اثر محلول ‌پاشی سالیسیلیک اسید بر سیستم آنزیم ‌‌های آنتی‌اکسیدان و تولید پراکسیدهیدروژن گیاه گلرنگ در شرایط تنش گرما

مقدمه

رشد و نمو گیاه اغلب تحت تأثیر تنش­های غیرزیستی قرار می­گیرد. عوامل محیطی مانند دمای بالا یا پائین، خشکی و شوری سبب ایجاد تنش اکسیداتیو در گیاهان می­شوند که به نوبه خود توسط تولید گونه­های اکسیژن واکنش­گر بر عملکردهای زیستی متعدد گیاهان تأثیرگذار است. گسترش کشت و کار گیاهان متحمل به شرایط نامساعد محیطی می­تواند یکی از راهکارهای مهم مدیریتی جهت بهبود شرایط اقتصادی و اجتماعی باشد. در واقع آنچه در انتخاب گیاهان زراعی جهت کشت در یک منطقه اهمیت دارد، سازگاری آن­ها با شرایط محیطی است (Liu et al., 2005). گلرنگ با نام علمی Carthamus tinctorius L.، یک گیاه دانه روغنی یکساله با سازگاری بالا با زمین‌های دیم و فاریاب است. این گیاه نسبت به تنش‌های غیرزیستی تحمل متوسطی دارد، امّا در صورت قرار گرفتن در معرض تنش‌های بالاتر از آستانه تحمل ممکن است به شدت آسیب ببیند (Salehi et al., 2023). در مناطق دارای آب و هوای مدیترانه­ای مانند جنوب غرب ایران، تنش گرمایی آخر فصل در طول دورۀ گلدهی و پر شدن دانه یک محدودیت مهم برای بهره­وری محصولات زمستانه از جمله گلرنگ است (Salehi et al., 2019; Salehi et al., 2023). تحمل به سرما و گرما در گلرنگ به رقم و مرحلۀ­ رشدی بستگی دارد. تأخیر در کاشت، سبب می­شود دورۀ گلدهی گیاه زراعی با آغاز گرمای پایان فصل بهار روبرو شده و نمو دانه­ها با خشکی و گرمای پایان دوره منطبق شود و این امر موجب کوتاه شدن فصل رشد شده و رسیدگی و پرشدن دانه­ها به طور مناسب صورت نگیرد (Goodarzian et al., 2020; Rahnama et al., 2024). بررسی تأثیر تنش­های محیطی از جمله گرما به عنوان یکی از عوامل مهم کاهش کمیت و کیفیت تولید دانه­های روغنی و نقش هورمون­های تعدیل­کننده آثار منفی این گونه تنش­ها و نیز بهبود کمیت و کیفیت محصول تولیدی می­تواند گام مؤثری در جهت بهبود و توسعۀ گیاهان دانه روغنی از جمله گلرنگ در شرایط نامطلوب محیطی محسوب شود.

پژوهش‌ها نشان داده است که تنش گرما در هر مرحله از چرخۀ زندگی گیاه به علّت اثر بر فرآیندهای متابولیکی سبب کاهش عملکرد می­شود (Wang et al., 2018; Attar Roshan et al., 2024). علاوه بر دهیدراته شدن بافت گیاه، تنش گرما ممکن است منجر به ایجاد تنش اکسیداتیو شود. به عنوان مثال، تولید و واکنش گونه­های اکسیژن واکنش­گر نشانه­هایی از صدمات سلولی حاصل از درجه حرارت­های بالا است (Zhou et al., 2019). گونه­های اکسیژن واکنش‌گر موجب پراکسید شدن کاتالیکی خودبخودی لیپید­های غشاء و رنگدانه­ها می­شود و همین امر موجب کاهش نفوذپذیری نسبی غشاء و تغییر فعالیت آن­ها می­شود. در بررسی اثر تنش گرما بر آفتابگردان مشاهده شد که تنش گرما سبب افزایش معنی‌دار محتوی مالون دی آلدئید و نشت یونی نسبت به تیمار شاهد شد (Sheikh Mamo et al., 2023). درپژوهشی گزارش شد تنش گرما سبب افزایش محتوی پراکسیدهیدروژن و در نهایت افزایش پراکسیداسیون لیپیدی شد که این موضوع در ارقام متحمل به گرمای گلرنگ، به واسطۀ افزایش فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان شدت کمتری داشت (Salehi et al., 2023). افزایش فعالیت آنزیم لیپوکسی­ژناز، واکنش­های پراکسیداسیون لیپیدها را کاتالیز می­کند (Singleton & Rossi, 2015). از سوی دیگر، مشخص شده است که فعالیت آنزیم لیپوکسی­ژناز در پاسخ به تنش افزایش می­یابد و سالیسیلیک اسید به عنوان یک محرک طبیعی سبب سنتز آنزیم‌­های دفاعی گیاه از قبیل لیپوکسی­ژناز (آنزیم اصلی مسیر بیوسنتزی اسیدجاسمونیک) می­شود (Liu et al., 2013).

همچنین شواهدی وجود دارد که نشاندهنده این است اسیدسالیسیلیک به عنوان مولکول­ پیام­رسان فعالیت می­کند و به عنوان یک گروه از انتقال‌دهندگان مهم پیام در دفاع از گیاه در برابر عوامل زیستی و غیرزیستی شناخته می­شود (Memelink, 2009). این مولکول پیام­رسان در برخی از مسیر­های انتقال پیام که القاکنندۀ آنزیم‌های خاص کاتالیزکنندۀ واکنش­های بیوسنتزی برای تشکیل ترکیب­های دفاعی مثل پلی­فنل­ها، آلکالوئیدها یا پروتئین­های مربوط به پاتوژن هستند، دخالت می­کنند و منجر به القای واکنش­های دفاعی می­شوند .یافته‌های متعددی مبتنی بر تأثیر مثبت اسیدسالیسیلیک بر عملکرد گیاه توسط تنظیم فرایندهای فیزیولوژیکی و بهبود روابط منبع و مخزن (Kaur et al., 2019)، فعالیت­ آنزیم­های آنتی­اکسیدان (Liu et al., 2013) و ویژگی‌های ریخت‌شناسی گیاه (Hossini et al., 2024) ارائه شده است. افزایش رنگیزه­های فتوسنتزی، پرولین، قندها و کاهش پراکسیداسیون لیپیدی غشاء نشان­دهنده کاهش خسارت اکسیداتیو و نقش اسیدسالیسیلیک در افزایش تحمل در برابر تنش است (Mohamed et al., 2020). در این پژوهش، تأثیر محلول­پاشی سالیسیلیک اسید به عنوان عامل کاهنـدۀ اثـرات زیـان­بـار تنش­های محیطی از جمله تنش گرما، بر بهبود برخی فاکتورهای بیوشیمیایی از جمله سیستم آنزیم‌‌های آنتی‌اکسیدان در شرایط مواجهۀ گیاه گلرنگ با تنش گرما مورد بررسی قرار گرفت.

مواد و روش­ها

پژوهش حاضر با هدف بررسی امکان کاهش خسارت ناشی از تنش گرمای آخر فصل با محلول‌پاشی سالیسیلیک اسید در گلرنگ زراعی در سال زراعی 98-1397 در مزرعة آموزشی- پژوهشی دانشگاه شهید چمران اهواز به‌صورت اسپلیت فاکتوریل در قالب طرح بلوک‌های کامل تصادفی در سه تکرار انجام شد. دو تاریخ کاشت 20 آذرماه و 30 دی ماه (به ترتیب به عنوان تاریخ کاشت به­هنگام و دیرهنگام) درکرت­های اصلی و محلول­پاشی غلظت­های هورمون اسیدسالسیلیک (صفر و 400 میکرو­مولار) و دو رقم گلرنگ زراعی (پرنیان به عنوان رقم حساس و فرامان به عنوان رقم متحمل به گرما) به­صورت فاکتوریل به عنوان عامل‌های فرعی در نظرگرفته شدند. تاریخ کاشت به­هنگام به عنوان تاریخ کاشت مناسب منطقه و تاریخ کاشت دیر هنگام جهت اعمال تیمـار تـنش گرمـای انتهـای فصـل شدید در مرحلۀ لقاح و پرشدن دانه در نظر گرفته شد. بذور ارقام مورد بررسی از مؤسسة تحقیقات اصلاح و تهیه نهال و بذر کرج تهیه شد. پیش از شروع آزمایش، به‌صورت تصادفی و از عمق 0-20 و 20-40 سانتی­متری محل آزمایش، نمونه خاک تهیه و تجزیۀ‌ فیزیکی و شیمیایی آن انجام شد (جدول 1). برخی از اطلاعات آب و هوایی محل اجرای پژوهش در دورۀ زمانی کاشت تـا رسیدگی فیزیولوژیک در جدول (2) نشان داده شده است.

براساس نتایج آزمون خاک مزرعه، 120 کیلوگرم کود نیتروژن در هکتار (60 کیلوگرم در زمان کاشت و 60 کیلوگرم در دو مرحلة روزت و آغاز گلدهی) از منبع اوره، 85 کیلوگرم کود فسفر در هکتار از منبع سوپرفسفات تریپل و 25 کیلوگرم پتاسیم در هکتار از منبع سولفات پتاسیم، قبل از کاشت استفاده شد. کرت‌های آزمایشی شامل 10 خط کاشت 5/2 متری با فواصل 50 سانتی‌متر بین ردیف‌ها و فاصلۀ 15 سانتی‌متر روی ردیف در نظر گرفته شد. بذور پس از ضدعفونی با قارچ­کش گرانوزان به‌صورت تناوبی در دو طرف پشته و در محل داغ‌آب در تاریخ کاشت­های مورد نظر کشت شدند. همچنین آبیاری به‌صورت کرتی انجام شد. آبیاری اول بلافاصله پس از کاشت، و آبیاری­های بعدی پس از رسیدن مقادیر رطوبت خاک به حدود 80 درصد ظرفیت زراعی انجام شد و تا پایان فصل رشد ادامه یافت. برای تعیین ظرفیت زراعی و پژمردگی دائم ابتدا نمونه­های اشباع خاک توسط صفحات فشاری در مکش‌های 3/0- و 15- بار قرار گرفت و درصد رطوبت وزنی خاک در هر دو مکش تعیین شد. درصد رطوبت حجمی خاک در هر مکش با توجه به وزن مخصوص ظاهری خاک تعیین و آب قابل استفاده خاک بین این دو نقطه محاسبه شد. درصد رطوبت حجمی خاک روزانه توسط دستگاه رطوبت­سنج (TDR) (ProCheck, Decagon Devices, USA) اندازه­گیری شد و آبیاری با رسیدن رطوبت خاک در ناحیة ریشه به 80 درصد آب قابل‌استفاده اعمال شد. سـطوح تیماری سالیسیلیک اسید در دو نوبت پس از خروج از مرحلۀ روزت (مرحلة 31-30 بر اساس مقیاس BBCH) و ابتدای دورة­ گلدهی (مرحلة 61-60 بر اساس مقیاس BBCH) براساس محاسبه هزار لیتر برای یک هکتار و نیاز محلول­پاشی هر کرت آزمایشی با میانگین یک لیتر به­صورت محلول­پاشی اعمال شد.

جهت نمونه­برداری کلیه صفات بیوشیمیایی در تمامی تیمارهای تاریخ کاشت، اندازه­گیری و نمونه­برداری­های تخریبی به صورت تصادفی از جوان­ترین برگ توسعه یافتۀ سه بوته در هر کرت در آغاز مرحلۀ پرشدن دانه (مرحلة 73-70 بر اساس مقیاس BBCH) انجام شد. نمونه­ها پس از برداشت در داخل فویل پیچیده و در نیتروژن مایع تثبیت شد و بلافاصله به فریزر70- درجه سانتی­گراد منتقل شدند.

استخراج پروتئین کل و سنجش فعالیت آنزیم‏های آنتی‏اکسیدان با اعمال تغییرات جزئی به صورت زیر انجام شد. تمامی مراحل استخراج در دمای 1±5 درجه سانتی­گراد در داخل یخ انجام شد. پس از قرار دادن نمونه‏ها در داخل هاون چینی مقداری ازت مایع روی آن‏ها ریخته شده و پس از سائیده شدن نمونه‏ها در هاون به حالت پودر درآمد. 25‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏/0 گرم از پودر حاصل پس از توزین به فالکون‏ها منتقل، سپس به آن 5‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏/2 میلی‏لیتر بافر استخراج افزوده شد. پس از 2 دقیقه ورتکس پودر نمونه‏ها و بافر استخراج، نمونه‏ها به مدت 20 دقیقه و در دمای 4 درجه سانتی­گراد با دور g ×13000 سانتریفیوژ شدند. در نهایت سوپرناتانت به دست آمده در داخل لوله‌های جداگانه 5‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏/1 میلی‌لیتری ریخته شده و داخل نیتروژن مایع فریز شدند. استخراج همه نمونه­ها در مدت کوتاهی انجام و همواره از بافر تازه استفاده شد. نمونه­های پروتئینی استخراجی جهت ارزیابی فعالیت­های آنزیمی در ویال­های جداگانه نگهداری شدند. از عصاره به دست آمده برای خواندن مقدار پروتئین کل و سنجش کمی فعالیت آنزیم­های کاتالاز، گایاکول­پراکسیداز، آسکوربات­پراکسیداز، گلوتاتیون­ردوکتاز، سوپر اکسیددیسموتاز، لیپوکسی­ژناز و پلی­فنل اکسیداز استفاده شد. در ادامه سنجش فعالیت آنزیم‌های کاتالاز و گایاکول‌پراکسیداز در دمای 25 درجه سانتی­گراد به روش چنس و مهلی (Chance & Maehly, 1955)، فعالیت آنزیم آسکوربات­پراکسیداز توسط روش (Ranieri, et al (2003)، فعالیت سوپراکسید دیسموتاز بر اساس روش (Dhindsa et al. (1981، فعالیت آنزیم پلی­فنل اکسیداز توسط روش (Kar & Mishra, (1976، فعالیت آنزیم لیپوکسی­ژناز توسط روش (Bonnet & Crouzet, (1977 و سنجش آنزیم فنیل­آلانین­آمونیالیاز بر اساس روش (Cindi et al. (2016 انجام شد.

برای محاسبۀ ظرفیت آنتی­اکسیدانی کل، میزان مهار رادیکـال‌هـای آزاد  DPPH(دی‌فنیل پیکریل هیدرازیل)، توسط دستگاه اسپکتوفتومتر و رابطۀ (1) محاسبه شد:

 اعداد به دست آمده برابر با درصد مهار رادیکال‌های آزاد در عصارۀ متانولی (ppm 1/0) نمونه‌ها است. غلظت پراکسید هیدروژن بر اساس واکنش پراکسید هیدروژن با یدور پتاسیم (KI) و توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (Unico, Model uv-2100, USA) در طول موج 390 نانومتر به روش (Alexieva et al. (2001 اندازه‌گیری شد. همچنین تجزیه و تحلیل آماری داده­ها توسط نرم­افزار آماری SAS نسخۀ 1/9 و مقایسه میانگین­ها توسط آزمون LSD در سطح احتمال پنج درصد انجام شد.

نتایج و بحث

غلظت پراکسیدهیدروژن

نتایج تجزیه واریانس نشان داد که برهم­کنش تاریخ کاشت×رقم بر غلظت پراکسید هیدروژن در سطح احتمال یک درصد معنی­دار بود (جدول 3). با توجه به نتایج مقایسه میانگین­ها، تنش گرمای ناشی از کاشت دیر هنگام سبب افزایش غلظت پراکسید هیدروژن شد. در شرایط دمایی مطلوب تفاوت محسوسی بین ارقام مشاهده نشد، در حالی که در شرایط تنش گرما تفاوت­های معنی‌دار آماری مشاهده شد (شکل 1). بیشترین غلظت پراکسید هیدروژن در رقم پرنیان در کشت دیرهنگام (با میانگین 0200‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏/0 میکرومول بر گرم وزن­تر) و کمترین مقدار در هر دو رقم پرنیان و فرامان (با میانگین 0033‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏/0 میکرومول بر گرم وزن­تر) بدون وجود تفاوت معنی­دار در شرایط مطلوب دمایی کاشت به هنگام مشاهده شد (شکل 1).

شکل 1- مقایسه میانگین غلظت پراکسیدهیدروژن گیاه گلرنگ تحت سطوح تاریخ کاشت و کاربرد هورمون سالیسیلیک اسید. مقادیر میانگین سه تکرار است. حروف غیر مشترک بیانگر تفاوت معنی­دار در سطح 5 درصد توسط آزمون LSD است.

Figure 1- Mean comparison for hydrogen peroxide concentration of safflower under different sowing date and foliar applications of salicylic acid. Values are the mean of three replicates. Different letters represent significant difference using LSD test at 5% probability level.

پراکسید هیدروژن در گیاهان، می­تواند نقشی دوگانه داشته باشد، به­طوری که در غلظت­های پائین به­عنوان یک پیام‌رسان حد واسط جهت تولید سالسیلیک اسید و اتیلن عمل می­کند و سبب تطابق بیشتر با شرایط تنش­زا می­شود، امّا در غلظت­های بالا منجر به تخریب بافت و در نهایت مرگ گیاه می­شود. به عبارت دیگر، پراکسید هیدروژن می­تواند به عنوان یک عامل دفاعی در برابر تنش­های غیر زیستی وتنش اکسیداتیو عمل نماید و سبب فعال شدن آنزیم‌‌های اکسیدان و بعضی اکسیدان­ها نظیر گلوتاتیون می­شود (Carvalho & Silveira, 2020). در پژوهش‌هاس قبلی نشان داده شده است که پراکسید هیدروژن در گیاهچه­های گندم سبب بهبود محتوی آب نسبی و افزایش پایداری غشاء درجهت کاهش نشت یونی شده است (Wahid et al., 2007)، بنابراین عملکرد پیام رسانی پراکسید هیدروژن در رشد، توسعه و دفاع گیاهان در برابر تنش­های محیطی بسیار مهم است.

فعالیت آنزیم کاتالاز

نتایج تجزیه واریانس نشان داد که بر هم­کنش تاریخ کشت×رقم و هورمون×رقم و همچنین بر هم­کنش سه­گانه تاریخ کشت×هورمون×رقم از نظر فعالیت آنزیم کاتالاز تفاوت معنی­داری نشان داد (جدول 3). نتایج نشان دادند حداکثر فعالیت آنزیم کاتالاز (346 تغییرات جذب بر میلی­گرم پروتئین بر دقیقه) در کشت دیر هنگام و تحت 400 میکرو­مولار محلول‌پاشی سالیسیلیک اسید در رقم فرامان مشاهده شد. همچنین حداقل فعالیت کاتالاز (112 تغییرات جذب بر میلی­گرم پروتئین بر دقیقه) در کشت به هنگام مربوط به رقم پرنیان در تیمار عدم محلول‌پاشی سالیسیلیک اسید بود. به­طور کلی، میزان فعالیت آنزیم کاتالاز در رقم فرامان، تحت محلول‌پاشی سالیسیلیک اسید و در تیمار تنش گرمای ناشی از کاشت دیرهنگام بیشتر از سایر تیمارها (346 تغییرات جذب بر میلی گرم پروتئین بر دقیقه) بود (شکل 2).

شکل 2- مقایسه میانگین فعالیت کاتالاز گیاه گلرنگ تحت سطوح تاریخ کاشت و کاربرد هورمون سالیسیلیک اسید. مقادیر میانگین سه تکرار است. حروف غیر مشترک بیانگر تفاوت معنی­دار در سطح 5 درصد توسط آزمون LSD است.

Figure 2- Mean comparison for catalase activity of safflower under different sowing date and foliar applications of salicylic acid. Values are the mean of three replicates. Different letters represent significant difference using LSD test at 5% probability level.

واکنش فعالیت کاتالاز نسبت به سالیسیلیک اسید در تاریخ کشت مطلوب و دیر هنگام در رقم پرنیان متفاوت و در رقم فرامان تقریباً یکسان بود. همچنین هم در شرایط مطلوب و هم در شرایط تنش گرما با محلول‌پاشی سالیسیلیک اسید فعالیت کاتالاز افزایش یافت. البته تحت تنش شدید گرما، این افزایش فعالیت بیشتر بود (شکل 2). بر اساس نتایج سایر پژوهش‌ها، در این بررسی تنش گرما موجب تنش اکسیداتیو شد (Min et al., 2018; Salehi et al., 2023). همچنین سالیسیلیک اسید در هر دو تاریخ کاشت، منجر به افزایش فعالیت آنزیم کاتالاز شد (شکل 2). اگرچه در گزارش هایی به کاهش فعالیت آنزیم کاتالاز در شرایط تنش گرما (Dat et al., 2009) و یا افزایش آن در شرایط تنش خشکی (Bazi Zlan et al., 2022) و تنش فلز سنگین کادمیوم (et al., 2024 Eydi Asl Shoshtari) اشاره شده است. به عنوان یک فرآیند خوپذیری به تنش، تیمار سالیسیلیک اسید در غلظت مناسب فعالیت کاتالاز را افزایش داده و به نوبه خود سطح پراکسیدهیدروژن را کاهش می­دهد (Noreen et al., 2009).

فعالیت آنزیم گایاکول‌پراکسیداز

بر هم­کنش تاریخ کاشت×رقم و همچنین بر هم­کنش­ تاریخ کاشت×هورمون×رقم از نظر فعالیت آنزیم گایاکول ‌پراکسیداز تفاوت معنی­داری داشت (جدول 3). با توجه به نتایج مشخص شد که تنش گرمای ناشی از کاشت دیر هنگام موجب کاهش فعالیت این آنزیم نسبت به شرایط مطلوب دمایی شد. همچنین در شرایط مطلوب دمایی و نیز تنش گرمای پایان فصل رشد محلول‌پاشی سالیسیلیک اسید موجب افزایش فعالیت آنزیم گایاکول­پراکسیداز شد. حداکثر فعالیت این آنزیم (291 تغییرات جذب بر میلی­گرم پروتئین بر دقیقه) در شرایط کشت به هنگام و تحت 400 میکرو­مولار محلول‌پاشی سالیسیلیک اسید در رقم فرامان مشاهده شد. حداقل فعالیت نیز (105 تغییرات جذب بر میلی­گرم پروتئین بر دقیقه) در شرایط کشت دیر هنگام مربوط به رقم پرنیان در تیمار عدم محلول‌پاشی سالیسیلیک اسید بود. به­طور کلی میزان فعالیت آنزیم گایاکول ‌پراکسیداز در رقم فرامان، تحت محلول‌پاشی سالیسیلیک اسید و در کشت به هنگام بیشتر از سایر تیمارها بود (شکل 3).

شکل 3- مقایسه میانگین فعالیت گایاکول پراکسیداز گیاه گلرنگ تحت سطوح تاریخ کاشت و کاربرد هورمون سالیسیلیک اسید. مقادیر میانگین سه تکرار است. حروف غیر مشترک بیانگر تفاوت معنی­دار در سطح 5 درصد توسط آزمون LSD است.

Figure 3- Mean comparison for guaiacol peroxidase activity of safflower under different sowing date and foliar applications of salicylic acid. Values are the mean of three replicates. Different letters represent significant difference using LSD test at 5% probability level.

در این پژوهش به نظر می­رسد فعالیت این آنزیم تأثیری بر سازوکارهای تحمل به تنش گرما نداشته است. از سوی دیگر افزایش فعالیت آنزیم گایاکول­پراکسیداز ناشی از کاربرد سالیسیلیک اسید نیز می­تواند نشان‌دهندة نقش این ماده در القای واکنش‌های آنتی­اکسیدان باشد که موجب حفاظت از گیاه در برابر آسیب­های اکسیداتیو می‌شود. بر اساس یافته‌ها ثابت شده است که اثر کاربرد مواد خارجی نه تنها به نوع، نحوة استفاده و غلظت آن ماده بستگی دارد، بلکه به نوع ماهیت محصول زراعی و شدت تنش نیز بستگی دارد، همچنان که تأثیر سالیسیلیک اسید بر فعالیت آنزیم گایاکول­پراکسیداز تحت شرایط تنش در آزمایش‌های (El Dakak & Hassan, (2020 نیز گزارش شده است. افزایش فعالیت آنزیم های آنتی­اکسیدان هم در شرایط تنش و هم در شرایط مساعد محیطی می­تواند به عنوان شاخصی برای افزایش تولید رادیکال­های آزاد به عنوان پیام­رسان ثانویه در نظر گرفته شود.

فعالیت آنزیم آسکوربات‌پراکسیداز

فعالیت آنزیم آسکوربات‌پراکسیداز تحت­ تأثیر برهم­کنش­ تاریخ کاشت×هورمون و هورمون×رقم و همچنین برهم­کنش­ تاریخ کاشت× هورمون×رقم قرار گرفت (جدول 3). نتایج حاکی از آن بود که با افزایش دما در کاشت دیر هنگام فعالیت آنزیم آسکوربات­پراکسیداز به ویژه در شرایط کاربرد 400 میلی­مولار سالیسیلیک اسید افزایش یافت و اختلاف معنی­داری بین شرایط محلول‌پاشی سالیسیلیک اسید و عدم محلول‌پاشی در هر دو رقم مشاهده شد. با توجه به نتایج حاصل از برهم­کنش­ تیمارهای مورد آزمایش، حداکثر میزان فعالیت آنزیم آسکوربات­پراکسیداز در شرایط تنش گرما و کاربرد 400 میکرو­مولار سالیسیلیک اسید در رقم فرامان (9‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏/45 تغییرات جذب بر میلی­گرم پروتئین بر دقیقه) و حداقل میزان فعالیت این آنزیم در رقم پرنیان در شرایط عدم کاربرد سالیسیلیک اسید و تحت کاشت به هنگام (5‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏/13 تغییرات جذب بر میلی­گرم پروتئین بر دقیقه) مشاهده شد. به­طور کلی در رقم فرامان فعالیت آسکوربات­پراکسیداز بالاتر از رقم پرنیان بود (شکل 4).  

شکل 4- مقایسه میانگین فعالیت آسکوربات پراکسیداز گیاه گلرنگ تحت سطوح تاریخ کاشت و کاربرد هورمون سالیسیلیک اسید. مقادیر میانگین سه تکرار است. حروف غیر مشترک بیانگر تفاوت معنی­دار در سطح 5 درصد توسط آزمون LSD است.

Figure 4- Mean comparison for ascorbat peroxidase activity of safflower under different sowing date and foliar applications of salicylic acid. Values are the mean of three replicates. Different letters represent significant difference using LSD test at 5% probability level.

سازوکار دفاع آنتی­اکسیدانی، بخشی از سازگاری به تنش گرما است و با تحمل دماهای بالا همبستگی مثبت دارد. فعالیت آنزیم آسکوربات­پراکسیداز در ارتباط با ظهور آسیب‌های فیزیولوژیک ناشی از تنش­های حرارتی است و کاهش فعالیت آن در بافت­های تحت تنش در سطوح بالای گونه­های اکسیژن واکنش­گر می­تواند منجر به بروز آسیب شود (Wahid et al., 2007). (Kaya, et al (2021 و همچنین (Eydi Asl Shoshtari et al. (2024 افزایش فعالیت آنزیم آسکوربات­پراکسیداز در اثر کاربرد سالیسیلیک اسید در شرایط تنش را تأیید کردند. با توجه به نتایج این پژوهش مشخص شد که سالیسیلیک اسید موجب القای فعالیت آنزیم آسکوربات­پراکسیداز در شرایط تنش شدید گرما شد و این میزان بیشتر از گیاهان شاهد در کاشت به هنگام بود. عدم افزایش محسوس فعالیت آنزیم آسکوربات­پراکسیداز در رقم پرنیان می­تواند یکی از مهم­ترین عوامل حساسیت این رقم به تنش گرما به شمار آید. زیرا این آنزیم در چرخه­های گلوتاتیون-آسکوربات و مهلر (Halliwell, 2009) فعالیت می­کند که کاهش فعالیت آن به همراه کاهش کارایی چرخه­های یاد شده نقش دارد.

فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز

کلیه بر هم­کنش­ها از نظر فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز تفاوت معنی­داری داشتند (جدول 3). نتایج بر همکنش تیمارهای آزمایشی نشان داد که میزان فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز در تیمارهای محلول‌پاشی هورمون هم تحت شرایط مطلوب و هم تحت شرایط تنش شدید گرما بیشتر از شرایط عدم کاربرد سالیسیلیک اسید بود. در شرایط تنش گرما و نیز شرایط دمایی مطلوب حداکثر فعالیت سوپراکسید دیسموتاز (به ترتیب با میانگین­های 5‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏/141 و 5‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏/95 تغییرات جذب در میلی­گرم پروتئین در دقیقه) به تیمار محلول‌پاشی 400 میکرو­مولار سالیسیلیک اسید در رقم فرامان اختصاص یافت، همچنین حداقل فعالیت سوپراکسید دیسموتاز در شرایط تنش شدید گرما و نیز شرایط دمایی مطلوب (به ترتیب با میانگین‌های 5‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏/51 و 6‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏/45 تغییرات جذب در میلی­گرم پروتئین در دقیقه) تحت تیمار عدم محلول‌پاشی و در رقم پرنیان مشاهده شد (شکل 5).

شکل 5- مقایسه میانگین فعالیت سوپراکسید دیسموتاز گیاه گلرنگ تحت سطوح تاریخ کاشت و کاربرد هورمون سالیسیلیک اسید. مقادیر میانگین سه تکرار است. حروف غیر مشترک بیانگر تفاوت معنی­دار در سطح 5 درصد توسط آزمون LSD است.

Figure 5- Mean comparison for superoxide dismutase activity of safflower under different sowing date and foliar applications of salicylic acid. Values are the mean of three replicates. Different letters represent significant difference using LSD test at 5% probability level.

از آن­جا که سوپراکسید دیسموتاز اولین پاکسازی­کنندة رادیکال­های آزاد در سلول­های گیاهی است، می­توان آن را جزو اولین سازوکارهای حساس و مؤثر در شرایط تنش شدید گرما بیان نمود (Zhao et al., 2018). همزمان با افزایش فعالیت این آنزیم در رقم متحمل به گرمای رقم فرامان، برخی از پژوهشگران نیز معتقدند که افزایش فعالیت آنزیم­­های آنتی­اکسیدان سبب افزایش تحمل گیاهان به تنش دمایی می­شود (Jahan et al., 2019). علت آن است که با افزایش فعالیت این آنزیم­­ها بین تولید و پاکسازی انواع اکسیژن واکنش­گر در سلول­های گیاهی، تعادل ایجاد شده و از شدت خسارت به مولکول‌های زیستی و اختلالات متابولیسمی ذکر شده کاسته می­شود. به این ترتیب، سلول در وضعیت مطلوب­تری قرار گرفته، از وقوع تنش اکسیداتیو پیشگیری می­شود. همچنین در پژوهش حاضر، در رقم پرنیان فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز به­طور­ معنی­داری کمتر از رقم فرامان بوده است (شکل 5).

فعالیت آنزیم پلی­فنول‌اکسیداز

فعالیت آنزیم پلی‌­فنول‌اکسیداز تنها تحت­ تأثیر برهم­کنش­ تاریخ کاشت×هورمون قرار گرفت (جدول 3). نتایج مقایسه میانگین­ها حاکی از آن بود که رقم پرنیان (با میانگین 184‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏/0 تغییرات جذب بر میلی­گرم پروتئین بر دقیقه) میزان فعالیت آنزیم پلی‌فنول­اکسیداز کمتری را نسبت به رقم فرامان (با میانگین 206‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏/0 تغییرات جذب بر میلی­گرم پروتئین بر دقیقه) نشان داد. همچنین نتایج حاصل از مقایسه میانگین­های اثر تنش گرما در محلول‌پاشی سالیسیلیک اسید نشان داد که تنش گرما موجب افزایش فعالیت این آنزیم در هر دو سطح عدم کاربرد و کاربرد 400 میکرو­مولار سالیسیلیک اسید (به ترتیب 2‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏/69 و 2‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏/24 درصد) نسبت به شاهد شد، هر چند در شرایط تنش شدید گرما بین سطوح محلول‌پاشی اختلاف معنی­داری وجود نداشت (شکل 6).

شکل 6- مقایسه میانگین فعالیت پلی­فنول­اکسیداز گیاه گلرنگ تحت سطوح تاریخ کاشت و کاربرد هورمون سالیسیلیک اسید. مقادیر میانگین سه تکراراست. حروف غیر مشترک بیانگر تفاوت معنی­دار در سطح 5 درصد توسط آزمون LSD است.

Figure 6- Mean comparison for polyphenol oxidase activity activity of safflower under different sowing date and foliar applications of salicylic acid. Values are the mean of three replicates. Different letters represent significant difference using LSD test at 5% probability level.

اگرچه که فعالیت پلی­فنول­اکسیداز در این آزمایش در تیمارهای متفاوت تاریخ کاشت نسبت به محلول‌پاشی سالیسیلیک اسید متفاوت بود، اما افزایش فعالیت این آنزیم در اثر محلول‌پاشی سالیسیلیک اسید بیان­کننده این مساله است که سالیسیلیک اسید از نقش ویژه­ای در حفاظت گیاه در برابر آسیب­های اکسیداتیو برخوردار است. بنابراین مطابق با نتایج این پژوهش، کاربرد سالیسیلیک اسید می­تواند یک راهبرد برای بهبود تحمل تنش­های غیرزیستی همانند تنش گرمای انتهای فصل رشد باشد (Mutlu et al., 2013). اگرچه افزایش غلظت محلول‌پاشی سالیسیلیک اسید در شرایط تنش گرمای ناشی از کاشت دیرهنگام موجب کاهش فعالیت آنزیم پلی‌فنول­اکسیداز شد (شکل 6). در آزمایش­های مختلف نیز به نقش سالیسیلیک اسید در افزایش فعالیت آنزیم­­های آنتی­اکسیدان اشاره شده است. آنزیم پلی­فنول­اکسیداز در گیاهان تحت تنش سبب اکسیدشدن ترکیبات فنولی می­شود که در حساسیت گیاهان به تنش نقش مهمی ایفا می­کند. این آنزیم قادر است ترکیبات فنلی را به اورتوکینون، اکسید کند (Amiot et al., 2012).

فعالیت آنزیم لیپوکسی­ژناز

براساس نتایج تجزیه واریانس، کلیه برهم­کنش­ها از نظر فعالیت آنزیم لیپوکسی­ژناز در سطح احتمال یک درصد تفاوت معنی­داری داشتند (جدول 3). آنزیم لیپوکسی­ژناز یک گروه از آنزیم‌­های حاوی آهن است که اکسیژناسیون اسیدهای چرب غیراشباع را کاتالیز می‌کند.با توجه به نتایج حاصل از مقایسه میانگین­های تیمارهای مورد بررسی مشخص شد که محلول‌پاشی سالیسیلیک اسید موجب افزایش میزان فعالیت این آنزیم در هر دو رقم و هر دو شرایط تنش گرما و شرایط مساعد محیطی شد. از سوی دیگر، در رقم پرنیان و فرامان کاربرد 400 میکرو­مولار سالیسیلیک اسید موجب افزایش فعالیت آنزیم لیپوکسی­ژناز به ترتیب به میزان 9‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏/63 و 9‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏/53 درصد در شرایط مساعد محیطی (شاهد) و 7‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏/84 و 01‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏/26 درصد در شرایط تنش شدید گرما نسبت به تیمار عدم کاربرد سالیسیلیک اسید شد. همچنین یافته‌ها نشان دادند بالاترین میزان فعالیت این آنزیم در شرایط تنش شدید گرما تحت تیمار عدم کاربرد سالیسیلیک اسید در رقم پرنیان (76‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏/65 تغییرات جذب بر میلی­گرم پروتئین بر دقیقه) و پائین­ترین میزان فعالیت آن در شرایط شاهد تنش گرما و تحت تیمار عدم کاربرد سالیسیلیک اسید در هر دو رقم مورد بررسی (به ترتیب در ارقام پرنیان و فرامان با میانگین­های 8‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏/11 و 8‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏/12 تغییرات جذب بر میلی­گرم پروتئین بر دقیقه بدون اختلاف معنی­دار نسبت به هم) مشاهده شد (شکل 7).

شکل 7- مقایسه میانگین فعالیت لیپوکسی­ژناز گیاه گلرنگ تحت سطوح تاریخ کاشت و کاربرد هورمون سالیسیلیک اسید. مقادیر میانگین سه تکرار است. حروف غیر مشترک بیانگر تفاوت معنی­دار در سطح 5 درصد توسط آزمون LSD است.

Figure 7- Mean comparison for lipoxygenase activity activity of safflower under different sowing date and foliar applications of salicylic acid. Values are the mean of three replicates. Different letters represent significant difference using LSD test at 5% probability level.

آنزیم لیپوکسی­ژناز، نقش آشکاری در طی جوانه­زنی داشته که منجر به اکسیداسیون لیپیدهای ذخیره­ای و شروع مصرف لیپیدها به عنوان منبع انرژی و کربن جهت رشد دانه می­شوند (Babar Ali et al., 2005). از این رو می­توانند اثر مهمی بر روی کیفیت تغذیه­ای و ارزش غذایی گیاهان به عنوان غذا داشته باشند و فعالیت آنزیم لیپوکسی­ژناز تحت تنش افزایش می­یابد. سطوح بالای نشت یونی همراه با میزان بالای فعالیت آنزیم لیپوکسی­ژناز و میزان تجمع مالون­دی­آلدئید نشان­دهندة این واقعیت است که رقم حساس پرنیان تحت تنش گرما کم­ترین میزان انسجام غشایی را دارا است. تحت شرایط تنش، میزان گونه­های اکسیژن واکنش­گر و میزان فعالیت آنزیم لیپوکسی­ژناز افزایش می­یابد که سبب افزایش نفوذپذیری غشای سلول و در نتیجه افزایش نشت یونی از سلول به خارج می­شود (Chen et al., 2021).

فعالیت آنزیم فنیل­آلانین­آمونیالیاز

نتایج تجزیه واریانس نشان داد که از نظر فعالیت آنزیم فنیل­آلانین­آمونیالیاز، برهم­کنش تاریخ کاشت× هورمون، و تاریخ کاشت×رقم و هورمون×رقم و همچنین اثرات سه­گانه تاریخ کاشت×هورمون×رقم اختلاف آماری معنی­داری نشان دادند (جدول 3). کاربرد سالیسیلیک اسید در شرایط تنش گرما سبب افزایش فعالیت آنزیم فنیل‌آلانین‌آمونیالیاز در هر دو رقم مورد بررسی شد، در حالی که در شرایط کاشت به هنگام (شاهد تنش گرما) نتایج متفاوتی به ویژه در رقم فرامان مشاهده شد. بیشترین میزان فعالیت این آنزیم مربوط به رقم فرامان در شرایط کاشت دیر هنگام و محلول‌پاشی 400 میکرو­مولار اسید سالیسیلیک (با میانگین 5‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏/116 تغییرات جذب بر میلی­گرم پروتئین بر دقیقه) بود و کمترین میزان آن در شرایط کاشت به هنگام و محلول‌پاشی 400 میکرو­مولار سالیسیلیک اسید در رقم فرامان (با میانگین 01‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏/59 تغییرات جذب بر میلی­گرم پروتئین بر دقیقه) ثبت شد که البته تفاوت معنی­داری با تیمار کاشت به هنگام و عدم محلول‌پاشی سالیسیلیک اسید در رقم پرنیان (با میانگین 8‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏/60 تغییرات جذب بر میلی­گرم پروتئین بر دقیقه) نداشت (شکل 8).

شکل 8- مقایسه میانگین فعالیت فنیل­آلانین­آمونیالیاز گیاه گلرنگ تحت سطوح تاریخ کاشت و کاربرد هورمون سالیسیلیک اسید. مقادیر میانگین سه تکرار است. حروف غیر مشترک بیانگر تفاوت معنی­دار در سطح 5 درصد توسط آزمون LSD است.

Figure 8- Mean comparison for phenylalanine ammonia-lyase activity activity of safflower under different sowing date and foliar applications of salicylic acid. Values are the mean of three replicates. Different letters represent significant difference using LSD test at 5% probability level.

افزایش فعالیت آنزیم فنیل­آلانین­آمونیالیاز موجب افزایش متابولیت­های مسیر فنیل­پروپانوئید مانند فنول­ها، فلاونوئیدها و لیگنین می‌شود که در سیستم دفاعی گیاه نقش مهمی دارند. آنزیم فنیل­آلانین­آمونیالیاز آنزیمی کلیدی در تشکیل ترکیبات فنولی به عنوان یکی از راهبردهای دفاعی غیرآنزیمی در گیاهان محسوب می شود و به عنوان یکی از شاخص­های حساس به تغییرات محیطی و همچنین یکی از نشانگرهای زیست شیمیایی دفاعی گیاه در برابر تنش­های محیطی مطرح است (Kliebenstein, 2004). ترکیبات فنولی دارای خاصیت آنتی­اکسیدانی هستند که با جمع­آوری و احیای گونه­های اکسیژن واکنش­گر از اکسیداسیون مولکول­های حیاتی سلول جلوگیری کرده و مانع از بروز تنش اکسیداتیو در سلول­های گیاه می­شوند (Rice-Evans,1997). رقم فرامان در شرایط تنش شدید گرما از یک سو، با افزایش شدیدتر فعالیت آنزیم فنیل­آلانین­آمونیالیاز و از سوی دیگر فعالیت پائین­تر آنزیم گایاکول­پراکسیداز موجب افزایش تجمع ترکیبات فنولی شده است. پژوهشگران دریافتند که یکی از آنزیم‌‌های کلیدی در مسیر تولید ترکیبات فنیل پروپانوئیدی، فنیل­آلانین­آمونیالیاز بوده که بیوسنتز طیف وسیعی از ترکیبات فنلی را تنظیم می­کند. آن­ها همچنین اظهار داشتند که تیمار اسید سالیسیلیک سبب افزایش بیان ژن فنیل­آلانین‌آمونیالیاز می­شود (Abdekhani et al., 2014). اسید سالیسیلیک سبب فعالیت بیش­تر آنزیم فنیل­آلانین­آمونیالیاز می­شود که این افزایش سبب مقاومت بیش­تر گیاه به دماهای بالا می­شود (Vogt, 2010). اسید سالیسیلیک با تأثیر بر آنزیم فنیل­آلانین­آمونیالیاز سبب فعال‌سازی مسیر فنیل­پروپانوئیدی و افزایش تولید ترکیبات فنلی می­شوند (Wang et al., 2009).

فعالیت آنزیم گلوتاتیون­ردوکتاز

از نظر فعالیت آنزیم گلوتاتیون­ردوکتاز، بر هم­کنش تاریخ کاشت×رقم و همچنین بر هم­کنش تاریخ کاشت×هورمون×رقم اختلاف آماری معنی­داری نشان دادند (جدول 3). نتایج مقایسه میانگین­ها نشان داد که در شرایط کاشت دیر هنگام میزان فعالیت این آنزیم افزایش یافت و این افزایش در شرایط محلول‌پاشی 400 میکرو­مولار سالیسیلیک اسید شدیدتر بود (شکل 9). در شرایط تنش گرمای ناشی از کاشت دیرهنگام رقم پرنیان در شرایط محلول‌پاشی با 400 میکرو­مولار سالیسیلیک اسید بیشترین مقدار فعالیت آنزیم گلوتاتیون­ردوکتاز (با میانگین 4‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏/31 تغییرات جذب بر میلی­گرم پروتئین بر دقیقه) را داشت. کمترین مقدار آن نیز در شرایط کاشت به هنگام و عدم کاربرد سالیسیلیک اسید در رقم فرامان (با میانگین 6‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏/12 تغییرات جذب بر میلی­گرم پروتئین بر دقیقه) حاصل شد (شکل 9).

شکل 9- مقایسه میانگین فعالیت گلوتاتیون ردوکتاز گیاه گلرنگ تحت سطوح تاریخ کاشت و کاربرد هورمون سالیسیلیک اسید. مقادیر میانگین سه تکرار است. حروف غیر مشترک بیانگر تفاوت معنی­دار در سطح 5 درصد توسط آزمون LSD است.

Figure 9- Mean comparison for glutathione reductase activity activity of safflower under different sowing date and foliar applications of salicylic acid. Values are the mean of three replicates. Different letters represent significant difference using LSD test at 5% probability level.

گیاهان در مقابله با تنش­های محیطی،  فعالیت آنزیم­­های آنتی­اکسیدان خود را افزایش می­دهند که این امر سیستم دفاعی گیاه را تقویت می­کند. یکی از این آنزیم­های دفاعی آنزیم گلوتاتیون­ردوکتاز است. نتایج پژوهش‌ها نشان داد که فعالیت این آنزیم آنتی­اکسیدان تحت تنش گرما افزایش یافت (Zongwen et al., 2005). پژوهشگران اظهار داشتند که بیان ژن­های گلوتاتیون­ردوکتاز واکنشی قوی به تنش غیرزیستی بوده و هم­چنین تحت تأثیر هورمون­های گیاهی مختلف از جمله سالیسیلیک اسید قرار گرفت (Kaya et al., 2020). همچنین نتایج نشان دادند سطح پراکسید هیدروژن توسط گلوتاتیون نیز تنظیم می­شود که پس از کاربرد سالیسیلیک اسید مقادیر گلوتاتیون افزایش یافت (Banerjee & Roychoudhury, 2019).

ظرفیت آنتی­اکسیدانی کل

از نظر ظرفیت آنتی­اکسیدانی کل، بر هم­کنش تاریخ کاشت×هورمون و هورمون×رقم و همچنین بر هم­کنش تاریخ کاشت×هورمون×رقم اختلاف آماری معنی­داری نشان دادند (جدول 3). تنش دمای بالا سبب افزایش معنی­دار ظرفیت آنتی­اکسیدانی کل نسبت به شرایط شاهد دمایی شد. شواهد فیزیولوژیک و ژنتیکی به­روشنی نشان می­دهد که سیستم آنتی­اکسیدان گیاه یک جزء مهم از سازوکارهای حفاظتی در برابر تنش است. آنزیم ­های آنتی­اکسیدانی یک سیستم با کارایی بالا ایجاد می­کنند که گونه­های اکسیژن واکنش­گر تولیدشده را غیرفعال می­کنند و خسارات ناشی از آن­ها را کاهش می­دهند. بنابر نتایج مقایسه میانگین، پائین­ترین میزان ظرفیت آنتی­اکسیدان کل در هر دو رقم و هر دو تیمار کاربرد و عدم کاربرد سالیسیلیک اسید بدون اختلاف معنی­دار نسبت به هم در شرایط مساعد محیطی (شاهد تنش گرما) حاصل شد. به بیان دیگر در شرایط دمایی مطلوب اختلاف محسوسی بین ارقام و شرایط محلول‌پاشی و عدم محلول‌پاشی سالیسیلیک اسید مشاهده نشد، در حالی­که افزایش دمای محیط منجر به افزایش ظرفیت آنتی­اکسیدان کل به ترتیب در رقم پرنیان و فرامان به میزان 8‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏/24 و 3‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏/11 درصد در شرایط عدم کاربرد سالیسیلیک اسید و 7‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏/36 و 5‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏/46 درصد در شرایط کاربرد 400 میکرو­مولار سالیسیلیک اسید نسبت به شرایط شاهد شد (شکل 10). تغییر در فعالیت آنزیم‌های آنتی­اکسیدانی یکی از راهبردهایی است که در گیاهان برای افزایش تحمل تنش رخ می­دهد. گونه­های گیاهی که به تنش مقاوم­تر هستند، مقدار آنتی­اکسیدان­های آنزیمی آن­ها، تحت تنش، افزایش بیش­تری یافته و از غشاء در مقابل صدمات ناشی از تنش محافظت می­کند. آنزیم‌های آنتی­اکسیدان با سم­زدایی گونه­های اکسیژن واکنش­گر در ایجاد مقاومت به تنش اکسیداتیو در گیاه نقش اساسی دارند (Sakhabutdinova et al., 2003). بر اساس نتایج گزارش شده است که کاربرد خارجی سالیسیلیک اسید فعالیت آنزیم‌‌های آنتی­اکسیدانی درون سلولی را تحریک کرده و تحمل گیاه به تنش‌های محیطی را افزایش می‌دهد (Sakhabutdinova et al., 2003). با وجود این، بهبود بعضی از فرآیندهای فیزیولوژیکی و بازداری از بعضی از فرآیندها بستگی به غلظت اسید سالیسیلیک، گونه‌های گیاهی، مراحل مختلف توسعه و شرایط محیطی دارد. پژوهشگران بیان کردند که غلظت­های پائین سالیسیلیک اسید سبب افزایش ظرفیت آنتی­اکسیدانی می­شود، اما در غلظت­های بالا مرگ سلول یا حساسیت نسبت به تنش­های غیرزیستی را موجب می­شود (Hara et al., 2012). افزایش آنتی­اکسیدان­ها و در نتیجه ظرفیت آنتی­اکسیدانی نقش مهمی در به تأخیر انداختن یا جلوگیری از اکسیداسیون سوبستراهای سلولی قابل اکسید ایفا می­کند (Pennycooke et al., 2005).

شکل 10- مقایسه میانگین ظرفیت آنتی­کسیدانی کل گیاه گلرنگ تحت سطوح تاریخ کاشت و کاربرد هورمون سالیسیلیک اسید. مقادیر میانگین سه تکرار است. حروف غیر مشترک بیانگر تفاوت معنی­دار در سطح 5 درصد توسط آزمون LSD است.

Figure 10- Mean comparison for DPPH of safflower under different sowing date and foliar applications of salicylic acid. Values are the mean of three replicates. Different letters represent significant difference using LSD test at 5% probability level.

همچنان­که در این آزمایش مشخص شد شرایط تنش منجر به آسیب به غشاء و افزایش میزان مالون­دی­آلدئید و پراکسید هیدروژن شده است و از سوی دیگر ،کاربرد سالیسیلیک اسید سبب کاهش شدت تنش شد. محتوی مالون دی آلدئید دومین محصول نهایی اکسیداسیون اسیدهای چرب غیر اشباع است و به­طور کلی اندازه­گیری میزان پراکسیداسیون لیپیدها به عنوان شاخص تنش اکسیداسیونی برای بررسی میزان آسیب‌های وارده به غشاء تحت شرایط تنش مورد استفاده قرار می­گیرد. با توجه به کاهش قابل ملاحظه نشت­یونی به واسطۀ کاربرد سالیسیلیک اسید، به نظر می­رسد این ترکیب مانع از شکل­گیری ترکیبات مذکور در اثر اکسیداسیون اسیدهای چرب به ویژه مالون­دی­آلدئید می­شوند. بر اساس گزارش­های مختلف استفاده از سالیسیلیک اسید همراه با تنش سبب افزایش بعضی از فرآیند‌های فیزیولوژیک می­شود که می­تواند بر افزایش تحمل گیاه در برابر تنش منجر شود (Yazdanpanah et al., 2011).  

نتیجه گیری کلی

از نتایج این پژوهش چنین استنباط می­شود که وقوع تنش گرمای آخر فصل ناشی از کاشت دیرهنگام سبب افزایش غلظت پراکسید هیدروژن به عنوان یکی از گونه‌های اکسیژن واکنش‌گر شد که منجر به تنش اکسیداتیو در گیاه می‌شود و غلظت این ترکیب در رقم حساس پرنیان به طور معنی‌داری بالاتر از رقم فرامان بود. تحت این شرایط کاربرد خارجی سالیسیلیک اسید در غلظت 400 میکرومولار به صورت محلول‌پاشی سبب افزایش فعالیت آنزیم‌های کاتالاز، آسکوربات پراکسیداز، سوپراکسید دیسموتاز، پلی‌فنول‌اکسیداز و فنیل‌آلانین ‌آمونیالیاز به ویژه در رقم متحمل فرامان شد. با توجه به نتایج، کاربرد غلظت 400 میکرومولار سالیسیلیک اسید توانست توسط بهبود فعالیت آنزیم­های أنتی­اکسیدان در کاهش اثرات مخرب تنش گرمای پایان فصل رشد در گلرنگ مؤثر باشد و با توجه به تأثیر این هورمون بر بهبود تعدیل فعالیت آنتی اکسیدانی گیاه در شرایط تنش گرما می‌توان با کاربرد برگی این هورمون به عنوان یک راهکار مدیریتی در شرایط تنش استفاده کرد.

سپاسگزاری

 بدین­وسیله نویسندگان از حمایت­های معاونت پژوهش و فناوری دانشگاه شهید چمران اهواز کمال قدردانی را دارند.