بهبود ویژگی‌های رشد و فیزیولوژیکی گوجه‌فرنگی (Solanum lycopersicum L.) با بهینه‌سازی غلظت نانو ذرات اکسیدآهن (Fe₃O₄ NPs) در محلول‌پاشی برگی

مقدمه

استفاده از فناوری نوین نانوتکنولوژی در حوزه کشاورزی، رویکردی هدفمند برای بهبود رشد و افزایش تولید محصولات در کنار حفظ سلامت خاک محسوب می‌شود (Usman et al., 2020). نانوذرات به این علّت که راه­حل‌های جدیدی برای چالش‌های دیرینه در کشاورزی ارائه می‌دهند، امروزه توجه بسیاری از پژوهشگران را به خود جلب کرده اند (Feng et al., 2022; Raiesi-Ardali et al., 2022; Rani et al., 2022). اثرات مثبت نانو ذرات بر روی گیاهان به اندازه کوچک، نسبت سطح به حجم بالا و وضعیت الکترونی خاص مرتبط است که منجر به حلالیت و واکنش پذیری بالای آنها می‌شود و این امر برهم­کنش موثر آنها با غشاءها و سایر اجزای سلولی را تعیین می‌کند (Djanaguiraman et al., 2024). این ویژگی­های نانو ذرات سبب کاربرد موفق آنها در صنایع مختلف از جمله کشاورزی شده است (Djanaguiraman et al., 2024). یکی از مهم‌ترین کاربردها، استفاده از نانو ذرات جهت تغذیه گیاهان است که باعث کاهش مصرف مواد شیمیایی، حداقل هدررفت مواد و افزایش رشد و عملکرد گیاهان می­شوند (Arora et al., 2022). استفاده از نانو ذرات، عناصر غذایی به روشی کنترل شده آنها را در خاک آزاد می‌کند و همچنین خطرات زیست محیطی کودهای شیمیایی مختلف را کاهش می‌دهد (Beig et al., 2022). در سال­های اخیر، نانو ذرات اکسید­آهن توجه زیادی را به خود جلب کرده‌اند و به طور گسترده در زمینه‌های مختلف علمی مورد استفاده قرار گرفته‌اند (Góral et al., 2023). در میان انواع مختلف نانو ذرات اکسید­آهن، Fe₃O₄ NPs با موفقیت در کاربردهای مختلف زیستی مورد استفاده قرار گرفته است و اخیراً نیز اهمیت خود را در علوم گیاهی و کشاورزی گسترش داده است. Fe₃O₄ NPs سمّیت کم و پایداری بالایی از خود نشان می‌دهند و پژوهشگران آن­ها را در دسته زیست­تخریب­پذیر به‌حساب می‌آورند (Góral et al., 2023). آهن به­علّت خواص اکسیداسیون احیا نقش مهمی در مسیرهای مختلف فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی مانند سنتز DNA، RNA، تنفس و فتوسنتز ایفا می‌کنند و برای طیف گسترده‌ای از عملکردهای زیستی مورد نیاز است (El-Desouky et al., 2021). این عنصر، یک ماده ضروری و محدود کننده اصلی برای رشد و متابولیسم گیاه است و بخش قابل توجهی از آن در کلروپلاست وجود دارد (Khan et al., 2020). بنابراین جای تعجب نیست که کمبود آن سبب تغییراتی در ساختمان و عملکرد دستگاه فتوسنتزی گیاهان عالی ‌شود (Khan et al., 2020). عدم تعادل بین دسترسی به آهن در خاک و تقاضای آن توسط گیاه از علل اصلی کلروز در گیاهان است (Sagwal et al., 2023). آهن با وجود اینکه در اکثر خاک‌ها به وفور یافت می‌شود، امّا بخش عمده‌ای از آن به صورت نامحلول در خاک وجود دارد که برای گیاهان قابل جذب نیست (Sagwal et al., 2023). کمبودآهن در بسیاری از گیاهان نظیر گوجه­فرنگی وجود دارد (Raiesi-Ardali et al., 2022). برای کاهش کمبود آهن به‌طور مرسوم از کودهای شیمیایی آهن استفاده می‌شود (Pasricha et al., 2021). با این وجود، به علّت کارایی پائین جذب مواد مغذی، این روش کارآمد نیست و لازم است که راهکارهای نوینی با توجیه اقتصادی و سازگار با محیط زیست ارائه شود و استفاده از نانوذرات آهن راهکاری‌ مناسب برای مقابله با کمبود آن محسوب می شود (Raiesi-Ardali et al., 2022). گزارش‌های متعددی نشان می‌دهند که نانو ذرات نسبت به همتایان توده‌ای (Bulk Counterparts) یا یونی خود موثرتر عمل می‌کنند (Rai et al., 2022; Tavallali, 2018). در سویا نانو ذرات آهن در مقایسه با سولفات آهن و Fe-EDTA منجر به افزایش محتوای کلروفیل، درصد جوانه­زنی، فعالیت CAT و SOD شد (Yang et al., 2020). در Citrus maxima تیمار برگی نانوذرات γ-Fe₂O₃، در مقایسه با Fe(II)-EDTA، تأثیر مثبت بیشتری بر فاکتورهای رشدی، جذب آهن و فعالیت آنزیم‌های SOD و CAT داشت و همچنین موجب کاهش قابل توجه‌تری در سطح MDA  شد (Hu et al., 2017). نانو ذرات آهن بسیار کوچکتر از اکسید آهن معمولی یا مولکول‌های آهن هستند (Rai et al., 2022). آن­ها می‌توانند کمپلکس‌های بیشتری با مولکول‌های مختلف ایجاد کنند و آهن بیشتری برای اندام‌های گیاهی فراهم آورند (Yang et al., 2020). علاوه بر آن نانو ذرات آهن معمولاً به‌تدریج جذب می‌شوند، در حالی که اشکال یونی آنها بلافاصله در واکنش‌های مختلف شیمیایی وارد می‌شوند (Rai et al., 2022). از سوی دیگر، با توجه به تبدیل سریع آهن به اشکال غیر قابل دسترسی گیاهی، تیمار ریشه­ای آهن در خاک‌های دارای کمبود آهن معمولاً بی‌اثر است و محلول­پاشی برگی می‌تواند به عنوان یک روش نسبتاً نوین در گیاهان برای رفع سریع کمبودها اهمیت زیادی داشته باشد (Cao et al., 2022). تیمار برگی نانوآهن در Brassica juncea سبب کاهش نشت الکترونی، محتوای MDA، پرولین و H₂O₂ و افزایش محتوای کلروفیل، فعالیت APX، CAT و GPX شد (Praveen et al., 2018). تیمار برگی Fe₃O₄ NPs در Triticum aestivum نیز سبب افزایش طول و وزن تر اندام هوایی و ریشه، محتوای کلروفیل، عناصر غذایی ضروری و فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدانی SOD، APX و GPX شد (Feng et al., 2022). همچنین نانوآهن منجر به افزایش فاکتورهای رشدی در گیاه Stevia rebaudiana شد (Khan et al., 2020). نانو آهن در مقایسه با کلات آهن، سبب افزایش محتوای نیتروژن، فسفر، پتاسیم، آهن، روی و منگنز در  Cayenne pepperشد (Alkarawi et al., 2024). نانو ذرات آهن بر محتوی گاما-آمینوبوتیریک اسید (GABA; Gamma-Amino Butyric Acid) نیز اثر می­گذارند. گلوتامات، آمینواسیدی محوری در متابولیسم گیاهان، پیش‌ساز برای سنتز پروتئین‌ها، آلکالوئیدها و مولکول‌های تتراپیرولی نظیر کلروفیل و همچنین GABA است (Qiu et al., 2020). در شرایط غیر تنش، گیاه تلاش می‌کند تا بخش عمده‌ای از گلوتامات را به سمت مسیرهای آنابولیکی هدایت کند که مستقیماً منجر به رشد، فتوسنتز و انباشت زیست‌توده می‌شوند؛ به جای اینکه آن را صرف تولید متابولیت‌های دفاعی همانند  GABAکند (Asgari-Ravandi et al., 2025). با توجه به نقش نانو ذرات آهن در ارتقای کارایی فتوسنتزی و افزایش جذب آهن (به عنوان یک ریزمغذی ضروری برای سنتز کلروفیل)، بررسی تأثیر آن‌ها بر محتوی کلروفیل و GABA از اهمیت ویژه­ای برخوردار است.

گوجه‌فرنگی به‌عنوان یکی از اساسی‌ترین محصولات کشاورزی در سراسر جهان از جایگاه برجسته­ای در تغذیه انسانی برخوردار است (Collins et al., 2022). عوامل مختلفی مانند کمبود عناصر غذایی یا انواع تنش‌ها، تولید این محصول را تحت تأثیر قرار می‌دهند (Kaboré et al., 2022). استفاده از نانو ذرات آهن به عنوان یک راه حل نوآورانه می­تواند نقش کلیدی در بهبود رشد و به دست آوردن محصولاتی با کیفیت بالاتر ایفا کند (El-Desouky et al., 2021). اما کاربرد این نانو ذرات در بخش کشاورزی، علی‌رغم تمامی فواید بالقوه آن، هنوز نسبتاً محدود است و پژوهش‌های اندکی درباره اثرات نانو ذراتFe₃O₄  (Fe₃O₄ NPs) بر بهبود رشد گیاهان، به‌ویژه توسط محلول‌پاشی برگی، انجام شده است. بنابراین در این پژوهش، اثر تیمار برگی Fe₃O₄ NPs بر برخی صفات زیخت شناسی، فیزیولوژیکی و آنزیمی در گوجه­فرنگی مورد بررسی قرار گرفت. هدف از این پژوهش، درک بهتر عملکرد این نانو ذرات و تعیین غلظت بهینه آن در گوجه فرنگی است.

مواد و روش­ها

شرایط رشد گیاه و اعمال تیمارها

 بذرهای گوجه­فرنگی (cv. Calj-N3) تهیه شده از شرکت گلس گاردن (Glass Garden)، ابتدا توسط محلول هیپوکلریت سدیم 1/0 درصد برای ۱۵ دقیقه استریل شدند. پس از شستشو با آب مقطر دو بار تقطیر، بذرها روی کاغذ صافی درون پتری دیش کشت شدند. سه روز پس از جوانه­زنی به گلدان­هایی با بستر پرلیت منتقل شدند و آبیاری و تغذیه آن­ها با محلول غذایی هوگلند (Hoagland & Arnon, 1950) با نصف غلظت (1/0±7/5=pH) انجام شد. شرایط رشد در گلخانه شامل ۱۶ ساعت روشنایی و ۸ ساعت تاریکی، دمای 25 درجه سانتی­گراد در روز و ۲۰ درجه سانتی­گراد در شب و رطوبت نسبی 70 درصد بود. برای سنتز Fe₃O₄ NPs در محیط نیتروژن مایع، از کلرید آهن سه ظرفیتی شش آب (6/4 گرم، 017/0 مولار) و کلرید آهن دو ظرفیتی چهار آب (2/2 گرم، 011/0 مولار) استفاده شد که در 100 میلی‌لیتر آب دیونیزه در دمای 60 درجه سانتی­گراد حل شدند، سپس 10 میلی‌لیتر NH₄OH 25درصد به مخلوط اضافه شد و واکنش به مدت 60 دقیقه ادامه یافت و پس از سرد شدن مخلوط به دمای اتاق، نانو ذرات تولیدی تحت جداسازی مغناطیسی خارجی (آهنربا) قرار گرفتند و سپس چندین بار با آب مقطر دیونیزه شسته شدند. محصول نهایی در دمای محیط خشک شد. حضور نانو ذرات توسط تکنیک XRD (شکل A1) بررسی شد و اندازه و شکل آن­ها با کمک میکروسکوپ الکترونی SEM مورد ارزیابی قرار گرفت (Rostami et al., 2018). تصویر میکروسکوپ الکترونی SEM به وضوح اندازه نانو ذرات را در بازه 56/24 تا 04/53 نانومتر نمایش داد (شکل B1). Fe₃O₄ NPs در غلظت­های 0، 25، 50 و 100 میلی­گرم در لیتر آماده شدند و به مدت ۴۵ دقیقه اولتراسونیک شدند و بلافاصله به­صورت محلول­پاشی روزانه و به مدت 4 روز روی گیاهان در مرحله 4 برگی استفاده شد. یک هفته پس از اتمام تیمار، اندام هوایی و ریشه­ها جدا شده و بلافاصله در نیتروژن مایع منجمد و در دمای ۸۰- درجه سانتی­گراد برای آزمایش­های بعدی نگهداری شدند.

بررسی برخی ویژگی­های بیوشیمیایی

برای سنجش رنگدانه­های فتوسنتزی، 200 میلی­گرم از بافت برگ­ در 15 میلی­لیتر استون 80 درصد آسیاب و سپس سانتریفیوژ شد (Lichtenthaler, 1987). جذب عصاره در طول موج­های 470، 646 و 663 نانومتر توسط اسپکتروفتومتر (مدل 1700، شرکت Shimadzu، Japan) اندازه­گیری شد. جهت سنجش محتوای مالون دآلدئید (MDA) و سایر آلدئیدها، ابتدا 2/0 گرم از بافت منجمد شده با 5 میلی­لیتر تری کلرواستیک اسید (TCA) 1/0 درصد آسیاب شد. عصاره به­دست آمده به مدت 5 دقیقه درg  10000 سانتریفیوژ شدند. به یک میلی­لیتر از محلول رویی 4 میلی­لیتر تری­کلرواستیک اسید (TCA) 20 درصد که حاوی 5/0 درصد تیوباربیوتیک اسید  (TBA)بود اضافه شد. این مخلوط به مدت 30 دقیقه در دمای 95 درجه سانتی­گراد گرم شد، سپس فوراً سرد و مجدد سانتریفیوژ شد. میزان جذب در طول موج 455، 532 و 600 نانومتر خوانده شد. برای اندازه­گیری محتوای MDA از ضریب خاموشی معادل Mm^-1cm^-1 155 و برای سایر آلدئیدها از Mm^-1cm^-1 10⁵×457/0 استفاده شد و نتایج بر حسب نانومول بر گرم وزن تر ارائه شد (Heath & Packer, 1968). جهت تعیین محتوای پراکسید هیدروژن، 500 میلی­گرم از بافت گیاهی در تری کلرواستیک اسید 1/0 درصد سائیده شد و عصاره حاصل در سانتریفیوژ یخچال­دار (مدل Eppendorf Centrifuge 5804، Germany) به مدّت 15 دقیقه سانتریفیوژ شد. سپس 5/0 میلی­لیتر از محلول رویی، 5/0 میلی­لیتر بافر پتاسیم فسفات 10 میلی­مولار و 1 میلی­لیتر یدید پتاسیم 1 مولار ترکیب شدند و جذب محلول­ها در طول موج 390 نانومتر اندازه­گیری شد. مقدار پراکسید هیدروژن موجود توسط ضریب خاموشی M^-1cm^-1 28/0 محاسبه و نتایج به­صورت میکرومول بر گرم وزن تر ارائه شد (Velikova et al., 2000).

تعیین محتوای گاما آمینو بوتریک اسید

برای تعیین محتوای GABA توسط HPLC (مدلAgilent 1100، استرالیا) 5/0گرم نمونه‌ با 1میلی‌لیتر محلول آب: کلروفرم: متانول (به نسبت 12:5:3) سائیده شد و به مدت 2 دقیقه در  g10000 در ˚C4 سانتریفوژ شد. روشناور جمع‌آوری و خشک شد و دوباره در 100 میکرولیتر آب حل شد و سپس با 150 میکرولیتر بافر بوراکس (8pH=) و 250 میکرولیتر از معرف مشتق‌سازی هیدروکسی‌نفتالدئید (3/0 درصد  w/vدر متانول) مخلوط شد. مخلوط در یک حمام آب به مدت 20 دقیقه در ˚C80 گرم و سپس در دمای اتاق سرد شد. حجم نهایی محلول با متانول به 1 میلی‌لیتر رسید و سپس توسط فیلتر 45/0 میکرومتری قبل از تزریق به ستون HPLC (Zorbax Eclipse XDB-C18; 150 × 4.6 mm, 5 µm) فیلتر شد. حجم تزریق نمونه 20 میکرولیتر، سرعت جریان 5/0 میلی‌لیتر در دقیقه و فاز متحرک متانول: آب (38:62 V/V) بود و تشخیص توسط آشکارساز UV در 330‌ نانومتر انجام شد. زمان نگهداری برای GABA، 12 دقیقه و مجموع مدت زمان شستشو20 دقیقه بود. کمی‌سازی با منحنی استاندارد به‌دست آمده توسط مساحت سطح زیر پیک غلظت‌های مختلف GABA به عنوان نمونه استاندارد انجام شد (Baum et al., 1996).

تهیه عصاره برای سنجش محتوی پروتئین و فعالیت آنزیمی

برای استخراج پروتئین­ها و بررسی فعالیت آنزیم­ها از بافت­های گیاهی عصاره­ای تهیه شد. در این فرایند از بافر فسفات پتاسیم به غلظت 50 میلی­مولار (7=pH) استفاده شد. به این محلول، 1 میلی­مولار Phenyl Methane Sulfonyl Fluoride (PMSF)، 1 میلی­مولار Sodium Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (Na₂EDTA)و 1 درصد جرمی/ حجمی Poly Vinyl Pyrrolidone (PVP) افزوده شد. نمونه­ها پس از همگن­سازی و سانتریفیوژ در دمای ۴ درجه سانتی­گراد، برای اندازه­گیری محتوای پروتئین و فعالیت آنزیمی آماده شدند. برای سنجش محتوای پروتئین، 1/0 میلی­لیتر از عصاره فوق با 5 میلی­لیتر معرف بیوره مخلوط و سریعا ورتکس شد (Bradford, 1976). تمام اندازه­گیری­ها توسط اسپکتروفتومتر و در حجم نهایی 3 میلی­لیتر انجام شد.

فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز (SOD) (EC: 1.15.1.1)

فعالیت این آنزیم از روش اندازه­گیری درصد ممانعت از احیای نیتروبلوتترازولیوم (NBT) به دی فورمازان تعیین شد. برای این کار مخلوط واکنش شامل بافر فسفات 50 میلی­مولار (7=pH)، NBT (Nitro Blue Tetrazolium) به غلظت 075/0 میکرولار، Na-EDTA 1/0 میلی­مولار، ریبوفلاوین 75 میکرومولار، متیونین 13 میلی­مولار و 50 میکرولیتر عصاره آنزیمی بود. این مخلوط به مدت 8 دقیقه در نور قرار گرفت و سپس جذب در طول موج 560 نانومتر اندازه­گیری شد. یک واحد آنزیمی SOD به مقدار آنزیمی اطلاق می­شود که بتواند 50 درصد از احیای  NBTرا در مقایسه با نمونه­های شاهد جلوگیری کند (Giannopolitis & Ries, 1977).

فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز (APX) EC: 1.11.1.1)

برای سنجش فعالیت این آنزیم کاهش جذب در طول موج 290 نانومتر به علّت اکسیداسیون ASC مورد بررسی قرار گرفت. مخلوط واکنش شامل پتاسیم فسفات ۵۰ میلی­مولار (7=pH)، EDTA 1/0 میلی­مولار، پراکسید هیدروژن 15/0 میلی­مولار، آسکوربات 5/0 میلی­مولار و 15/0 میلی­لیتر عصاره آنزیمی بود. یک واحد فعالیت APX به مقدار آنزیمی اطلاق می­شود که بتواند یک میلی­مولار ASC را در یک دقیقه تجزیه ­کند (Nakano & Asada, 1981).

فعالیت آنزیم کاتالاز (CAT) (EC: 1.11.1.6 )

فعالیت این آنزیم با اندازه­گیری سرعت تجزیه پراکسید هیدروژن در طول موج 240 نانومتر سنجیده شد. مخلوط واکنش در حجم 3 میلی­لیتر شامل 870/2 میلی­لیتر بافر فسفات 50 میلی­مولار (7=pH) و 30 میکرولیتر پراکسید هیدروژن به غلظت 5/1 مولار بود. با اضافه کردن 100 میکرولیتر عصاره آنزیمی واکنش آنزیمی آغاز شد (Dhindsa et al., 1981).

تجزیه و تحلیل عناصر توسط طیف سنجی نشر پلاسمای جفت شده القایی (ICP-MS; Coupled Plasma Mass Spectrometry)

برای سنجش عناصر پتاسیم (k)، کلسیم (Ca)، منیزیم (Mg)،آهن (Fe)، منگنز (Mn)،روی (Zn) و مس (Cu) از روش Sagner et al. (1998) استفاده شد. نمونه­ها، به مدت ۷۲ ساعت در دمای ۷۰ درجه سانتی­گراد در آون خشک شدند. 5/0 گرم از بافت گیاهی در ۱۰ میلی­لیتر اسید نیتریک غلیظ ۶۵ درصد وزنی/ حجمی حل و به مدت ۲۴ ساعت هضم شدند. این مخلوط سپس روی هیتر قرار گرفت تا به صورت تقریبی اما نه کامل خشک شود. پس از سرد شدن، حجم هر نمونه با استفاده از آب دو بار تقطیر به ۵۰ میلی­لیتر رسانده شد. همچنین غلظت تمام عناصر توسط  ICP-MSاندازه‌گیری شد. پایداری دستگاه به­طور منظم با استاندارد داخلی بررسی شد و از بلانک‌های معرف برای شناسایی آلودگی احتمالی استفاده شد (Sagner et al., 1998).

تجزیه و تحلیل آماری

تمامی آزمایش‌ها در سه تکرار انجام شد و نتایج به صورت میانگین±  SD (Standard Deviation) ارائه شدند. تفاوت‌های آماری توسط نرم‌افزار SPSS 20.0 و تحلیل واریانس دوطرفه (Two Way ANOVA) و سپس آزمون چند دامنه­ای دانکن ارزیابی شد. P≤0.05 برای نشان دادن تفاوت‌های معنی‌داری در نظر گرفته شد.

نتایج

صفات ریخت‌شناسی و رنگدانه‌های فتوسنتزی

شکل‌های 2 و 3 نشان دادند Fe₃O₄ NPs اثر معنی­داری بر وزن خشک و طول اندام هوایی و ریشه گیاه گوجه فرنگی داشت. غلظت ۲۵ میلی­گرم در لیتر Fe₃O₄ NPs بیشترین افزایش در میزان وزن خشک و طول گیاه گوجه فرنگی را نشان داد. در غلظت 50 میلی­گرم در لیتر Fe₃O₄ NPs نیز این افزایش مشاهده شد، امّا غلظت ۱۰۰ میلی‌گرم بر لیتر اثر منفی بر این صفات داشت که نشان می‌دهد این غلظت برای گیاه سمی بوده است. همچنین شکل 4 نشان داد محلول­پاشی نانو ذرات آهن میزان رنگیزه‌های فتوسنتزی را نسبت به شاهد به­طور معنی­داری افزایش داد. در غلظت ۲۵ میلی­گرم در لیتر بیشترین میزان کلروفیل a، b، کل و کارتنوئید وجود داشت که به ترتیب سبب افزایش 3/55، 4/39، 8/50 و 5/87 درصد نسبت به شاهد شد، امّا غلظت 100 میلی گرم در لیتر نانو آهن منجر به کاهش محتوای رنگیزه­های فتوسنتزی نسبت به شاهد شد.

شکل 1- ویژگی­های Fe₃O₄ NPs توسط تکنیک­های  (A) XRDو (B) SEM

Figure 1- Properties of Fe₃O₄ NPs by techniques XRD pattern (A) and SEM micrograph (B).

شکل 2- اثر غلظت­های مختلف Fe₃O₄ NPs بر وزن خشک اندام هوایی و ریشه در گوجه­فرنگی. مقادیر، میانگین 3 تکرار ± SD است. حروف یکسان، بیانگر عدم اختلاف معنی­دار در سطح P < 0.05 با استفاده از آزمون دانکن است.

Figure 2- Effects of different concentrations of Fe₃O₄ NPs on shoot dry Weight in tomato. Values are mean ± SD of 3 replicates. Mean values followed by similar letters did not differ significantly (P < 0.05) when determined by the Duncan test.

شکل 3- اثر غلظت­های مختلف Fe₃O₄ NPs بر طول اندام هوایی و ریشه در گوجه­فرنگی. مقادیر، میانگین 3 تکرار ± SD است. حروف یکسان، بیانگر عدم اختلاف معنی­دار در سطح P < 0.05 با استفاده از آزمون دانکن است.

Figure 3- Effects of different concentrations of Fe₃O₄ NPs on shoot and root length in tomato. Values are mean ± SD of 3 replicates. Mean values followed by similar letters did not differ significantly (P < 0.05) when determined by the Duncan test.

شکل 4- اثر غلظت­های مختلف Fe₃O₄ NPs بر کلروفیل a، b، کل و کارتنوئید در گوجه­فرنگی. مقادیر، میانگین 3 تکرار ± SD است. حروف یکسان، بیانگر عدم اختلاف معنی­دار در سطح P < 0.05 با استفاده از آزمون دانکن است.

Figure 4- Effects of different concentrations of Fe₃O₄ NPs on Chla, Chlb, Chlt, and Car in tomato. Values are mean ± SD of 3 replicates. Mean values followed by similar letters did not differ significantly (P < 0.05) when determined by the Duncan test.

صفات بیوشیمیایی

جدول 1 نشان داد محلول­پاشی Fe₃O₄ NPs سبب کاهش معنی­دار محتوای مالون دآلدئید، سایر آلدئیدها، وH₂O₂  اندام هوایی و ریشه گوجه­فرنگی نسبت به شاهد شد و غلظت 25 میلی­گرم در لیتر بیشترین تأثیر را داشت، به­طوری که سبب کاهش 9/86، 1/39 درصد در محتوای مالون دآلدئید، 7/43 و 50 درصد در سایر آلدئیدها، 87/19 و 41/20 درصد درH₂O₂  در اندام هوایی و ریشه نسبت به شاهد شد. همچنین 25 میلی­گرم در لیتر Fe₃O₄ NPs، محتوای GABA اندام هوایی و ریشه را به میزان 9/31 و 4/22 درصد در اندام هوایی و ریشه در مقایسه با شاهد کاهش داد. اسپری Fe₃O₄ NPs بر محتوای پروتئین نیز تأثیر معنی­داری داشت. غلظت 25 میلی­گرم در لیتر Fe₃O₄ NPs سبب افزایش 9/43 و 2/28 درصد در محتوای پروتئین در اندام هوایی وریشه در مقایسه با شاهد شد.

جدول 1- اثر غلظت­های مختلف Fe₃O₄ NPs بر محتوای MDA، سایر آلدئیدها، H₂O₂ و GABA اندام هوایی و ریشه در گوجه­فرنگی

Table 1- effects of different concentrations of Fe₃O₄ NPs on MDA, Aldehydes, H₂O₂ and GABA in tomato.

مقادیر، میانگین 3 تکرار ± SD است. حروف یکسان، بیانگر عدم اختلاف معنی­دار در سطح P < 0.05 با استفاده از آزمون دانکن است.

Values are mean ± SD of 3 replicates. Mean values followed by similar letters did not differ significantly (P < 0.05) when determined by the Duncan test.

آنزیم­های آنتی اکسیدانی

مطابق با نتایج جدول 2، محلول­پاشی Fe₃O₄ NPs در همه غظت­ها منجر به افزایش فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدانی در گوجه فرنگی شد که بیشترین افزایش در غلظت 25 میلی­گرم در لیتر بود. غلظت 25 میلی­گرم در لیتر Fe₃O₄ NPs سبب افزایش فعالیتCAT  به میزان 64/117و 26/143،APX  به میزان 17/86 و 05/98 و SOD به میزان 1/101 و 24/57 درصد به ترتیب در اندام هوایی و ریشه شد.

تغییر محتوا و تجمع عناصر غذایی تحت تیمارهای پژوهش

مقایسه میانگین­ها مربوط به محتوای تجمع یافته عناصر غذایی مهمی مانند K, Fe, Mn, Mg, Zn, Cu, Ca در ساقه و ریشه گیاهان تحت تیمار نشان دادند محلول­پاشی Fe₃O₄ NPs سبب افزایش معنی دار محتوای عناصر غذایی سنجش شده در گوجه­فرنگی  نسبت به شاهد شد. بیشترین مقدار عناصر غذایی در غلظت 25 میلی­گرم در لیتر Fe₃O₄ NPs بدست آمد و کمترین مقدار عناصر غذایی مربوط به تیمار شاهد بود. غلظت 25 میلی­گرم در لیتر Fe₃O₄ NPs سبب افزایش محتوای پتاسیم ساقه و ریشه به ترتیب به میزان 5/53 و 5/32 درصد، کلسیم ساقه و ریشه به ترتیب به میزان 78 درصد و 35/1 برابر، منیزیم ساقه و ریشه به ترتیب به میزان 2/43 و 3/54 درصد، آهن ساقه و ریشه به ترتیب به میزان 5/59 درصد و 3/66، منگنز ساقه و ریشه به ترتیب به میزان 47/1 و 14/1 برابر، روی (Zn) ساقه و ریشه به ترتیب نیز به میزان 9/41 و 4/65 درصد و مس ساقه و ریشه به ترتیب به میزان 8/80 درصد و 44/1 برابر نسبت به شاهد شد (جدول 3).

جدول 2- اثر غلظت­های مختلف Fe₃O₄ NPs بر محتوای CAT، APX و SOD اندام هوایی و ریشه در گوجه­فرنگی

Table 2- Effects of different concentrations of Fe₃O₄ NPs on CAT, APX, SOD in tomato.

مقادیر، میانگین 3 تکرار ± SD است. حروف یکسان، بیانگر عدم اختلاف معنی­دار در سطح P < 0.05  توسط آزمون دانکن است.

Values are mean ± SD of 3 replicates. Mean values followed by similar letters did not differ significantly (P < 0.05) when determined by the Duncan test.

جدول 3- اثر غلظت­های مختلف Fe₃O₄ NPs بر محتوای K، Ca، Mg، Fe، Mn، Zn، Cu اندام هوایی و ریشه در گوجه­فرنگی

Table 3- Effects of different concentrations of Fe₃O₄ NPs on shoot and root K, Ca, Mg, Fe, Mn, Zn and Cu content. in tomato.

مقادیر، میانگین 3 تکرار ± SD است. حروف یکسان، بیانگر عدم اختلاف معنی­دار در سطح P < 0.05 توسط آزمون دانکن است.

Values are mean ± SD of 3 replicates. Mean values followed by similar letters did not differ significantly (P < 0.05) when determined by the Duncan test.

بحث

نتایج پژوهش حاضر نشان داد غلظت ۲۵ میلی‌گرم در لیتر نانو ذرات Fe₃O₄، سبب افزایش معنی‌دار وزن خشک و طول اندام هوایی و ریشه و همچنین افزایش محتوای کلروفیل در گوجه‌فرنگی شد (شکل‌های 2، 3 و 4). یافته‌های ما با گزارش El-Desouky et al. (2021) مطابقت دارد که نشان دادند نانو ذرات آهن سبب افزایش وزن تر و خشک و طول گیاه گوجه‌فرنگی می‌شوند و این امر با بهبود رشد رویشی و افزایش سطح برگ‌ها برای جذب نور بیشتر همراه است ( El-Desouky et al., 2021). همچنین در پژوهشی که بر روی گیاهVigna radiata  انجام شد، کاربرد نانو ذرات آهن منجر به افزایش میزان کلروفیل، نرخ فتوسنتز، بهبود عملکرد کوانتومی فتوسیستم­ها و تولید کربوهیدرات‌ها شد (Rani et al., 2022). محلول‌پاشی برگی نانو ذرات آهن دسترسی مستقیم آهن را به کلروپلاست‌ها افزایش داده و بدین ترتیب، کارایی فتوسنتزی گیاه را بهبود می‌بخشد (Alkarawi et al., 2024). این موارد با سازوکار عمل نانو ذرات Fe₃O₄ سازگار است؛ زیرا آن‌ها با افزایش فراهمی زیستی آهن، به بهبود ساختار و عملکرد کلروپلاست‌ها و افزایش سنتز کلروفیل کمک می‌کنند که این امر به نوبه خود منجر به بهبود کلی فتوسنتز می‌شود. همچنین با افزایش جذب فسفر و پتاسیم، فعالیت آنزیم‌های دخیل در چرخه کالوین و تنفس را نیز بهبود می‌بخشند (Feng et al., 2022). در زنجیره انتقال الکترون فتوسنتز و تنفس، سیتوکروم‌ها که نقش انتقال دهنده الکترون را بر عهده دارند، در ساختارشان آهن موجود است و نانو ذرات آهن به روش تقویت جذب آهن سبب بهبود انتقال الکترون می­شوند (Torres et al., 2022).Torres et al. (2022)  نشان داده‌اند نانو ذرات Fe₃O₄ با بهبود کارایی انتقال الکترون در زنجیره فتوسنتزی، قادرند فرآیند فتوسنتز را در گیاه گوجه‌فرنگی تقویت کنند در پژوهش حاضر نیز ممکن است Fe₃O₄NPs با کاهش تنش اکسیداتیو، از تخریب کلروفیل جلوگیری کرده با افزایش محتوای کلروفیل، سبب بهبود رشد رویشی گوجه فرنگی شود (شکل 4 و جدول 1). در شرایط غیر تنش، گیاهان معمولاً گلوتامات را که پیش‌ساز کلروفیل و GABA است، عمدتاً به سمت سنتز کلروفیل، پروتئین‌ها، و سایر ترکیبات ضروری برای رشد و توسعه هدایت می‌کنند (Ul Haq et al., 2023). علّت این است که GABA عمدتاً به عنوان یک مولکول محافظ در برابر تنش و خنثی‌کننده گونه‌های فعال اکسیژن (ROS; Reactive Oxygen Species) عمل می‌کند (Ansari et al., 2021; Ul Haq et al., 2023). این اولویت‌بندی در پژوهش حاضر نیز دیده می­شود، زیرا گیاه در شرایط غیر تنش قرار دارد و در نتیجه نیاز کمتری به GABA است. در پژوهش حاضر، غلظت ۲۵ میلی‌گرم در لیتر نانو ذرات Fe₃O₄  به‌طور معنی‌داری موجب افزایش محتوای کلروفیل و پروتئین و در عین حال، کاهش سطح GABA شد. در مقابل، غلظت ۱۰۰ میلی‌گرم در لیتر نانو ذرات Fe₃O₄، با القاء سمیت در گیاه، به طور همزمان سبب کاهش محتوای کلروفیل و پروتئین و افزایش میزان GABA و تنش اکسیداتیو شد (شکل 4 و جدول 1). این تفاوت را می­توان به دوگانه بودن اثر نانوذرات آهن مرتبط دانست. در غلظت پائین (۲۵ میلی‌گرم در لیتر)، خواص آنتی‌اکسیدانی آن‌ها تنش اکسیداتیو را کاهش داده و نیاز گیاه به تجمع GABA را به عنوان یک سازوکار دفاعی تعدیل می‌کند؛ امّا در غلظت‌های بالا (100 میلی‌گرم در لیتر)، مضر و تنش­زا هستند (جدول 1). این تنش‌زایی نه تنها از روش افزایش تولید گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) قابل توجیه است، بلکه با توجه به نقش آهن به عنوان یک کاتیون و خاصیت آنتاگونیستی آن، می‌تواند منجر به کاهش جذب سایر کاتیون‌های ضروری مانند Mn، Zn و Cu شود. این کمبودهای ناشی از آنتاگونیسم، به نوبه خود، فرایندهای فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی گیاه را مختل کرده و به عنوان یک عامل تنش‌زای ثانویه عمل می‌کنند که به ضرر کلی گیاه می­افزاید ( Salehi Eskandari & Kharati Koopaei, 2020). وجود ارتباطی تنگاتنگ میان متابولیسم نیتروژن و GABA از پیش مشخص شده است (Ansari et al., 2021). نانو ذرات آهن با بهبود جذب و انتقال نیتروژن، دسترسی گیاه به این عنصر حیاتی را افزایش می‌دهند که پیامد آن، افزایش محتوای پروتئین و نیاز کمتر به GABA در گیاه است (Ansari et al., 2021; Ul Haq et al., 2023)؛ که این افزایش محتوای پروتئین و کاهش محتوای GABA در جدول 1 به وضوح نشان داده شده است.

آهن علی‌رغم اینکه یک ریزمغذی ضروری است، امّا در غلظت‌های بالا، به علّت توانایی در تشکیل گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) و همچنین ایجاد اثرات آنتاگونیستی با سایر کاتیون‌ها و آنیون‌ها (که مانع از جذب و انتقال کافی آن­ها می‌شود)، می‌تواند برای گیاهان مضر باشد (Salehi Eskandari & Kharati Koopaei, 2020). این عنصر در واکنش فنتون بین Fe⁺² و H₂O₂ منجر به تولید رادیکال‌های هیدروکسیل سمی می‌شود (Pan et al., 2022). همچنین، اندازه نسبتاً کوچک و توانایی نانو ذرات در القای ROS، نقش کلیدی در سمیت احتمالی آن‌ها ایفا می‌کند (Khan et al., 2023). این ROSها قادرند به سلول‌های گیاهی آسیب رسانده و فرایندهای فیزیولوژیکی حیاتی را مختل سازند (Khan et al., 2023). افزایش مالون‌دی‌آلدئید (MDA)، که محصول اصلی تجزیه اسیدهای چرب غیراشباع در غشای زیستی سلولی است، اغلب به عنوان نشانگر تنش اکسیداتیو به کار می‌رود (Khan et al., 2023). در پژوهش حاضر، افزایش محتوای MDA، پس از تیمار با ۲۵ میلی‌گرم در لیتر نانو ذرات Fe₃O₄ مشاهده نشد. بلکه، کاهش معنی‌دار محتوای MDA و H₂O₂، همراه با افزایش فعالیت آنزیم‌های کاتالاز (CAT)، آسکوربات پراکسیداز (APX) و سوپراکسید دیسموتاز (SOD) مشاهده شد. افزایش معنی‌دار فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی فوق در تیمار ۲۵ میلی‌گرم در لیتر نانو ذرات Fe₃O₄، نه تنها نشان‌دهنده تقویت سیستم دفاعی گیاه در برابر تنش اکسیداتیو است، بلکه آهن برای فعالیت آنزیم‌های APX  و CAT نیز به عنوان کوفاکتور عمل می‌کند (Salehi Eskandari & Kharati Koopaei, 2020). نانو ذرات Fe₃O₄ با فراهم آوردن آهن کافی، ممکن است دسترسی لازم را برای بیوسنتز یا بهبود عملکرد این آنزیم‌ها فراهم کرده باشند، که به نوبه خود منجر به کاهش آسیب‌های اکسیداتیو و بهبود وضعیت فیزیولوژیکی گیاه شده است (Salehi Eskandari & Kharati Koopaei, 2020). این نتایج نشان دادند غلظت ۲۵ میلی‌گرم در لیتر نانو ذرات Fe₃O₄، نه تنها سمیت قابل توجهی نداشت، بلکه به طور موثری آسیب اکسیداتیو را نیز کاهش داد. اما غلظت 100 میلی‌گرم در لیتر با القاء سمیت در گیاه سبب افزایش محتوای MDA و H₂O₂ شد (جدول‌های 1 و 2). نانو ذرات آهن با تقویت فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی، قادر به کاهش سطح ROS بوده و بدین ترتیب، از گیاه در برابر تنش اکسیداتیو محافظت می‌کنند (Li et al., 2017). این نانوذرات با تحریک بیان ژن و افزایش فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی، نقش اساسی در خنثی‌سازی ROSها و کاهش آسیب‌های ناشی از تنش اکسیداتیو ایفا می‌کنند (Khan et al., 2023). پژوهش‌های متعدد نشان داده‌اند که کاربرد نانوذرات آهن می‌تواند موجب افزایش چشمگیری در فعالیت آنزیم‌های SOD، CAT و APX در گونه‌های مختلف گیاهی شود (Khan et al., 2020; Li et al., 2017; Rawat et al., 2017). یافته‌های ما با نتایج قبلی مطابقت دارد. برای مثال، در گیاه ذرت گزارش شده است که برخی از ایزوفرم‌های SOD برای فعالیت خود به آهن وابسته هستند و این آنزیم با کاهش اثرات مضر ROS تولید شده، به حفظ و افزایش محتوای کلروفیل کمک می‌کند (Alsamadany et al., 2024). در پژوهش حاضر، غلظت ۲۵ میلی‌گرم در لیتر نانو ذرات Fe₃O₄ با تقویت فعالیت آنزیم­های CAT، APX و SOD نقش ویژه­ای در کاهش تنش اکسیداتیو داشت. امّا غلظت 100 میلی‌گرم در لیتر، گیاه را در معرض سمیت و تنش اکسیداتیو قرار داد و سبب افزایش محتوای MDA و H₂O₂ شدکه نتایج جدول 1 نیز این مورد را به وضوح نشان می­دهد. همچنین جدول 2 نشان دادند در غلظت 100 میلی‌گرم در لیتر با وجود این­که فعالیت آنزیم­های SOD، CAT و APX افزایش یافته است، امّا این افزایش برای خنثی کردن سمیت القاشده کافی نبوده و گیاه دچار تنش اکسیداتیو شده که نهایت بصورت کاهش در رشد و زیست‌توده گیاه نمودار می­شود.

نتایج جدول 3 افزایش معنی‌دار محتوای عناصر ماکرو (K، Ca و Mg) و میکرو (Fe، Mn، Zn، Cu) را در غلظت ۲۵ میلی­گرم در لیتر نانوذرات آهن نشان می­دهد و نقش کلیدی آن­ها را در بهبود وضعیت تغذیه‌ای گوجه­فرنگی آشکار می­سازد. نانو ذرات آهن، به علّت ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی منحصربه‌فرد خود، نفوذپذیری بالایی دارند؛ می‌توانند از موانع برگی عبور کرده و مستقیماً در فرآیندهای فیزیولوژیکی و تغذیه‌ای گیاه مشارکت کنند؛ که به جذب و انتقال کارآمدتر عناصر غذایی منجر می‌شود (Yang et al., 2020). این نانو ذرات با القای تولید و فعالیت هورمون‌های گیاهی مانند اکسین و سیتوکینین، تقسیم سلولی و رشد اندام‌های هوایی و ریشه را تحریک می‌کنند (Divte et al., 2021). این امر با افزایش حجم ریشه و تعداد ریشه‌های جانبی، جذب بهتر عناصر غذایی ضروری و در نتیجه بهبود رشد و عملکرد کلی گیاه را به همراه دارد (Divte et al., 2021). همانگونه که پیش­تر اشاره شد محلول‌پاشی برگی نانو ذرات آهن (FeNPs)، سبب افزایش کارایی فتوسنتزی می­شود. فتوسنتز بهینه، ضمن افزایش تولید کربوهیدرات‌ها، سنتز آدنوزین تری‌فسفات (ATP) را نیز ارتقاء می‌بخشد (El-Desouky et al., 2021). این منابع انرژی و کربن برای جذب فعال یون‌ها (نظیر پتاسیم، کلسیم، منیزیم) و سنتز پروتئین‌ها و آنزیم‌های دخیل در متابولیسم عناصر (مانند منگنز، مس، روی) ضروری هستند (El-Desouky et al., 2021). در پژوهش حاضر نیز غلظت 25 میلی­گرم در لیتر نانو ذرات آهن ضمن بهبود محتوای کلروفیل و فاکتورهای رشد سبب افزایش محتوای عناصر غذایی ماکرو (K، Ca و Mg) و میکرو (Fe، Mn، Zn، Cu) شدند (جدول 3). Askary, et al (2017)  نیز گزارش کردند نانوذرات آهن با تأثیر بر سیستم­های انتقال فعال در غشاء، سبب افزایش جذب مواد مغذی کلیدی در گیاه Catharanthus roseus می‌شود و این بهبود وضعیت مواد مغذی، به احتمال زیاد به افزایش رشد و ظرفیت فتوسنتزی گیاه کمک می‌کند (Askary et al., 2017). همچنین، کاربرد نانوذرات آهن در نعنا، افزایش جذب عناصر غذایی ماکرو مانند فسفر (P)، Mg و Ca و ریزمغذی‌هایی نظیر Fe و Zn را نشان داد (Mohammadi et al., 2018). در گندم نیز تیمار نانو ذرات Fe₃O₄ به بهبود جذب P، Fe و K منجر شد (Feng et al., 2022)، که یافته‌های ما نیز موافق با نتایج فوق است. از سوی دیگر، نانوذرات آهن ممکن است به عنوان سیگنال‌دهنده‌های مولکولی عمل کرده و بیان ژن‌های کدکننده پروتئین‌های ناقل(Transporters) را تنظیم کنند (Yang et al., 2020). تحریک بیان این ژن‌ها می‌تواند کارایی جذب و توزیع عناصر غذایی را افزایش دهد (Yang et al., 2020). همچنین، گیاهانی که تحت تنش کمتری هستند، انرژی بیشتری برای جذب و انتقال عناصر غذایی تخصیص می‌دهند که به بهبود کلی جذب عناصر ماکرو و میکرو منجر می‌شود(Feng et al., 2022). در پژوهش حاضر نیز غلظت 25 میلی گرم در لیتر نانوذرات آهن نقش کلیدی در ایجاد محیطی با تنش کمتر دارد (جدول 1 و 2) و تحت این شرایط گیاه سهم بیشتری از انرژی را صرف جذب و انتقال عناصر غذایی می‌کند که در رشد و زیست‌توده بهتر نمود پیدا می کند (جدول 3). در مجموع، یافته‌های این پژوهش، بر پتانسیل بالای محلول‌پاشی برگی نانو ذرات آهن به عنوان یک راهکار نوین و کارآمد در تغذیه گیاهان تأکید دارند. این روش نه تنها به بهبود جذب عناصر ضروری کمک می‌کند، بلکه می‌تواند راهکاری سریع و مؤثر برای رفع کمبودهای تغذیه‌ای باشد.

نتیجه­گیری

در این پژوهش، غلظت ۲۵ میلی‌گرم در لیتر  Fe₃O₄ NPsآثار مثبت قابل توجهی بر گوجه‌فرنگی نشان داد. این نانو ذرات با القای فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی، منجر به کاهش تنش اکسیداتیو شدند. همچنین افزایش معنی‌دار محتوای رنگدانه‌های فتوسنتزی و عناصر غذایی مفید، به‌ویژه آهن نیز مشاهده شد. این بهبود همزمان در محتوای رنگدانه‌های فتوسنتزی و عناصر مغذی ضروری، منجر به ارتقاء رشد در گوجه‌فرنگی شد. یافته‌های این پژوهش حاکی از آن است کهFe₃O₄ NPs  می‌توانند به عنوان جایگزینی نویدبخش برای کودهای آهن سنتی در کشاورزی مطرح شوند. با این وجود، برای تأئید این نتایج و روشن شدن بهتر سازوکار‌های اثرگذاری در شرایط مزرعه‌، انجام پژوهش‌های مزرعه­ای ضروری به نظر می‌رسد.