جداسازی و شناسایی گونه‌های فوزاریوم مرتبط با گیاهان خودرو مزارع گندم در غرب ایران و شناسایی مایکوتوکسین‌های مهم تولیدشده توسط آنها

مقدمه

فوزاریوم یکی از عوامل بیماری‌زای گیاهی رایج در اغلب مناطق اقلیمی جهان به شمار می‌رود که پیامدهای اجتماعی و اقتصادی گسترده‌ای به‌ همراه داشته است و این تأثیرات همچنان ادامه دارد (1). سیستم طبقه‌بندی جنس فوزاریوم شامل مجموعه‌ای متنوع از گونه‌هایی است که توانایی تولید مایکوتوکسین داشته‌اند، به‌عنوان ساپروفیت، اندوفیت و پاتوژن‌های گیاهی فعالیت می‌کنند و از این جهت، تهدیدی بالقوه برای سلامت انسان‌ها و حیوانات محسوب می‌شوند. پیشینه مطالعاتی انجام‌شده پیرامون این جنس، بر اهمیت اقتصادی قابل‌توجه آن تأکید دارد، به‌ویژه با تمرکز بر گونه‌هایی که به محصولات کشاورزی مرتبط هستند. با این حال، به نظر می‌رسد بخش چشمگیری از گونه‌های فوزاریومِ مرتبط با گیاهان زراعی، خاستگاهی از جمعیت‌های طبیعی در زیستگاه‌های بومی داشته‌اند. انتقال قارچ‌های رشته‌ای گیاهی از اکوسیستم‌های کشاورزی به زیستگاه‌های طبیعی نقش کلیدی در حفظ تنوع زیستی ایفا می‌کند. انتقال قارچ‌ها از یک میزبان به میزبان دیگر که به آن «اسپیلور» گفته می‌شود، می‌تواند تأثیر چشمگیری بر شیوع قارچ‌ها داشته باشد و بر جوامع میزبان به شدت تأثیر بگذارد (2). مطالعه تنوع گونه‌ای فوزاریوم در جمعیت‌های طبیعی و نحوه تعامل آنها با اکوسیستم‌های کشاورزی، می‌تواند بینش‌های ارزشمندی در زمینة اکولوژی و بیماری‌زایی این جنس فراهم آورد. شواهد حاصل از بررسی اندوفیت‌های گیاهان علفی در زیستگاه‌های طبیعی، منجر به شناسایی و توصیف گونه‌های جدیدی از فوزاریوم شده است که پیش‌تر ناشناخته بوده‌اند (3).

گونه‌های فوزاریوم قادرند در طی چرخه کامل رشد گیاهان، آنها را کلونی‌سازی کنند و به‌عنوان عوامل بیماری‌زای اولیه یا مهاجمان ثانویه عمل کنند. افزون بر این، بسیاری از این گونه‌ها توانایی تولید و تجمع طیف گسترده‌ای از متابولیت‌های ثانویه سمی موسوم به مایکوتوکسین‌ها را در بافت‌های گیاهی دارند که این ترکیبات می‌توانند اثرات زیان‌بار چشمگیری بر سلامت گیاه، انسان و دام بر جای گذارند (4). مایکوتوکسین‌هایی نظیر فومونیزین‌ها (FUM)، دئوکسی‌نیوالنول (DON)، HT2، T2، و زیرالنون (ZEA) ازجمله متابولیت‌های ثانویه‌ای هستند که به‌طور عمده توسط گونه‌های مختلف جنس فوزاریوم تولید می‌شوند (5, 6). فومونیزین‌ها مایکوتوکسین‌های بسیار سمی و سرطان‌زا هستند که نخستین‌بار در سال ۱۹۸۸ شناسایی شدند. در میان آنها، فومونیزین B مهم‌ترین و شایع‌ترین فرم بوده است که به‌طور عمده در گیاهان آلوده یافت می‌شود. فومونیزین B1، رایج‌ترین زیرگونه این گروه، عمدتاً توسط F. verticillioides و F. proliferatum تولید می‌شود و بالاترین غلظت را در نمونه‌های آلوده دارد. مطالعات اپیدمیولوژیک بیان کرده­اند مصرف فومونیزین با بروز سرطان مری در انسان‌ها و همچنین برخی از بدخیمی‌ها در حیوانات مرتبط است (5). زیرالنون یک لاکتون اسید رسورسیلیک فنولی است که از بسیاری از گونه‌های فوزاریوم، ازجمله F. graminearum، F. culmorum، F. crookwellense و F. equiseti منشأ می‌گیرد. اثرات مضر زیرالنون عمدتاً به فعالیت استروژنی آن نسبت داده می‌شود که منجر به اختلالات هورمونی، به‌ویژه در خوک‌ها، گاوها و گوسفندها می‌شود (6). مطالعات متعدد نشان داده‌اند حضور گرامینه‌های وحشی رشدیافته در حاشیه مزارع کشاورزی، بر فراوانی گونه‌های فوزاریوم، ترکیب جامعه گونه‌ها و میزان تجمع مایکوتوکسین‌ها در گیاهان زراعی تأثیر درخور توجهی دارد؛ به‌ویژه در بخش‌هایی از مزرعه که به‌طور مستقیم مجاور این گیاهان خودرو قرار دارند. این گیاهان به‌عنوان زیستگاه‌های مطلوب و مناسبی برای گونه‌های فوزاریوم شناخته می‌شوند و به‌طور گسترده در چشم‌اندازهای نیمه‌طبیعی، مانند گودال‌ها، پرچین‌ها و مرزهای بین مزارع، حضور دارند؛ ازاین‌رو، مطالعه علف‌های رشدیافته در مجاورت محصولات کشاورزی، به‌عنوان عوامل مؤثر در تعیین تنوع گونه‌ای و ساختار جوامع فوزاریوم ضروری و حیاتی است. در مطالعه‌ای که در شش منطقه مختلف برزیل انجام شد، جدایه‌های فوزاریوم از دانه‌های بدون علامت گیاهان خودرو ایزوله شدند. گونه‌های F. fujikuroi، F. incarnatum-equiseti، F. chlamydosporum شناسایی شدند که شامل پاتوژن‌های شناخته‌شدة گیاهی، گونه‌های مایکوتوکسین‌زا و اندوفیت‌ها هستند. همچنین در این بررسی، دو گونه جدید به نام‌های F. caapi و F. brachiariae شناسایی شدند (7). جدایه‌هایی از فوزاریوم از گیاهان علفی مهم کشاورزی در آفریقا و برزیل بازیابی شد و با استفاده از نشانگرهای مورفولوژیکی و تحلیل‌های فیلوژنتیکی سه گونه F. madaense، F. mirum و  F. andiyaziشناسایی شدند (8). مطالعه‌ای که در منطقه مانیتوبا و روی گیاهان خودرو انجام شد، به شناسایی گونه‌های Fusarium graminearum، F. equiseti، F. oxysporum، F. avenaceum، F. culmorum و F. poae منجر شد (9). تولید مایکوتوکسین توسط گونه‌های بازیابی‌شده از میزبان‌های غیرکشاورزی مانند گیاهان خودرو تاکنون به‌طور چشمگیر بررسی نشده است.

براساس نتایج حاصل از یک مطالعه، 12 گونه فوزاریوم از گیاهان خودرو در مناطق مختلف مالزی جداسازی و شناسایی شدند و تولید چهار مایکوتوکسین اصلی یعنی مونیلیفورمین (MON)، فومونیزین B1 (FB1)، زیرالنون (ZEN) و بایورسین (BEA) در گونه‌های جداسازی‌شده ارزیابی شدند (10).

در مطالعه‌ای که به‌منظور بررسی تنوع زیستی گونه‌های فوزاریوم مرتبط با گرامینه‌های وحشی صورت گرفت، با بهره‌گیری از داده‌های مورفولوژیکی و مولکولی، گونه‌های F. brachygibbosum، F. torulosum و F. cf. reticulatum var. negundis شناسایی شدند (11). همچنین به‌منظور تعیین جدایه‌های مولد فومونیزین در مجموعه گونه‌های Fusarium fujikuroi (FFSC)، مرتبط با سنبله‌های آلوده و پوسیدگی گرامینه‌های وحشی، استان کرمانشاه بررسی شد. براساس خصوصیات مورفولوژیکی و با استفاده از پرایمرهای اختصاصی سه گونه F. verticillioides، F. proliferatum و F. subglutinans شناسایی شدند (12).

طبق جست‌وجوهای انجام‌شده مطالعه­ای مبتنی بر گونه‌های فوزاریوم در گونه‌های علفی در غرب ایران منتشر نشده است و سؤالات بسیاری در این زمینه وجود دارد که از رایج­ترین سؤالات سازوکار اثر­بخشی گونه‌های جداشده فوزاریوم در تولید فومونیزین‌ها و زیرالنون است. براساس شواهد مذکور اهداف این مطالعه عبارت بودند از (i) ایجاد یک لیست قابل اعتماد با انجام یک مطالعه فیلوژنتیکی چند ژنی از گونه‌های فوزاریوم که در ارتباط با گیاهان خودرو در ایران یافت می‌شوند؛ (ii) تعیین اینکه آیا گونه‌های جداشده فوزاریوم توانایی ژنتیکی تولید فومونیزین‌ها و زیرالنول را دارند.

مواد و روش‌­ها

نمونه‌برداری و جداسازی

طی دو سال زراعی، از سال 2019 تا 2021، نمونه‌هایی از جدایه‌های فوزاریوم از برگ و ساقه­های گیاهان خودرو علامت‌دار و ظاهراً سالم جمع‌آوری شد. شکل ۱ موقعیت جغرافیایی مزارع گندم و جو بررسی‌شده در این پژوهش را در مناطق مختلف غرب ایران نشان می‌دهد. نمونه­ها برای جداسازی و خالص­سازی به آزمایشگاه منتقل شدند. مواد تکه‌تکه‌شده در دو مرحله ضدعفونی سطحی، هر بار به مدت یک دقیقه در الکل ۷۰ درصد قرار گرفتند. سپس با آب استریل، شسته و با استفاده از کاغذ صافی خشک شدند. در ادامه، طبق روش توصیف‌شده توسط Summerell and Leslie (2008) قطعات به‌طور دقیق روی محیط کشت اختصاصی PCNB-PPA کشت داده شدند. سپس در دمای ۲۵ درجه سانتی‌گراد به مدت ۷ روز انکوبه شدند تا رشد قارچ و جداسازی جدایه‌های فوزاریوم امکان‌پذیر شود (13).

شکل 1. مکان‌های مطالعه‌شده در سراسر غرب ایران روی نقشه نشان داده شده است.

Figure 1. Study sites across western Iran are shown on the map. The study sites are represented by colored circles originating from wheat and barley fields of wild oats.

شناسایی مورفولوژیکی

برای جداسازی تک‌اسپور و شناسایی مورفولوژیکی جدایه‌ها، از چهار محیط کشت شامل دکستروز آگار سیب‌زمینی (PDA)، ساکارز آگار سیب‌زمینی (PSA)، آگار برگ میخک (CLA) و واتر آگار (WA) استفاده شد. این محیط‌ها مطابق با روش‌های توصیف‌شده توسط سامر و لسلی، تهیه و به کار گرفته شدند (1). شناسایی اولیه جدایه‌های قارچی براساس ویژگی‌های ریخت‌شناسی ماکروسکوپی شامل رنگ و بافت پرگنه و ویژگی‌های میکروسکوپی نظیر نوع و ابعاد کنیدیوفورها، مشخصات سلول‌های کنیدیوم‌زا و شکل، رنگ و ابعاد کنیدیوم‌ها انجام شد. به‌منظور بررسی ویژگی‌های ریخت‌شناختی میکروسکوپی، از هریک از جدایه‌ها اسلایدهای میکروسکوپی در محلول اسیدلاکتیک 50 درصد و گلیسیرین، تهیه و شناسایی جدایه‌ها براساس منابع علمی معتبر انجام شد. برای بررسی دقیق ویژگی‌های میکروسکوپی، سویه‌ها روی محیط آگار برگ میخک، کشت و در دمای 1 ± 25 درجه سانتی‌گراد به مدت 7 روز در انکوباتور نگهداری شدند.

استخراج DNA ، PCR، تعیین توالی و آنالیزهای فیلوژنتیکی

در مجموع، ۲۰ جدایه نماینده از جنس فوزاریوم برای انجام تحلیل‌های مولکولی انتخاب شدند. این جدایه‌ها به مدت ۱۴ روز در دمای ۲۵ درجه سانتی­گراد، در بشرهای ۲۵۰ میلی‌لیتری حاوی محیط کشت دکستروز سیب‌زمینی (PDB) در شیکر انکوباتور کشت داده شدند. استخراج DNA ژنومی از نمونه‌های قارچی با بهره‌گیری از روش اصلاح‌شدة CTAB، مطابق با دستورالعمل ارائه‌شده توسط Guo et al (2000) انجام گرفت (14). در این پژوهش، به‌منظور تکثیر بخش‌هایی از DNA ژنومی، از جفت آغازگرهای EF1/EF2 و CL1/CL2A به‌ترتیب برای نواحی ژنی فاکتور طویل‌سازی ترجمه ۱-آلفا ( TEF1α) و کالمودولین استفاده شد. مشخصات آغازگرهای به‌کاررفته در این مطالعه در جدول ۱ ارائه شده است.

جدول 1. مشخصات آغازگرهای استفاده‌شده در واکنش زنجیره‌ای پلیمراز

Table 1. Characterization of primer pairs employed in the Polymerase Chain Reaction (PCR) assay.

PCR در حجم 25 میکرولیتر انجام شد. ترکیبات واکنش شامل، 5/12 میکرولیتر مسترمیکس 2 ایکس[1] (شرکت آمپلیکون)، 9 میکرولیتر آب مقطر فاقد نوکلئاز، 1 میکرولیتر از هریک از آغازگرهای پیشرو و معکوس و 1 میکرولیتر DNA الگو بود. واکنش­ها در دستگاه ترموسایکلر (Gradient Thermal cycler Bio Rad, USA) براساس برنامه‌های حرارتی اختصاصی هر آغازگر انجام گرفت (15, 16). محصولات PCR برای تعیین توالی نواحی تکثیرشده، از طریق شرکت توپاز به شرکت مایکروساینت (سوئیس) ارسال شدند. برای هر مکان ژنی تکثیرشده، توالی جدایه‌های فوزاریوم جداشده از گیاهان خودرو، با توالی‌های موجود در داده بانک ژن (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) مقایسه شدند و با توالی‌های با درصد مشابهت بالا با استفاده از الگوریتم کلاستال دبل یو هم‌تراز شدند. روابط فیلوژنتیکی با استفاده از روش مستر بیزی و حداکثر صرفه‌جویی در سایت سیپرس مطالعه شد. ظرفیت توکسین‌زایی گونه‌های F.equiseti و F. proliferatum به‌عنوان جدایه‌هایی با فراوانی بیشتر توسط آنالیز مطالعات مولکولی مبتنی بر واکنش زنجیره‌ای پلیمراز بررسی شد. این جدایه‌ها برای تولید فومونیزین B₁ و زیرالنون بررسی شدند. از جفت آغازگرهای اختصاصی PKS4F وPKS4R، FUM1F و FUM1R به‌ترتیب برای هدف قرار دادن ژن‌های مسیر سنتزPKS4  (زیرالنون) و FUM1 (فومونیزین) استفاده شد (جدول 2) (17). PCR در حجم 25 میکرولیتر شامل 5/12 میکرولیتر مستر میکس دو ایکس (شرکت آمپلیکون)، 9 میکرولیتر آب مقطر فاقد نوکلئاز، 1 میکرولیتر از هریک از آغازگرهای پیشرو و معکوس و 1 میکرولیتر DNA الگو در دستگاه ترموسایکلر (Gradient Thermal cycler Bio Rad, USA) انجام گرفت. برنامه حرارتی شامل واسرشت‌سازی اولیه در دمای 95 درجه سانتی‌گراد، 5 دقیقه، 35 چرخه شامل واسرشت‌سازی اولیه 94 درجه سانتی‌گراد،50 ثانیه، اتصال 56 درجه سانتی‌گراد، 50 ثانیه، بسط 56 درجه سانتی‌گراد، 50 ثانیه و بسط نهایی 72 درجه سانتی‌گراد، 1 دقیقه برای فومونیزین و واسرشت‌سازی اولیه در دمای 95 درجه سانتی‌گراد، 3 دقیقه، 35 چرخه شامل واسرشت‌سازی اولیه 94 درجه سانتی‌گراد،30 ثانیه، اتصال 60 درجه سانتی‌گراد، 30 ثانیه، بسط 72 درجه سانتی‌گراد، 30 ثانیه و بسط نهایی 72 درجه سانتی‌گراد، 7 دقیقه برای زیرالنول انجام شد (18).

جدول 2. مشخصات آغازگرهای مورد استفاده برای پتانسیل تولید فومونیزین و زیرالنون

Table 2. Characterization of primers utilized for assessing the potential of fumonisin and zearalenone production.

نتایج

نتایج جداسازی و شناسایی جدایه‌­ها

در مجموع 424 جدایه قارچی از گیاهان خودرو مزارع گندم و جو جمع آوری شد که از این تعداد 264 جدایه براساس داده‌های ریخت‌شناسی مربوط به جنس فوزاریوم بود. طبق شناسایی‌های مورفولوژیکی که براساس کلید شناسایی صورت گرفت (13). 20 جدایه به‌عنوان نماینده برای تجزیه و تحلیل‌های فیلوژنتیکی انتخاب شدند. مجموعه داده‌ها شامل توالی‌های DNA دو جایگاه ژنی (فاکتور طویل‌سازی ترجمه ۱-آلفا: 19 و کالمودولین: 20) از جدایه‌های انتخابی بود و Nectria. cinnabarina به‌عنوان گروه خارجی در تحلیل‌های فیلوژنتیکی استفاده شد. توالی‌های ژنی تک هم‌ترازشده به هم متصل شدند و تحت ماکسیمم پارسیمونی و مستربیزی قرار گرفتند. برای هر جدایه، یک توالی ژنی به هم پیوسته از 1662 موقعیت در نظر گرفته شد .از این تعداد، 873 کاراکتر ثابت، 163 کاراکتر متغیر و بدون اطلاعات مفید و 626 کاراکتر اطلاعات مفید بودند. تحلیل ماکسیمم پارسیمونی از 626 ویژگی اطلاعاتیِ باقی‌مانده، منجر به ایجاد درخت فیلوژنی با بیشترین صرفه‌جویی شد (1631=TL، 718/0=CI، 925/0=RI، 282/0=HI). تحلیل‌های بیزی حاصل از هم‌ردیفی‌های به‌هم‌پیوسته دو جایگاه، منجر به تولید 1402 درخت فیلوژنتیکی شد که از این تعداد، 350 درخت ابتدایی به‌عنوان درخت سوخته حذف شدند. درخت اجماع و مقادیر احتمال پسین (PP) از مجموع 1052 درخت باقیمانده حاصل از تحلیل بیزی محاسبه شدند. میانگین انحراف معیار فراوانی‌های تقسیم‌شده در پایان اجرای زنجیره برابر با 009961/0 بود که نشان‌دهندة همگرایی مناسب تحلیل است.

درخت‌ فیلوژنتیک ماکسیمم پارسیمونی روی درخت مستربیز، ترسیم و در شکل ۲ نمایش داده شده است. نتایج حاصل از این تحلیل‌ها امکان شناسایی و تفکیک ۹ گونه متمایز فوزاریوم را فراهم کرد که همگی با سطوح بالای پشتیبانی آماری تأیید شدند. مطابق با نتایج حاصل از مقایسه با سویه‌های مرجع، سه جدایه MK1، MK2 و MK3 همولوژی بسیار بالایی با سویه‌های مرجع F. solani نشان دادند و در تحلیل‌های فیلوژنتیکی در همان خوشه قرار گرفتند. جدایه‌های MK4 و MK5 در تحلیل فیلوژنتیکی با سویه مرجعF.proliferatum CBS 136.72  در یک خوشه قرار گرفتند. در شاخه مربوط به جدایه‌های مرجع F.oxysporum دو جدایه MK10 و MK11 قرار گرفتند. جدایه MK8 همولوژی بسیار نزدیک با جدایه مرجع F.avenaceum نشان داد. دو جدایه MK9 و MK20 به‌عنوان گونه‌های F.acuminatum شناخته شدند. جدایه‌های MK6 و MK7 با F.culmorum، MK14 و MK15 با F.brachygibbosum و MK12 وMK13  با سویه‌های مرجع F. incarnatum خوشه‌بندی شدند. جدایه‌های MK16 و MK17 ارتباط نزدیکی با جدایه‌های مرجع F. sciripi داشتند و درنهایت در شاخه مربوط به جدایه‌های مرجع F. equiseti دو جدایه MK18 و MK19 گروه‌بندی شدند. استان و مکان جداسازی این گونه‌ها در جدول 3 ذکر شده‌اند.

شکل 2. درخت فیلوژنتیک رسم‌شده به روش حداکثر صرفه‌جویی که از تجزیه و تحلیل داده‌های ترکیبی توالی CAL1 و TEF1 به دست آمده است. مقادیر پشتیبانی بوت‌استرپ MP/BI در گره‌ها نشان داده شده‌اند. درخت فیلوژنتیک با Nectria. cinnabarina CBS 189987 ریشه‌یابی شده است.

Figure 2. The phylogenetic tree drawn by the maximum parsimony method, obtained from the combined analysis of CAL1 and TEF1 sequence data. Bootstrap support values MP/BI at the nodes are indicated. The phylogenetic tree was rooted with Nectria cinnabarina CBS 189987.

نتایج تیپ‌های شیمیایی گونه‌های کمپلکس F. proliferatum و F.equiseti

نتایج واکنش‌های PCR با آغازگرهای اختصاصی فومونیزین‌ها و زیرالنون‌ها نشان دادند تیپ‌های شیمایی FUM1 در بین جمعیت گونه‌های کمپلکس F. proliferatum و ZEA در گونه‌های کمپلکس F. equiseti وجود دارد. واکنش‌های زنجیره‌ای پلیمراز با آغازگرهای FUM1R و FUM1F نشان داد 12 جدایه از 24 جدایه شناسایی‌شده به‌عنوان F. proliferatum (50 درصد) تولید قطعات183 جفت‌بازی می‌کنند و به‌عنوان تولیدکنندگان بالقوه فومونیزین شناسایی شدند (شکل 3). واکنش زنجیره‌ای پلیمراز در جدایه‌های F. equiseti با آغازگرهای PKS4R و PKS4F نشان داد 8 جدایه از 25 جدایه شناسایی‌شده به‌عنوان F. equiseti (32 درصد) تولید قطعات 753 جفت‌بازی می‌کنند و به‌عنوان جدایه‌های تولیدکنندة تیپ شیمیایی زیرالنون (ZEA) شناخته شدند (شکل 4). بیشترین میزان جدایه‌های تولیدکنندة فومونیزین در مناطق کرمانشاه (58 درصد) و همدان (41 درصد) مشاهده شد (جدول 4). فراوانی تولید زیرالنون در جدایه‌هایی مشاهده شد که از کرمانشاه (62 درصد) و لرستان (38 درصد) جداسازی و شناسایی شدند.

شکل 3. تشخیص PCR جدایه‌های تولیدکنندة فومونیزین با استفاده از جفت آغازگرهای FUM1F/FUM1R.

Figure 3. PCR-based identification of fumonisin-producing isolates with FUM1F/FUM1R primers

شکل 4. تشخیص PCR جدایه‌های تولیدکنندة زیرالنول با استفاده از جفت آغازگرهای PKS4F/PKS4R.

Figure 4. PCR-based identification of zearalenone-producing isolates with PKS4F/PKS4R primers.

جدول 3. مشخصات نمونه‌های بررسی‌شده در مطالعات فایلوژنتیکی

Table 3. Characteristics of the examined samples in phylogenetic studies assay.

جدول 4. مناطق نمونه‌برداری‌شده مرتبط با جدایه‌های F. proliferatum  و F. equiseti

Table 3. Characteristics of sampling regions for F. proliferatum and F. equiseti isolates.

بحث

در مطالعه حاضر، تنوع گونه‌ای قابل توجهی از جنس فوزاریوم از گیاهان خودروی مزارع گندم و جو در غرب ایران، با رویکرد ترکیبی مورفولوژیکی و مولکولی شناسایی شد. استفاده از توالی‌یابی دو جایگاه ژنی فاکتور طویل‌سازی ترجمه ۱-آلفا (TEF-1α) و کالمودولین (CaM) در کنار تحلیل‌های فیلوژنتیکی مبتنی بر روش‌های حداکثر صرفه‌جویی و بیزی، امکان شناسایی دقیق و معتبر گونه‌ها را فراهم آورد. این تطابق قوی بین نتایج مولکولی و شناسایی‌های مورفولوژیکی که براساس کلیدهای استاندارد صورت گرفت، اعتبار یافته‌های ما را به خوبی تأیید می‌کند. یافته‌های این تحقیق مبنی بر تنوع گسترده گونه‌های فوزاریوم در گیاهان خودرو، با گزارش‌های پیشین از سایر نواحی ایران و جهان همسو است (17، 18)؛ برای مثال، در مطالعه‌ای مشابه که توسط Postic  et al (2012) در مانیتوبای جنوبی کانادا روی گل‌آذین گندمیان وحشی انجام شد، هفت گونه فوزاریوم شامل F. graminearum، F. sporotrichoides، F. equiseti، F. oxysporum، F. avenaceum، F. culmorum و F. poae جداسازی شدند که F. graminearum به‌عنوان گونه غالب گزارش شد (19). همچنین، اینچ و گیلبرت در کرواسی، 14 گونه فوزاریوم را از گونه‌های مختلف علف هرز جداسازی کردند که بیشترین فراوانی مربوط به F. graminearum، F. subglutinans، F. oxysporum و F. proliferatum بود. این مقایسه‌ها نشان‌دهندة همگرایی در تنوع گونه‌ای فوزاریوم در گیاهان خودروی مناطق مختلف جغرافیایی است که اهمیت آنها را به‌عنوان میزبان‌های جایگزین این قارچ‌ها برجسته می‌کند. در ایران نیز تحقیقات اندکی روی گونه‌های فوزاریوم مرتبط با گیاهان خودرو صورت گرفته است. داوری و همکاران با استفاده از مطالعات ریخت‌شناختی و توالی‌یابی TEF-1α، 15 گونه فوزاریوم را از گل‌آذین گیاهان وحشی در استان اردبیل شناسایی و گزارش کردند که این امر نیاز به مطالعات بیشتر در این زمینه را در کشور نشان می‌دهد. در مطالعه حاضر، 10 گونه از جنس فوزاریوم شامل F. solani، F. proliferatum، F. avenaceum، F. oxysporum، F. acuminatum، F. culmorum، F. brachygibbosum، F. incarnatum، F. scirpi و F. equiseti از گیاهان علفی همجوار با مزارع زراعی در چهار استان غربی ایران شناسایی شدند. این گیاهان علفی می‌توانند به‌عنوان مخازن مهمی

برای بقا و انتشار عوامل بیماری‌زای فوزاریوم در اکوسیستم‌های کشاورزی عمل کنند. تحلیل فراوانی نسبی گونه‌ها نشان داد F. equiseti و F. proliferatum به‌ترتیب به‌عنوان غالب‌ترین گونه‌ها در مناطق بررسی‌شده شناخته شدند. این یافته‌ها نه‌تنها اطلاعات ارزشمندی دربارة الگوهای پراکنش این قارچ‌ها در منطقه ارائه می‌دهند؛ بلکه بر اهمیت شناسایی دقیق گونه‌ای برای درک بهتر دینامیک جمعیت‌های فوزاریوم و پتانسیل بیماری‌زایی آنها تأکید می‌ورزند. حضور این گونه‌ها، به‌ویژه گونه‌های غالب، حاکی از سازگاری بالای آنها با شرایط محیطی منطقه و پتانسیل بالای آنها برای گسترش است. با توجه به توانایی بسیاری از گونه‌های فوزاریوم در تولید طیف وسیعی از مایکوتوکسین‌ها و از آنجایی که گیاهان علفی گرامینه بخش قابل توجهی از خوراک دام در ایران را تشکیل می‌دهند، بررسی تیپ‌های شیمیایی این قارچ‌ها از اهمیت بالایی برخوردار است. تعیین پروفایل مایکوتوکسینی گونه‌های شناسایی‌شده، به‌ویژه گونه‌های غالب، می‌تواند به ارزیابی دقیق‌تر خطرات بالقوه برای سلامت دام‌ها کمک شایانی کند. در این راستا، تشخیص ژن FUM1 که مسئول بیوسنتز فومونیزین است، در 50 درصد از جدایه‌های F. proliferatum نشان‌دهندة پتانسیل بالای این گونه برای تولید این توکسین‌های مهم قارچی است. همچنین، شناسایی ژن‌های PKS4 مرتبط با تولید زیرالنون در 32 درصد از جدایه‌های F. equiseti، بر اهمیت این گونه‌ها به‌عنوان منابع بالقوه آلاینده‌های زیستی در محصولات کشاورزی دلالت دارد. این سموم، علاوه بر تأثیر مستقیم بر سلامت گیاه، به‌دلیل سمیت بالا می‌توانند خطرات جدی برای سلامت انسان و دام ایجاد کنند. فراوانی بالای جدایه‌های تولیدکنندة فومونیزین در مناطق کرمانشاه و همدان و همچنین تولیدکنندگان زیرالنون در کرمانشاه و لرستان، بیان‌کنندة نیاز به انجام نظارت مستمر و انجام مطالعات جامع‌تر در این مناطق برای ارزیابی دقیق‌تر ریسک سلامت عمومی است.

درنهایت، پیشنهاد می‌شود مطالعات آتی بر بررسی عوامل محیطی مؤثر بر توکسین‌زایی و پراکنش گونه‌ها تمرکز کنند. علاوه بر این، بررسی توان بالقوه گونه‌های فوزاریوم در تولید توکسین‌های دیگر و اثرات ترکیبی (هم‌افزایی یا آنتاگونیستی) آنها می‌تواند به درک بهتر خطرات و پیامدهای اکولوژیکی کمک کند. همچنین، استفاده از روش‌های پیشرفته‌تر توالی‌یابی، مانند متاژنومیکس یا توالی‌یابی در مقیاس وسیع (NGS) و تحلیل‌های جمعیت‌شناسی مولکولی می‌تواند عمق بیشتری به شناخت ساختار جمعیت‌های این قارچ‌ها و الگوهای تکاملی آنها بدهد.

 نتیجه­‌گیری

این پژوهش به شناسایی و بررسی تنوع گونه‌های جنس فوزاریوم در مزارع گندم و جو غرب ایران با استفاده از روش‌های ترکیبی مورفولوژیکی و مولکولی توالی‌یابی ژن‌های فاکتور طویل‌سازی ترجمه ۱-آلفا و کالمادولین پرداخت. هدف اصلی، ارزیابی تنوع گونه‌ای فوزاریوم و تعیین پتانسیل تولید مایکوتوکسین‌ها توسط این قارچ‌ها در منطقه مورد مطالعه بود. نتایج این تحقیق می‌تواند در کاهش خطرات ناشی از آلودگی مایکوتوکسینی در محصولات کشاورزی منطقه مؤثر باشد.

2 master mix 2X