شدت وابسته به منشاء ژنتیکی و شرایط اکولوژیکی مناطق نمونه‌برداری باشد.

جدول 3- تجزیه واریانس صفات ریخت‌شناسی، فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی اکوتیپ های کلپوره تحت سطوح مختلف تنش خشکی

Table 3- Analysis of variance for morphological, physiological, and biochemical traits in ecotypes of Teucrium polium under different levels of drought stress

*: معنی دار در سطح احتمال 5%     **: معنی دار در سطح احتمال 1%      ns: غیرمعنی دار

* Significant at 5 % probability level * *: significant at 1 % probability level   ns: Not significant 

بررسی صفت طول ریشه نشان دادند تنش خشکی به‌طور معنی داری سبب افزایش طول ریشه می شود.کمترین طول ریشه در اکوتیپ های بافت و سرچشمه در شرایط فاقد تنش مشاهده شد (شکل ۲). ارزیابی مقادیرکلروفیل کل نیز نشان داد، بیشترین مقدار در اکوتیپ سرچشمه تحت تنش 40 درصد و کمترین مقدار در اکوتیپ رفسنجان بدون تنش است (شکل 3). نتایج تجزیه واریانس و مقایسه میانگین تیمارها نشان داد که بیشترین میزان پرولین نیز در اکوتیپ سرچشمه تحت تنش 40 درصد و کمترین مقدار در اکوتیپ های بافت و رفسنجان در شرایط فاقد تنش مشاهده شد (شکل 4).بیشترین مقدار پروتئین در اکوتیپ سرچشمه تحت تنش 40 درصد و کمترین مقدار در اکوتیپ بافت تحت تنش 40 درصد و 70 درصد ثبت شد (شکل ۵). نتایج تجزیه واریانس نشان داد تنش خشکی اثرات معنی داری بر فعالیت آنزیم‌های SOD، CAT و POD و همچنین میزان MDA دارد. افزایش شدت تنش خشکی موجب افزایش تدریجی و معنی دار فعالیت تمامی آنزیم‌ها شد. فعالیت آنزیم SOD در تمامی اکوتیپ ها با کاهش رطوبت افزایش یافت. در رطوبت 40 درصد، بیشترین مقدار SOD در اکوتیپ سرچشمه و کمترین مقدار در اکوتیپ بافت در رطوبت 100 درصد مشاهده شد (شکل 6). همچنین فعالیت کاتالاز نیز با شدت یافتن تنش خشکی افزایش یافت. بیشترین فعالیت در رطوبت 40 درصد مربوط به اکوتیپ سرچشمه و کمترین فعالیت در رطوبت 100 درصد اکوتیپ بافت ثبت شد (شکل 7). آنزیم پراکسیداز نیز مشابه SOD و CAT تحت تنش خشکی به طور معنی داری افزایش یافت. در رطوبت 40 درصد، بیشترین فعالیت POD در اکوتیپ سرچشمه و کمترین مقدار در رطوبت 100 درصد اکوتیپ بافت مشاهده شد (شکل 8). غلظت MDA که شاخص پراکسیداسیون لیپیدها و میزان آسیب اکسیداتیو به غشاهای سلولی است، تحت تنش خشکی به‌طور معنی داری افزایش یافت. بیشترین مقدار MDA در رطوبت 40 درصد اکوتیپ بافت و کمترین مقدار در رطوبت 100 درصد اکوتیپ سرچشمه ثبت شد (شکل 9). با مقایسه جامع ویژگی‌های ریخت‌شناسی، فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی، اکوتیپ سرچشمه نسبت به اکوتیپ‌های دیگر نسبت به تنش خشکی مقاومت بیشتری نشان داد. بررسی بیان ژن‌های مرتبط با پاسخ به تنش خشکی MYB و LEAدر اکوتیپ مقاوم نشان دادند نمونه های تحت تنش به‌طور معنی داری بیان ژن‌های بیشتری نسبت به نمونه‌های شاهد دارند (شکل ۱۰). این یافته‌ها تأکید می‌کنند که انتخاب ژنوتیپ‌های مقاوم می‌تواند بهینه‌سازی کشت کلپوره در مناطق خشک و کم‌آب را ممکن سازد.

شکل 1- اثر سطوح مختلف تنش خشکی بر طول ساقه در سه اکوتیپ کلپوره مورد بررسی

Figure 1- Effect of different levels of drought stress on stem length in three ecotypes of Teucrium polium l.

شکل 2- اثر سطوح مختلف تنش خشکی بر طول ریشه در سه اکوتیپ کلپوره مورد بررسی

Figure 2- Effect of different levels of drought stress on the root length in three ecotypes of Teucrium polium l

شکل 3- اثر سطوح مختلف تنش خشکی بر میزان کلروفیل کل در سه اکوتیپ کلپوره مورد بررسی

Figure 3- Effect of different levels of drought stress on total chlorophyll content in three ecotypes of Teucrium polium l.

شکل 4- اثر سطوح مختلف تنش خشکی بر میزان پرولین در سه اکوتیپ کلپوره مورد بررسی

Figure 4- Effect of different levels of drought stress on the proline content in three ecotypes of Teucrium polium l .

شکل 5- اثر سطوح مختلف تنش خشکی بر میزان پروتئین در سه اکوتیپ کلپوره مورد بررسی

Figure 5- Effect of different levels of drought stress on the protein content in three ecotypes of Teucrium polium l.

شکل 6- اثر سطوح مختلف تنش خشکی بر فعالیت آنزیم  SOD در سه اکوتیپ کلپوره مورد بررسی

Figure 6- Effect of different levels of drought stress on SOD activity in three ecotypes of Teucrium polium l.

شکل 7- اثر سطوح مختلف تنش خشکی بر فعالیت آنزیم  CAT در سه اکوتیپ کلپوره مورد بررسی

Figure 7- Effect of different levels of drought stress on CAT activity in three ecotypes of Teucrium polium l.

شکل 8- اثر سطوح مختلف تنش خشکی بر فعالیت آنزیم POD در سه اکوتیپ کلپوره مورد بررسی

Figure 8- Effect of different levels of drought stress on POD activity in three ecotypes of Teucrium polium l.

شکل 9- اثر سطوح مختلف تنش خشکی بر میزان  MDA در سه اکوتیپ کلپوره مورد بررسی

Figure 9- Effect of different levels of drought stress on MDA content in three ecotypes of Teucrium polium l.

شکل 10- بیان نسبی ژن‌های MYB  وLEA  در اکوتیپ مقاوم سرچشمه تحت شرایط شاهد و تنش خشکی (K1).

Figure 10- Relative expression of MYB and LEA genes in Sarcheshmeh tolerant ecotype under control and drought stress (K1) conditions

بحث

اثر تنش خشکی بر ویژگی‌های ریخت‌شناسی و رشد گیاه: نتایج این پژوهش نشان داد تنش خشکی تأثیر قابل توجهی بر ویژگی‌های ریخت‌شناسی کلپوره داشت. کاهش رطوبت خاک سبب کاهش معنی دار طول ساقه و افزایش طول ریشه شد، که نشان‌دهنده واکنش تطبیقی گیاه برای افزایش جذب آب و بهبود مقاومت در برابر کم‌آبی است. مقایسه اکوتیپ‌ها نشان داد که اکوتیپ سرچشمه نسبت به سایر اکوتیپ ها مقاومت بیشتری در برابر تنش خشکی دارد، زیرا طول ساقه آنها کمتر کاهش یافت و رشد ریشه به شکل مطلوب حفظ شد. این یافته‌ها با پژوهش‌های پیشین مبنی بر افزایش رشد ریشه و کاهش رشد اندام هوایی در پاسخ به خشکی مطابقت دارد (Sami et al., 2016; Farooq et al., 2014). بنابراین، تفاوت‌های مشاهده شده بین اکوتیپ‌ها نشان‌دهنده وجود تنوع ژنتیکی در پاسخ ریخت‌شناسی کلپوره به تنش خشکی است و نمونه‌های مقاوم می‌توانند در برنامه‌های بهبود ژنتیکی مورد توجه قرار گیرند. تنش آبی یکی از مهم‌ترین تنش‌های محیطی در گیاهان است که اثرات گسترده‌ای بر ویژگی‌های ریخت‌شناسی ، فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی آنها دارد و موجب کاهش قابل توجه عملکرد محصولات کشاورزی می‌شود. برآوردها نشان می‌دهد حدود ۲۵ درصد از اراضی جهان به دلیل کمبود آب از بهره‌وری مطلوب خارج شده‌اند (Delfine et al., 2005). تنش خشکی تنشی چند بعدی است که تمامی مراحل رشد و نمو گیاه، از جمله تقسیم، کشیدگی و تمایز سلولی، را تحت تأثیر قرار می‌دهد. کاهش پتانسیل آب و تورگور سلولی در شرایط کم‌آبی منجر به اختلال در فرایندهای آنزیمی و فتوسنتز و در نتیجه کاهش رشد گیاه می‌شود. همچنین القای گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) در گیاهان سبب اختلال در عملکرد متابولیکی و فیزیولوژیکی آن‌ها می‌شود (Farooq et al., 2009; Hasanuzzaman et al., 2022). در پاسخ به کمبود آب، گیاهان با افزایش رشد ریشه و گسترش سیستم ریشه‌ای، ظرفیت جذب آب را بالا می‌برند. به همین علّت در شرایط خشکی ملایم، رشد ریشه معمولاً کاهش چندانی نمی‌یابد، در حالی که رشد اندام هوایی کاهش پیدا می‌کند. یکی از نخستین واکنش‌های گیاه در برابر تنش خشکی، کاهش میزان فتوسنتز است که به دلیل بسته شدن روزنه‌ها، کاهش محتوای کلروفیل و اختلال در زنجیره انتقال الکترون رخ می‌دهد (Sami et al., 2016; Farooq et al., 2014). کاهش رنگدانه فتوسنتزی کلروفیل نشانه‌ای از استرس اکسیداتیو در گیاه است و رابطه مستقیمی با افت ظرفیت فتوسنتزی دارد. پژوهش‌های مختلف نشان داده‌اند، تنش خشکی سبب کاهش رشد و عملکرد در گیاهان دارویی می‌شود. برای مثال، کاهش ارتفاع، سطح برگ و ماده خشک در نعناع، بومادران، کاسنی، آویشن و بادرنجبویه گزارش شده است (Selmar & Kleinwachter, 2013). در شرایط خشکی، تجمع مواد آلی سازگار مانند قندها، پرولین و بتائین نقش مهمی در تنظیم اسمزی و حفظ پتانسیل آب سلولی ایفا می‌کند (Mohammadkhani & Heidari, 2008). این ترکیبات با حفظ تعادل اسمزی، پایداری ساختارهای سلولی و جلوگیری از تجمع ROS به مقاومت گیاه کمک می‌کنند.

پاسخ‌های بیوشیمیایی و فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی

نتایج این پژوهش نشان داد که تنش خشکی در گیاه کلپوره موجب افزایش فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانیSOD، CAT  و POD و نیز افزایش سطح MDA می‌شود، که نشان‌دهنده پاسخ محافظتی کلاسیک گیاه به تنش اکسیداتیو است. افزایش فعالیت SOD در پاسخ به خشکی نشانگر فعال شدن اولین خط دفاعی گیاه در برابر رادیکال سوپراکسید است (Alscher et al., 2002; Gill & Tuteja, 2010). فعالیت کاتالاز (CAT) نیز در شدت‌های بالاتر خشکی افزایش یافت، زیرا H₂O₂ محصول واکنش SOD باید حذف شود. کاتالاز یکی از آنزیم‌های کلیدی در تجزیه H₂O₂ است و افزایش آن می‌تواند نشان‌دهنده تجمع مولکول‌های مضری باشد که در اثر تنش تولید شده‌اند(Aebi, 1984; Apel & Hirt, 2004; Hasanuzzaman et al., 2022). افزایش فعالیت CAT در اکوتیپ سرچشمه نشان می‌دهد که این ژنوتیپ توانایی بیشتری در محافظت از سلول‌ها در برابر آسیب اکسیداتیو دارد.

پراکسیداز (POD) نیز به‌طور معنی داری در شرایط خشکی افزایش یافت. این آنزیم علاوه بر نقش حفاظتی در حذف H₂O₂، در فرایندهای ساختاری مانند لیگنین‌سازی دیواره سلولی نیز شرکت دارد (Hiraga et al., 2001). افزایش POD  در اکوتیپ سرچشمه می‌تواند بخشی از سازگاری بیوشیمیایی گیاه با تنش باشد. سطح MDA به‌عنوان شاخص پراکسیداسیون لیپیدها افزایش یافت، که نشان‌دهنده آسیب غشایی ناشی از ROS است. بالاتر بودن MDA در برخی اکوتیپ‌ها نشان می‌دهد که ظرفیت آنتی‌اکسیدانی آنها برای مهار کامل آسیب کافی نبوده است ( Heath & Packer, 1968; Gill & Tuteja, 2010). مطابق داده‌های این پژوهش، اکوتیپ سرچشمه بیشترین افزایشSOD، CAT  و POD  را در سطح 40٪ ظرفیت زراعی نشان داد، در حالی که اکوتیپ بافت افزایش کمتری داشت (شکل‌های 6–8). این تفاوت‌ها نشان‌دهنده وجود تنوع ژنتیکی در پاسخ آنتی‌اکسیدانی کلپوره و ظرفیت بالاتر اکوتیپ سرچشمه در مقابله با آسیب ROS است.

پاسخ مولکولی و بیان ژن:

نتایج این پژوهش نشان داد که بیان ژن های MYB و LEA در اکوتیپ مقاوم سرچشمه در شرایط تنش شدید (۴۰٪ ظرفیت زراعی) نسبت به شرایط نرمال ( شاهد) افزایش می یابد، که با فعالیت بالای آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی هم‌راستا است.تنش خشکی با تنظیم بیان ژن‌های مقاومت مانند فاکتورهای رونویسی MYB و پروتئین‌های LEA همراه است. فاکتورهای MYB نقش مهمی در تنظیم پاسخ به تنش دارند و می‌توانند بیان ژن‌های دفاعی را افزایش دهند (Baldoni & Cominelli, 2015). افزایش بیان ژن MYB معمولاً موجب تجمع اسمولیت‌ها، بسته شدن روزنه‌ها و افزایش تحمل به خشکی می‌شود (Baldoni & Cominelli, 2015; Farooq et al., 2009). ژن‌های LEA نیز با پایداری ساختاری سلول در شرایط دهیدراسیون و محافظت از غشاها مرتبط هستند(Battaglia et al., 2008; Amara et al., 2014). علاوه بر این، شواهد تازه نشان داده‌اند که تنظیم اپی‌ژنتیکی، از جمله متیلاسیون DNA  و تغییرات هیستونی، نقش مهمی در پاسخ گیاهان به خشکی دارد (Hasanuzzaman et al., 2022). سیستم ریشه‌ای نیز با انتقال سیگنال‌های کم‌آبی توسط هورمون ABA پاسخ‌های دفاعی را در اندام‌های هوایی فعال می‌کند (Yamaguchi-Shinozaki & Shinozaki, 2006).

 تغییرات متابولیکی: نتایج این پژوهش نشان داد که تجمع پرولین و پروتئین در اکوتیپ سرچشمه بیشترین مقدار را داشته و با افزایش فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی و بیان ژن‌های مقاومت همراه است. این همبستگی نشان می‌دهد که اکوتیپ سرچشمه از نظر متابولیکی نیز توانایی بیشتری برای مقابله با تنش خشکی دارد .باز تنظیم مسیرهای کربوهیدراتی و انرژی در پاسخ به خشکی اهمیت ویژه‌ای دارد. در شرایط تنش، گیاهان انرژی خود را از رشد رویشی به سمت فعال‌سازی مسیرهای دفاعی و حفظ تعادل اسمزی منتقل می‌کنند(Farooq et al., 2009). این یافته‌ها چشم‌انداز جدیدی در درک سازوکار مقاومت گیاهان دارویی در برابر کم‌آبی فراهم کرده است.

نتیجه‌گیری

نتایج پژوهش حاضر نشان داد تنش خشکی اثر معنی‌داری بر صفات ریخت‌شناسی، بیوشیمیایی و مولکولی گیاه دارویی کلپوره دارد و شدت این اثرات در سه اکوتیپ مورد بررسی متفاوت بود. کاهش صفاتی مانند ارتفاع گیاه، سطح برگ و ماده خشک در شرایط تنش آبی بیانگر حساسیت رشد رویشی به کمبود آب است، با وجود این، اکوتیپ سرچشمه با حفظ بهتر این صفات، سازگاری ریخت‌شناسی بالاتری نسبت به سایر اکوتیپ‌ها از خود نشان داد که احتمالاً ناشی از کارایی بیشتر سیستم ریشه‌ای و مدیریت بهتر منابع آبی است.

از نظر بیوشیمیایی، افزایش معنی‌دار فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی شاملSOD، CAT و POD در شرایط تنش خشکی نشان‌دهنده فعال شدن سیستم دفاعی گیاه در برابر استرس اکسیداتیو بود. شدت این پاسخ در اکوتیپ سرچشمه بیشتر از دو اکوتیپ دیگر مشاهده شد که با سطح پائین‌تر آسیب غشایی(MDA) همراه بود و بیانگر توان بالاتر این اکوتیپ در مهار گونه‌های فعال اکسیژن و حفظ پایداری غشاهای سلولی است. در مقابل، افزایش بیشترMDA  در برخی اکوتیپ‌ها نشان‌دهنده محدودیت ظرفیت آنتی‌اکسیدانی آنها در مقابله با تنش شدید خشکی است. در سطح مولکولی، افزایش بیان ژن‌های مرتبط با تحمل خشکی، در شرایط تنش شدید با بهبود پاسخ‌های بیوشیمیایی و حفظ نسبی صفات ریخت‌شناسی هم‌راستا بود. این همبستگی نشان می‌دهد که تحمل خشکی در کلپوره نتیجه تعامل هماهنگ تنظیم بیان ژن‌ها، فعالیت سامانه آنتی‌اکسیدانی و سازگاری‌های رشدی است. بر این اساس، اکوتیپ سرچشمه به‌عنوان اکوتیپ مقاوم تر به خشکی شناسایی شد و می‌تواند گزینه مناسبی برای برنامه‌های به‌نژادی، کشت در مناطق کم‌آب و مطالعات آینده در زمینه اصلاح ژنتیکی و اپی‌ژنتیکی گیاهان دارویی باشد.