News

 Statistics

Number of Journals44
Number of Issues1,877
Number of Articles15,278
Article View43,731,779
PDF Download17,564,047
Bourang, S., Jahanbakhsh Godekahriz, S., Asghari Zakaria, R., parsa Khankandi, H., Noruzpuor, M. (2024). The effect of different types and concentrations of plant growth regulators on the amount of callus tissue production by fennel (Foeniculum vulgare) explants in vitro. , 15(2), 97-118. doi: 10.22108/ijpb.2024.141006.1359
Shima Bourang; Soodabeh Jahanbakhsh Godekahriz; Rasool Asghari Zakaria; Hamed parsa Khankandi; mehran Noruzpuor. "The effect of different types and concentrations of plant growth regulators on the amount of callus tissue production by fennel (Foeniculum vulgare) explants in vitro". , 15, 2, 2024, 97-118. doi: 10.22108/ijpb.2024.141006.1359
Bourang, S., Jahanbakhsh Godekahriz, S., Asghari Zakaria, R., parsa Khankandi, H., Noruzpuor, M. (2024). 'The effect of different types and concentrations of plant growth regulators on the amount of callus tissue production by fennel (Foeniculum vulgare) explants in vitro', , 15(2), pp. 97-118. doi: 10.22108/ijpb.2024.141006.1359
Bourang, S., Jahanbakhsh Godekahriz, S., Asghari Zakaria, R., parsa Khankandi, H., Noruzpuor, M. The effect of different types and concentrations of plant growth regulators on the amount of callus tissue production by fennel (Foeniculum vulgare) explants in vitro. , 2024; 15(2): 97-118. doi: 10.22108/ijpb.2024.141006.1359

The effect of different types and concentrations of plant growth regulators on the amount of callus tissue production by fennel (Foeniculum vulgare) explants in vitro

علوم زیستی گیاهی
Article 7, Volume 15, Issue 2 - Serial Number 56, September 2023, Pages 97-118    PDF (755.19 K)
Document Type: Original Article
DOI: 10.22108/ijpb.2024.141006.1359
Authors
Shima Bourang1; Soodabeh Jahanbakhsh Godekahriz* 1; Rasool Asghari Zakaria1; Hamed parsa Khankandi2; mehran Noruzpuor1
1Department of Plant Genetics and Production Engineering, Faculty of Agriculture and Natural Resources, Mohaghegh Ardabili University, Ardabil, Iran.
2Department of Pharmacognosy, Faculty of Pharmacy, Ardabil, Iran.
Abstract
The fennel plant (Foeniculum vulgare L.) is a member of the Apiaceae umbrella family. In this research, the effect of different plant growth regulators on the production of callus tissue from fennel explants was investigated and then the effect of selected plant growth regulators on the biochemical compounds and secondary metabolites of the resulting callus tissue was evaluated. The desired explants after transfer to the laboratory and surface disinfection on the MS base culture medium containing Kin and BAP in concentrations (zero, 0.1, and 0.5 mg/L) and 2,4-D, NAA, and IBA (at concentrations of zero, 0.5, 1, 2 and 4 mg/L) were cultivated. According to the results, the use of Kin instead of BAP (in lower concentrations) and NAA (in higher concentrations) increased the percentage of callus production. According to the results, the highest percentage of callus production (100%) is related to the culture medium containing Kin (in concentrations of 0.1 or 0.5 mg/L) along with NAA (in concentrations of 1, 2, or 4 mg/L). In this research, it was found that the use of auxin and cytokinin (in combination with each other) increased the induction and production of callus tissue. Also, in terms of the activity level of peroxidase and catalase enzymes, and accumulation of amino acid proline, flavonoid, and anthocyanin, a significant difference was observed between different plant growth regulators. So the highest peroxidase and catalase enzyme activities and proline amino acid accumulation are related to MS+1(mg/L)­IBA +0.5(mg/L)­BAP culture medium. Also, the highest amount of flavonoid was related to MS+2(mg/L)NAA+0.5(mg/L)BAP culture medium. The highest amount of anthocyanin was related to MS+2 (mg/L)2,4-D+0.5(mg/L)BAP culture medium.
Introduction
Fennel (Foeniculum vulgare L.) is a member of the Apiaceae family, which is known for having significant contents of phytochemicals, including flavonoids, coumarins, quinones, phenolic and alkaloid compounds. Plant tissue culture is the in vitro culture of cells, tissues, organs, or the whole plant under sterile conditions on a nutrient culture medium of known composition, which is often used to produce plant clones. The resulting clones are genetically uniform and very similar to the mother plant. Callus culture is the most common type of culture in plant tissue culture. Callus is a growing mass of undifferentiated and unorganized cells, which are formed because of a wound on the surface of the plant. Callus tissue can be obtained from all the organs of a whole plant such as meristem, stem tip, lateral buds, leaf, leaf, etc. Several factors including genetic structure, type of culture medium, environmental factors (light, pH, and temperature), and plant growth regulators are effective on tissue culture and micropropagation of plants. Plant growth regulators, which are used in very low concentrations, are effective in the distribution of substances inside the plant, cell division, and cell growth. Plant growth regulators, especially auxins and cytokinins, play a very important role in controlling the growth and development of cells both in the whole plant and in explants cultured in vitro.
 
Material and Methods
In this research, first, the optimal conditions to produce callus from explants obtained from fennel shoots were investigated, and then the biochemical compositions of the resulting callus were measured. To produce callus tissue, explants from F. vulgare shoots were prepared from the medicinal plant research center of Ardabil University of Medical Sciences. The samples were first examined phenotypically and after selecting fresh samples without obvious contamination, they were washed with a dishwashing solution for 30 minutes and then rinsed under running water for one hour. The explants were then immersed in H2O2 solution (5%) for 10 minutes and after rinsing twice with sterile water (autoclaved twice) for 10 minutes, they were disinfected in 2.5% sodium hypochlorite. At the end, sterilized explants on MS culture medium containing different plant growth regulators Kin or BAP (zero, 0.1 and 0.5 mg/L) alone or in combination with 2,4-D or NAA or IBA (each in concentrations of zero, 0.5, 1, 2 and 4 mg/L) were cultivated and the percentage of callus production, root and shoot and the biochemical composition of the resulting callus samples (peroxidase and catalase activity levels), the amount of amino acid accumulation of proline, total flavonoid and anthocyanin) were recorded after 3-4 weeks. This research was conducted as a completely randomized design experiment with three replications, and the data analysis was done using SPSS ver. 26.
Results and Discussion
According to the results obtained in this research, it was found that the percentage of callus production from explants obtained from fennel plant shoots, roots, and aerial parts obtained from callus, as well as the weight of the collected callus, had a significant difference between most of the plant growth regulators treatments and the control treatment. According to the results obtained in this research, it was found that the highest percentage of callus production (100%) was related to the culture medium containing Kin (concentrations of 0.1 or 0.5 mg/L) along with NAA (concentrations of 1, 2, or 4 mg/L). According to the results of the study, the use of auxin and cytokinin (in combination with each other) increased the induction and production of callus. In terms of the percentage of root production from callus samples, the best (100%) was related to MS+ 2,4-D (2 mg/L) + BAP (0.1 mg/L) culture medium. Also, MS culture medium containing 1mg/L of 2,4-D along with 0.5 mg/liter of BAP had the highest percentage of shoot production from callus samples of the fennel plant (55.53%). On the other hand, a significant difference was observed in the activities of peroxidase and catalase enzymes, amino acid proline, flavonoid, and anthocyanin accumulation between different plant growth regulators. The highest level of peroxidase, catalase, and amino acid proline was related to MS + IBA (1mg/L) + BAP (0.5mg/L) culture medium.
Conclusion
According to the results, the use of plant growth regulators had a positive and significant effect on the amount of callus production, root, and shoot production, as well as the biochemical characteristics of the fennel plant. In this research, it was found that the use of Kin and NAA causes the maximum increase in callus production from fennel explants. To increase the antioxidant and anticancer properties of callus samples, it is very important to increase the amount of flavonoids and anthocyanins in the callus, and in the current study, the highest amount of biochemical compounds, especially the amount of flavonoids and anthocyanins in the in vitro culture of the fennel plant, was associated with an increase in the concentration of auxin and cytokinin.
Keywords
BAP; Callus production; Fennel; Foeniculum vulgare; Kin and NAA
Full Text

گیاه رازیانه با نام علمی ( L. Foeniculum vulgare) متعلق به خانواده چتریان Apiaceae است. این گیاه با خواص دارویی و درمانی با ارزش در حالت وحشی، به­صورت گیاهی چند ساله بوده ولی نوع اهلی آن، گیاهی دو ساله است (Noshad & Falah, 2020). از نظر پلوئیدی این گیاه دیپلوئید (2n=2x=22) و علفی است و از دیرباز در طب سنتی ایرانی و بین­الملل جهت درمان بیماری­های گوارشی، بیماری­های مربوط به زنان، بیماری­های تنفسی، آب مروارید، برونشیت، استفراغ، دفع سنگ کلیه، اسهال و سرفه­های مزمن و نیز جلوگیری از اختلالات سوء هاضمه در نوزادان شیرخوار مورد توجه بوده است (Khan et al., 2022). خاستگاه اصلی این گیاه مدیترانه و اروپای مرکزی است. امروزه کشت این گیاه در تمامی نقاط مورد توجه قرار گرفته است، امّا بیشترین سطح زیر کشت مربوط به کشورهای حاشیه دریای مدیترانه است که جهت کشت تجاری از اهمیّت بسیار بالایی برخوردار است (Mehra et al., 2021). مواد معدنی و ویتامین­های موجود در اندام­های مختلف رازیانه شامل کلسیم، پتاسیم، سدیم، آهن، فسفر، تیامین، ریبوفلاوین، نیاسین و ویتامین C هستند (Khan et al., 2022). ریشه، برگ، ساقه و دانه گیاه رازیانه دارای ترکیبات موثره مفید و دارویی هستند که متناسب با نیاز و درمان هدف مورد استفاده قرار می­گیرد، امّا به طور کلی دانه و ساقه این گیاه از ارزش دارویی بالایی برخوردار است (Saremirad et al., 2021).et al (2021)  Mehra, در پژوهشی، با بررسی­های خود بر روی دانه گیاه رازیانه بیان کردند دانه این گیاه دارای ترکیبات بیوشیمیایی نظیر تانن، فنچون، فلاندرن، لیمونن، دیپنتن، استراگول، متیل اورانژ، کامفن، مواد پروتئینی- قندی و روغنی هستند. همچنین بیان کردند روغن­های استخراج شده از دانه این گیاه از اسیدهای چربی مانند اسید پالمتیک، اسید اولئیک، اسید لینولئیک و اسید پتروسلینیک تشکیل شده است. فنل کل موجود در این گیاه جزء ترکیبات متابولیتی با ارزش آن محسوب می­شود. از جمله ترکیبات فنلی استخراج شده از دانه این گیاه می­توان به اسید نئوکلروژنیک، اسیدکلروژنیک، اسیدگالیک، اسیدکافئیک، اسیدکوماریک، اسید فلوریک، اسید سینامیک، کوئرستین، هسپریدین، اسید رزمارنیک، آنتول و آپیژینین اشاره نمود (Mehra et al., 2021). همچنین برگ­ها و ساقه­های این گیاه حاوی ترکیباتی ضد میکروبی و ضد سرطانی نظیر روتین، کمپفرول، کوئرستین، فلاونوئید فینکولارین، آرابینوزید و نلومبوزید است (Nikolova et al., 2011). از سوی دیگر، طبق بررسی­های انجام شده ریشه، این گیاه حاوی خانواده بزرگی از کومارین­ها و آپیول است (Rasheed et al., 2021). کشت بافت گیاهی، کشت در شرایط in vitro سلول‌ها، بافت‌ها، اندام‌ها یا کل گیاه تحت شرایط کنترل‌شده تغذیه‌ای و محیطی است که اغلب برای تولید کلون‌های گیاهی استفاده می­شود. کلون­های حاصل از نظر ژنتیکی کاملاً یکنواخت بوده و بسیار شبیه به پایه مادری است. امروزه از روش کشت بافت و اندام گیاهی جهت تکثیر، افزایش تولید ترکیبات موثره گیاهی، حفاظت از ژرم­پلاسم گیاهی، انتقال سریع گونه­ای و غیره استفاده می­شود (Noruzpuor et al., 2022). تکنیک کشت بافت گیاهی بر اساس مفهوم Totipotency سلول‌ها (قابلیت و ظرفیت تبدیل‌شدن هر سلول به یک موجود کامل) شکل ‌گرفته است (Magyar-Tábori et al., 2010). کشت کالوس معمول‌ترین نوع کشت در کشت بافت گیاهی محسوب می­شود. کالوس بافتی متشکل از سلول‌های تمایز نیافته و غیرسازمان‌یافته است که در اثر بروز زخم در سطح گیاه حاصل می­شود. بافت کالوس را می­توان در محیط کشت از تمام اندام­های یک گیاه کامل مانند مریستم­، نوک ساقه، جوانه‌های جانبی، برگ، دم برگ، بساک، تخمدان، تخمک، جنین و غیره به دست آورد (Han et al., 2011). از تکنیک تولید کالوس برای ایجاد تنوع ژنتیکی در بین جمعیت، افزایش تولید متابولیت­های گیاه پایه، تولید متابولیت­های جدید، باززایی و تولید گیاهان عاری از بیماری و غیره استفاده می­شود (Noruzpour et al., 2019). در سال­های اخیر استفاده از روش­های کشت سلول و بافت گیاهی به روشی مؤثر جهت تکثیر گونه­های گیاهی در خطر انقراض تبدیل شده است. کشت بافت و سلول گیاهی روشی آسان و به نسبت ارزان ­قیمت محسوب می­شود.

عوامل متعددی از جمله ساختار ژنتیکی، نوع محیط کشت، عوامل محیطی (نور، pH، دما و غیره) و تنظیم­کننده­های رشد گیاهی بر کشت بافت و ریز ازدیادی گیاهان مؤثر است (Noruzpuor et al., 2022). تنظیم­کننده­های رشد گیاهی که در غلظت­های بسیار کم به کار گرفته می­شوند، روی توزیع مواد داخل گیاه، تقسیم سلولی، رشد سلولی و غیره موثرند. تنظیم­کننده­های رشد گیاهی، به ویژه اکسین­ها و سیتوکینین­ها، در کنترل رشد و نمو سلول­ها هم در گیاه کامل و هم در ریزنمونه­های کشت شده در شرایط درون­شیشه­ای نقش بسیار مهمی دارند. از جمله تنظیم­کننده­های رشد گیاهی متداول جهت تولید کالوس در شرایط درون­شیشه­ای می­توان به NAA، 2,4-D، IAA، IBA (به عنوان اکسین) و BAP، زآتین، Kin، TDZ و BA (به عنوان سیتوکینین) اشاره نمود. نوع و مقدار اکسین یا سیتوکینین و یا نسبت اکسین به سیتوکینین و بالعکس در شرایط درون شیشه­ای بر تشکیل اندام­های گیاهی، بافت کالوس، تولید متابولیت­های ثانویه و غیره موثر است. به طور کلی افزودن اکسین­ها به درون محیط کشت به عنوان تنظیم کننده رشد گیاهی برخلاف سیتوکینین­ها امکان تشکیل ریشه و بافت کالوس را افزایش داده و از ایجاد ساقه ممانعت به عمل می­آورد (Zare et al., 2021). (2020) Sharma & Mandal، با بررسی انواع محیط کشت و تنظیم کننده های رشد گیاهی بیان کردند استفاده از محیط کشت MS به همراه 1/0 میلی­گرم برمیلی­لیتر BA و 2 میلی­گرم بر میلی لیتر NAA  بهترین شرایط را برای تولید بافت کالوس از ریزنمونه­های گیاه رازیانه (F. vulgare) را فراهم می­کند (Sharma & Mandal, 2020). استفاده از NAA در غلظت 5/1 میلی­گرم بر لیتر به همراه 5/0 میلی­گرم بر لیتر BA در محیط کشت پایه MS درصد تولید کالوس نمونه­های گیاه رازیانه (F. vulgare) را تا 100 درصد افزایش می­دهد (Asree & Khirallah, 2020). همچنین Asree & Khirallah (2020)  گزارش کردند محیط کشت پایه MS به همراه 2 میلی­گرم بر لیتر NAA و یک میلی­گرم بر لیتر Kin سبب تولید 100 درصدی کالوس از ریزنمونه‌های گیاه رازیانه (L. Foeniculum vulgare) می­شود (Asree & Khirallah, 2020). در پژوهش  Yang, et al (2015) بر روی کشت بافت گیاه رازیانه و تولید متابولیت­های ثانویه توسط محرک های رشد گیاهی بیان کردند نمونه کالوس­های تیمار شده درون محیط کشت MS حاوی NAA و Kin به عنوان تنظیم­کننده­های رشد گیاهی و سالیسیلیک­اسید و متیل­جاسمونات در غلظت­های 100 و 200 میلی­گرم در لیتر به عنوان محرک­های رشد گیاهی بیشترین میزان تولید آنتول را داشته­اند (Yang et al., 2015). با توجه به اهمیت دارویی گیاه رازیانه و محدود بودن یافته­های ارائه شده در مورد تولید کالوس از ریزنمونه­های حاصل از شاخساره این گیاه با ارزش، در پژوهش حاضر، میزان تولید کالوس، تولید اندام ریشه و اندام هوایی از کالوس حاصل به کمک انواع تنظیم­کننده­های رشد گیاهی مختلف (اکسین و سیتوکینین) ارزیابی شد.

 مواد و روش­ها

تهیه و کشت ریزنمونه

اندام هوایی (ساقه­های جدید و تازه رشد کرده) گیاه رازیانه به عنوان ریزنمونه­ گیاهی جهت تولید کالوس در شرایط درون شیشه­ای، از مرکز (مزرعه) تحقیقات گیاهان دارویی دانشگاه علوم پزشکی اردبیل تهیه شد. نمونه­های جمع­آوری شده در جعبه­های مخصوص و استریل به آزمایشگاه منتقل شدند. نمونه­ها در ابتدا از نظر فنوتیپی بررسی شدند و پس از انتخاب نمونه­های تازه و فاقد آلودگی و پژمردگی واضح به مدّت 30 دقیقه توسط محلول ظرف­شویی شستشو داده و سپس به مدّت یک ساعت زیر آب جاری آب­کشی شدند. سپس نمونه­ها جهت حذف آلودگی قارچی در مرحله استقرار ریزنمونه درون بنومیل 3 درصد بنومیل (3 گرم بنومیل در یک لیتر آب) به مدّت 2 ساعت قرار گرفتند (Noruzpuor et al., 2022). ریز نمونه­ها سپس درون محلول H2O2 (5 درصد) به مدّت 10 دقیقه غوطه­ور شده و پس از دو بار آبکشی با آب استریل (دو بار اتوکلاو شده) به مدّت 10 دقیقه درون هیپوکلریت­سدیم 5/2 درصد ضدعفونی شدند. در انتها و قبل از استقرار بر روی محیط کشت MS حاوی تنظیم­کننده­های رشد مختلف (جدول 1)، ریز نمونه­ها سه مرتبه و هر بار به مدّت 10 دقیقه توسط آب استریل (دو بار اتوکلاو شده) آب­کشی شدند.

مرحله استقرار و نگه­داری ریزنمونه

پس از انتقال ریز نمونه­های حاصل از شاخساره بر روی محیط کشت، جهت تولید کالوس محیط کشت­های حاوی ریزنمونه به اتاقک رشد فاقد روشنایی و با دمای °C 25 منتقل شدند. درصد تولید کالوس از ریزنمونه­های کشت شده، درصد تولید ریشه و اندام هوایی از کالوس حاصل و وزن تر کالوس، رنگ و نوع کالوس پس از گذشت 3 الی 4 هفته ثبت شد.

اندازه ­گیری ویژگی­های بیوشیمیایی

ابتدا 1/0 گرم از نمونه کالوس حاصل از محیط کشت حاوی تنظیم­کننده­های رشد گیاهی منتخب درون هاون چینی و ازت مایع سائیده شد. سپس 5/1 میلی‌لیتر بافر فسفات سدیم (7=pH) حاوی 1 درصد پلی‌وینیل پیرولیدون (PVP) و 1 میلی‌مولار EDTA اضافه شد. سپس نمونه‌ها در دمای°C  4 و 13000 دور در دقیقه به مدّت 10 دقیقه سانتریفیوژ شدند. سپس فاز رویی به عنوان عصاره پروتئینی برای اندازه­گیری میزان پروتئین و فعالیت‌های آنزیمی جمع­آوری شد. برای اندازه­گیری مقدار پروتئین کل نمونه‌ها از روش Bradford استفاده شد (Bradford, 1976). جهت پژوهش از 50 میکرولیتر عصاره پروتئینی و50 میکرولیتر معرف برادفورد و 900 میکرولیتر بافر فسفات به عنوان محلول واکنش استفاده شد. میزان جذب نوری عصاره پروتئینی در طول موج 595  نانو­متر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (BIORAD, SmartspecTM plus، آمریکا) استفاده شد. کمی‌سازی غلظت پروتئین با آلبومین سرم گاوی (BSA) در غلظت­های مختلف انجام شد.

جدول1- تنظیم کننده­های رشد مختلف مورد استفاده جهت تولید کالوس از ریزنمونه­های گیاه رازیانه ( F. vulgare)

Table 1- Different growth regulators used to produce callus from explants of F. vulgare

غلظت سیتوکنین (میلی­گرم/ لیتر)

Cytokinin concentration (mg/L)

نوع سیتوکنین

Cytokinin type

غلظت اکسین (میلی­گرم/ لیتر)

Auxin concentration (mg/L)

نوع اکسین

Auxin type

محیط کشت

Culture media

-

-

-

-

MS

0.1

BAP

-

-

MS

0.5

BAP

-

-

MS

0.1

Kin

-

-

MS

0.5

Kin

-

-

MS

-

-

0.5

2,4-D

MS

-

-

1

2,4-D

MS

-

-

2

2,4-D

MS

-

-

4

2,4-D

MS

0.1

BAP

0.5

2,4-D

MS

0.1

BAP

1

2,4-D

MS

0.1

BAP

2

2,4-D

MS

0.1

BAP

4

2,4-D

MS

0.5

BAP

0.5

2,4-D

MS

0.5

BAP

1

2,4-D

MS

0.5

BAP

2

2,4-D

MS

0.5

BAP

4

2,4-D

MS

0.1

Kin

0.5

2,4-D

MS

0.1

Kin

1

2,4-D

MS

0.1

Kin

2

2,4-D

MS

0.1

Kin

4

2,4-D

MS

 

0.5

Kin

0.5

2,4-D

MS

0.5

Kin

1

2,4-D

MS

0.5

Kin

2

2,4-D

MS

0.5

Kin

4

2,4-D

MS

-

-

0.5

NAA

MS

-

-

1

NAA

MS

-

-

2

NAA

MS

-

-

4

NAA

MS

0.1

BAP

0.5

NAA

MS

0.1

BAP

1

NAA

MS

0.1

BAP

2

NAA

MS

0.1

BAP

4

NAA

MS

0.5

BAP

0.5

NAA

MS

0.5

BAP

1

NAA

MS

0.5

BAP

2

NAA

MS

0.5

BAP

4

NAA

MS

0.1

Kin

0.5

NAA

MS

0.1

Kin

1

NAA

MS

0.1

Kin

2

NAA

MS

0.1

Kin

4

NAA

MS

0.5

Kin

0.5

NAA

MS

0.5

Kin

1

NAA

MS

0.5

Kin

2

NAA

MS

0.5

Kin

4

NAA

MS

-

-

0.5

IBA

MS

-

-

1

IBA

MS

-

-

2

IBA

MS

-

-

4

IBA

MS

0.1

BAP

0.5

IBA

MS

0.1

BAP

1

IBA

MS

0.1

BAP

2

IBA

MS

0.1

BAP

4

IBA

MS

0.5

BAP

0.5

IBA

MS

0.5

BAP

1

IBA

MS

0.5

BAP

2

IBA

MS

0.5

BAP

4

IBA

MS

0.1

Kin

0.5

IBA

MS

0.1

Kin

1

IBA

MS

0.1

Kin

2

IBA

MS

0.1

Kin

4

IBA

MS

0.5

Kin

0.5

IBA

MS

0.5

Kin

1

IBA

MS

0.5

Kin

2

IBA

MS

0.5

Kin

4

IBA

MS

 اندازه‌گیری فعالیت آنزیم‌های پراکسیداز و کاتالاز

اندازه‌گیری فعالیت آنزیم پراکسیداز طبق روشMacAdam, et al (1992)  با کمی تغییر انجام شد (MacAdam et al., 1992). مخلوط واکنش شامل 81/0 میلی­لیتر بافر فسفات پتاسیم 100 میلی­مولار (7pH= )، 20 میکرولیتر عصاره پروتئینی، 90 میکرولیتر گایاکول (10 میلی‌مولار) ، 90 میکرولیتر آب اکسیژنه (5 میلی­مولار) بود. تغییرات جذب مخلوط واکنش در طول موج 425 نانومتر به مدّت 60 ثانیه و در دمای °C 25 با اسپکتروفتومتر اندازه­گیری شد. فعالیت آنزیم پراکسیداز بر حسب تغییرات جذب در دقیقه به ازای هر میلی­گرم پروتئین بیان شد و میزان فعالیت آن از رابطه (× (V/Vt) / (0.1×T) / Cp 425­A∆) محاسبه شد، که در این فرمول 425A∆: تغییرات جذب نوری؛ ­V: حجم کل؛ ­Vt: حجم عصاره مورد استفاده در واکنش؛ T: زمان واکنش (دقیقه)؛ Cp: غلظت پروتئین بود.

برای اندازه‌گیری فعالیت آنزیم کاتالاز از روش(1996)  & Mahely  Chanesبا کمی تغییر استفاده شد (Chanes & Mahely, 1996). بافر فسفات سدیم 20 میلی­مولار با 7 pH= و20 میکرولیتر پراکسید هیدروژن (H2O2) 5 میلی‌مولار به عنوان پذیرنده الکترون استفاده شد و سپس 60 میکرولیتر عصاره پروتئینی در حمام یخ به آن اضافه و تغییرات جذب نوری در طول موج 240 نانومتر خوانده شد. برای نمونه بلانک به جای عصاره پروتئینی از بافر فسفات (7pH=) استفاده شد. فعالیت آنزیم کاتالاز بر اساس میزان تغییرات جذب در میکروگرم پروتئین در دقیقه از فرمول

  ∆) A 240­ ×(V/Vt) (0.1×T)/Cp (× (V/Vt) / (0.1×T)

محاسبه شد. در این فرمول: 240A∆: تغییرات جذب نوری؛ V: حجم کل؛ ­Vt: حجم عصاره مورد استفاده در واکنش؛ ­T: زمان واکنش (برحسب دقیقه) و Cp: غلظت پروتئین بود.

 اندازه­ گیری اسیدآمینه پرولین

پرولین آزاد نمونه­های مورد نظر طبق روش Bates اندازه­گیری شد (Bates et al., 1973). برای این کار 1/0 گرم نمونه کالوس در اسید سولفوسالیسیلیک 3/3 درصد و در یک هاون چینی کوچک به مدّت 3 دقیقه سائیده شد. همگنای حاصل در دمای 4 درجه سانتی‌گراد و با 4000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شده و محلول رویی به یک میکروتیوب جداگانه منتقل شد. سپس یک میلی‌لیتر از معرف نین­هیدرین و یک میلی‌لیتر استیک­اسید خالص به آن اضافه شد. سپس، مخلوط حاصل به حمام آب با دمای °C90 منتقل شده و به مدّت یک ساعت در این شرایط نگهداری شد. پس از سرد شدن نمونه دو میلی‌لیتر تولوئن به آن اضافه و سپس به مدّت دو دقیقه همزده شد. سپس، جذب نوری محلول رویی در طول موج 520 نانومتر در دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه‌گیری شد. پرولین آزاد نمونه با یک منحنی استاندارد پرولین خالص تعیین شد.

 

استخراج متابولیت­های ثانویه

برای استخراج متابولیت­های ثانویه نمونه‌های کالوس از روشet al (2022)  Chang, استفاده شد (Chang et al., 2002). بدین منظور ابتدا 1/0 گرم نمونه کالوس یا سلول درون هاون چینی و با 5 میلی­لیتر متانول اسیدی )متانول خالص و اسید کلریدریک به نسبت حجمی 99:1) کاملا سائیده شد. سپس مخلوط حاصل به مدّت 72 ساعت در دمایC ° 25 و در تاریکی نگهداری شد. سپس نمونه‌ها به مدّت 10 دقیقه و 4000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند. از محلول رویی حاصل برای اندازه‌گیری مقدار فلاونوئید و آنتوسیانین استفاده شد. برای اندازه­گیری فلاونوئید کل از روشet al (2002)  Chang, با کمی تغییر استفاده شد (Chang et al., 2002). ابتدا 250 میکرولیتر از محلول کلرید­آلومینیوم 10 درصد (جرمی-حجمی)، 250 میکرولیتر پتاسیم­استات­ یک مولار به یک میلی­لیتر عصاره حاصل اضافه شد و مقادیر جذب نمونه­ها با دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 498 نانومتر اندازه‌گیری شد. منحنی استاندارد کوئرستین با غلظت­های مختلف کوئرستین (صفر، 25، 50 و 100 میلی­گرم در لیتر متانول) تهیه و برای کمی‌سازی میزان فلاونوئید کل در نمونه‌ها استفاده شد. سپس از فرمول T=(C ×V)/M مقدار فلاونوئید بر حسب میلی­گرم در یک گرم کالوس محاسبه شد. در این فرمول T، میزان فلاونوئید بر حسب میلی­گرم در گرم کالوس؛C ، غلظت فلاونوئید بر حسب میلی­گرم کوئرستین در میلی­لیتر؛V ، حجم نهایی عصاره و M، وزن نمونه (کالوس برحسب گرم) است. برای اندازه­گیری مقدار آنتوسیانین نمونه‌‌های کالوس از روش  Wagnerاستفاده شد (Wagner, 1979). همچنین جذب نوری عصاره حاصل با دستگاه اسپکتروفتومتر و در طول موج 550 نانومتر اندازه‌گیری شد. سپس میزان آنتوسیانین با فرمولA=εbc  و ضریب خاموشیM-1cm-1  33000  محاسبه شد. در فرمول فوق A برابر مقدار عدد جذبی، b برابر عرض کووت، ε برابر ضریب خاموشی و c برابر غلظت آنتوسیانین است.

  طرح آزمایشی و تجزیه آماری

این پژوهش به صورت آزمایش طرح کامل تصادفی با سه تکرار انجام شد. قبل از انجام تجزیه و تحلیل داده­ها، تست نرمال بودن توزیع داده­ها با آزمون تک نمونه­ای کولموگروف- اسمیرنوف انجام شد. تجزیه و تحلیل داده­ها با نرم­افزار SPSS ver. 26 و رسم نمودارها با نرم­افزار EXCEL انجام شد.

 نتایج

طبق نتایج به دست آمده از جدول تجزیه واریانس داده­ها (جدول2)، درصد تولید کالوس، درصد تولید ریشه و اندام هوایی از کالوس حاصل و وزن تر کالوس جمع آوری شده از ریزنمونه­های گیاه رازیانه کشت شده در شرایط درون شیشه­ای به طور معنی­داری (در سطح احتمال یک درصد) تحت تأثیر نوع و غلظت اکسین و سیتوکینین قرار گرفتند (جدول2).

جدول2- تجزیه واریانس تأثیر نوع و غلظت­های مختلف تنظیم­کننده­های رشد گیاهی بر درصد تولید کالوس، درصد تولید ریشه و اندام هوایی از کالوس حاصل و وزن تر کالوس ریزنمونه­های گیاه رازیانه ( F. vulgare) در شرایط درون شیشه­ای

Table 2- Variance analysis of the effect of different types and concentrations of plant growth regulators on the percentage of callus production, the percentage of root and shoot production from the resulting callus tissue and callus fresh weight of (F. vulgare) in in vitro

منبع تغییرات

Source of Variation

df

 

 

 

MSمیانگین مربعات

 

 

 

 

تولید کالوس (%)

Callus production (%)

 

تولید ریشه (%)

Root production (%)

تولید اندام هوایی (%)

Shoot production (%)

وزن تر کالوس (گرم)

Fresh weight of callus (gr)

 تیمار

Treatment

64

1739.81 **

 

2546.05 **

2003.50 **

1.35 **

 

خطا

Error

130

50.12

 

41.29

31.89

0.01

 

CV%

-

10.59

 

34.08

   31.24

                 15.62

 

   ns, ** and *: Non-significant and significant at 1 and 5 % level of probability, respectively.

طبق نتایج حاصل از جدول مقایسه میانگین­ها (جدول3)، اختلاف معنی­داری بین انواع اکسین و غلظت­های مختلف آن درون محیط کشت پایه MS از نظر درصد تولید کالوس از ریزنمونه­های گیاه رازیانه و وزن تر آن و درصد تولید ریشه و اندام هوایی از بافت کالوس حاصل مشاهده شد. با توجه به نتایج جدول 3، از نظر درصد تولید کالوس از ریزنمونه­های گیاه رازیانه بین تیمار شاهد (محیط کشت فاقد تنظیم کننده­های رشد گیاهی) و سایر تیمارهای هورمونی در غلظت­های مختلف اختلاف معنی­داری مشاهده شد. بیشترین درصد تولید کالوس (33/93 درصد) مربوط به محیط کشت MS حاوی NAA در غلظت 2 میلی­گرم برلیتر است که به طور معنی­داری بیشتر از تیمار شاهد و سایر تیمارهای هورمونی است. طبق نتایج به دست آمده از نظر انواع اکسین مورد استفاده جهت تولید کالوس نیز بین 2,4-D و NAA (در اکثر موارد) اختلاف معنی­داری مشاهده نشد. همچنین استفاده از IBA نسبت به 2,4-D یا NAA به طور معنی­داری درصد تولید کالوس از ریزنمونه­های گیاه رازیانه را کاهش داد. علاوه­بر این بین غلظت­های مختلف اکسین مورد استفاده نیز در همه موارد (2,4-D یا NAA یا IBA) استفاده از 2 میلی­گرم بر لیتر نسبت به سایر غلظت­های استفاده شده بهترین عملکرد را از نظر درصد تولید کالوس داشته است (جدول3). از نظر درصد تولید ریشه از کالوس حاصل نیز بین تیمار شاهد و سایر تیمارهای مورد استفاده اختلاف معنی­دار کاملاً مشخصی مشاهده شد (جدول3). به طوری­که کمترین میزان تولید ریشه از بافت کالوس ریز نمونه گیاه رازیانه (صفر درصد) مربوط به تیمار شاهد (محیط کشت فاقد تنظیم کننده­های رشد گیاهی) است. این درحالی است که بیشترین میزان تولید ریشه (37/31 درصد) نیز مربوط به محیط کشت دارای 2 میلی­گرم بر لیتر  2,4-Dبود. طبق نتایج حاصل در بین انواع اکسین مورد استفاده، بیشترین درصد تولید ریشه از بافت کالوس حاصل مربوط به 2,4-D بود. کمترین درصد تولید کالوس نیز مربوط به NAA در غلظت­های مختلف است (جدول3). از نظر غلظت­های مختلف اکسین مورد استفاده نیز بالاترین درصد تولید ریشه از کالوس حاصل درون محیط کشت­های دارای 2,4-D یا NAA مربوط به غلظت 2 میلی­گرم بر لیتر بود، این امر در مورد IBA مربوط به غلظت 4 میلی­گرم بر لیتر مشاهده شد. همچنین از نظر درصد تولید اندام هوایی نیز بین نوع اکسین و انواع غلظت­های آن اختلاف معنی­داری بین تیمار شاهد و تیمارهای هورمونی مشاهده شد. بیشترین درصد تولید اندام هوایی از بافت کالوس حاصل (96/25 درصد) مربوط به محیط کشت حاوی 1 میلی­گرم بر لیتر 2,4-D است. به طور کلی استفاده از 2,4-D در غلظت­های مختلف در مقایسه با NAA یا IBA از نظر درصد تولید اندام هوایی از بافت کالوس حاصل عملکرد معنی­دار و بهتری داشته است (جدول3). همچنین از نظر میانگین وزن تر نمونه کالوس­های جمع­آوری شده بین محیط کشت­های دارای اکسین در غلظت­های مختلف و تیمار شاهد (محیط کشت فاقد تنظیم­کننده­های رشد گیاهی) اختلاف معنی­داری از نظر آماری مشاهده شد. بیشترین میزان وزن تر کالوس ثبت شده (07/1 گرم) مربوط به محیط کشت MS حاوی 2 میلی­گرم بر لیتر NAA بود. از سوی دیگر، بر اساس نتایج به دست آمده (جدول3)، استفاده از NAA در غلظت­های مختلف در مقایسه با 2,4-D و IBA به طور معنی­داری از نظر وزن تر بافت کالوس حاصل عملکرد بهتری داشته است.

جدول3- تأثیر نوع و غلظت اکسین بر درصد تولید کالوس، درصد تولید ریشه و اندام هوایی از کالوس و وزن تر کالوس حاصل از ریزنمونه­های گیاه رازیانه (F. vulgare) در شرایط درون­شیشه­ای

Table 3- Effect of type and concentration of auxin on the percentage of callus production, the percentage of root and shoot production from the resulting callus tissue and callus fresh weight of (F. vulgare) in in vitro

تیمار

Treatment

تولید کالوس (%)

Callus production (%)

تولید ریشه (%)

Root production (%)

تولید اندام هوایی (%)

Shoot production (%)

وزن تر کالوس (گرم)

Fresh weight of callus (gr)

 

 

MS (control)

7.33 g *

0 h

15.13 bc

0.08 f

 

MS+ 0/5 2,4-D

61.33 ef

19.16 cde

15.83 bc

0.51 de

 

MS+1 2,4-D

72 cd

24.71 abc

25.96 a

0.63 cde

 

MS+2 2,4-D

81.33 bc

31.37 a

19.16 b

0.73 bc

 

MS+4 2,4-D

80.66 bc

30.26 ab

11.80 cd

0.73 bc

 

MS + 0/5 NAA

72 cd

7.51 g

12.08 cd

0.68 cd

 

MS +1 NAA

84.4 b

8.75 g

6.25 def

0.90 ab

 

MS +2 NAA

93.33 a

12.91 efg

4.16 ef

1.07 a

 

MS + 4 NAA

83.33 b

11.66 fg

2.50 f

0.96 a

 

MS+ 0/5 IBA

51.33 f

15.97 def

11.25 cde

0.45 e

 

MS+ 1 IBA

56.66 ef

20.69 cd

9.58 c-f

0.49 de

 

MS+ 2 IBA

64.44 de

23.60 bc

5 def

0.60 cde

 

MS+ 4 IBA

58.66 ef

25.82 abc

2.5 f

0.51 de
                     

   *Different letters indicate a significant difference at the 5% probability level.

طبق نتایج حاصل از جدول مقایسه میانگین داده­ها (جدول4)، از نظر اثر متقابل نوع اکسین- نوع سیتوکینین مورد استفاده درون محیط کشت گیاهی بین تیمار شاهد (محیط کشت فاقد تنظیم­کننده­های رشد گیاهی) و تیمارهای هورمونی مورد استفاده از نظر درصد تولید کالوس از ریزنمونه­های گیاه رازیانه و وزن تر آن و نیز درصد تولید ریشه و اندام هوایی از کالوس حاصل اختلاف معنی­داری مشاهده شد. بیشترین درصد تولید کالوس و وزن تر آن (به ترتیب 95 درصد و 16/1 گرم) زمانی مشاهده شد که از ترکیب هورمونی NAA به همراه Kin استفاده شده بود. با توجه به جدول-4، استفاده از Kin به عنوان سیتوکینین در ترکیب با 2,4-D یا NAA و یا IBA در مقایسه یا BAP از نظر درصد تولید بافت کالوس و وزن تر آن عملکرد معنی­دار و بهتری داشته است. از نظر درصد تولید ریشه و اندام هوایی از بافت کالوس حاصل نیز بیشترین مقدار به ترتیب (14/33 و 32/19 درصد) مربوط به محیط کشت MS+ 2,4-D + BAP بود. برخلاف نتایج حاصل از درصد تولید بافت کالوس و وزن تر آن، استفاده از Kin به عنوان سیتوکینین درصد تولید ریشه و اندام هوایی از بافت کالوس حاصل را در مقایسه با BAP به طور معنی­داری کاهش می­دهد.

جدول4- اثر متقابل نوع اکسین-نوع سیتوکینین بر درصد تولید کالوس، درصد تولید ریشه و اندام هوایی از کالوس و وزن تر کالوس حاصل از ریزنمونه­های گیاه رازیانه (F. vulgare) در شرایط درون­شیشه­ای

 Table 4- The interaction effect of auxin type-cytokinin type on the percentage of callus production, the percentage of root and shoot production from the resulting callus tissue and callus fresh weight of (F. vulgare) in in vitro

تیمار

Treatment

تولید کالوس (%)

Callus production (%)

تولید ریشه (%)

Root production (%)

تولید اندام هوایی (%)

Shoot production (%)

وزن تر کالوس (گرم)

Fresh weight of callus (gr)

 

 

MS (control)

40.78 e *

7.10 d

7.51 cd

0.25 d

 

MS+ 2,4-D + BAP

72.91 c

33.14 a

29.32 a

0.59 c

 

MS+ 2,4-D + Kin

85.83 b

25.51 b

13.80 b

0.87 b

 

MS+ NAA + BAP

83.83 b

14.59 c

9.63 bc

0.92 b

 

MS+ NAA + Kin

95 a

7.29 d

4.16 d

1.16 a

 

MS+ IBA + BAP

57.91 d

22.91 b

9.89 bc

0.52 c

 

MS+ IBA + Kin

61.25 d

26.72 b

5.46 cd

0.61 c
                     

   * Different letters indicate a significant difference at the 5% probability level.

طبق نتایج به دست آمده از مقایسه میانگین داده­ها (شکل1-A)، بین تیمار شاهد (محیط کشت فاقد تنظیم­کننده­های رشد گیاهی) و اکثر تیمارهای هورمونی از نظر درصد تولید کالوس از ریزنمونه­های گیاه رازیانه اختلاف معنی­داری مشاهده شد. بین تیمار شاهد و محیط کشت فقط حاوی سیتوکینین (BAP و Kin در غلظت­های 1/0 و 5/0 میلی­گرم بر لیتر) از نظر آماری اختلاف معنی­داری مشاهده نشد. از سوی دیگر، استفاده از اکسین­های مختلف بدون حضور سیتوکینین (در غلظت­های مختلف) به طور معنی­داری درصد تولید کالوس را نسبت به تیمار شاهد افزایش داد. همچنین استفاده از اکسین و سیتوکینین در غلظت­های مختلف (در ترکیب با همدیگر و در یک محیط کشت) به ویژه استفاده از BAP یا Kin به همراه 2,4-D و BAP یا Kin به همراه NAA درصد تولید کالوس از ریزنمونه­های گیاه رازیانه را نسبت به تیمار شاهد، تیمار هورمونی فقط دارای سیتوکینین (BAP یا Kin) و تیمار هورمونی فقط دارای اکسین به طور معنی­داری افزایش داد (شکل1-A). همچنین استفاده از BAP یا Kin به عنوان سیتوکینین در ترکیب با IBA در مقایسه با تیمار هورمونی فقط دارای اکسین، تأثیر معنی­داری بر درصد تولید کالوس از ریزنمونه­های گیاه رازیانه نداشته است. همچنین استفاده از Kin (به ویژه در غلظت­های پائین­تر) به همراه NAA (در اکثر غلظت­ها) درصد تولید کالوس ریزنمونه­های گیاه رازیانه را در مقایسه با اکثر تیمارهای هورمونی افزایش داد. به­طوری که بالاترین درصد تولید کالوس (100 درصد) از ریزنمونه­های گیاه رازیانه بیشتر در این تیمار هورمونی مشاهده شد (شکل2- Bو C). طبق نتایج به دست آمده بین تیمارهای هورمونی فقط دارای اکسین (در غلظت­های مختلف) استفاده از NAA در غلظت 2 میلی­گرم بر لیتر (به تنهایی و بدون ترکیب با سیتوکینین) به طور معنی­داری درصد تولید کالوس را در مقایسه با سایر تیمارها تا 66/76 درصد افزایش داد. از سوی دیگر در بین محیط کشت­های دارای فقط اکسین کمترین درصد تولید کالوس (40 درصد) مربوط به محیط کشت­های MS+­0/5 2,4-D و MS+­0/5 IBA بود (شکل1-A). همچنین طبق نتایج حاصل از مقایسه میانگین داده­ها (شکل1-B)، بین تیمار شاهد و اکثر تیمارهای هورمونی از نظر درصد تولید ریشه از بافت کالوس حاصل اختلاف معنی­داری مشاهده شد. از سوی دیگر بین تیمار شاهد (محیط کشت فاقد تنظیم کننده­های رشد گیاهی) و محیط کشت فقط دارای سیتوکینین (BAP یا Kin) و محیط کشت MS دارای NAA (5/0 یا 1 یا 2 میلی­گرم بر لیتر) به همراه 1/0 میلی­گرم بر لیتر Kin اختلاف معنی­داری مشاهده نشد. همچنین بین محیط کشت­های دارای فقط اکسین (در غلظت­های مختلف) نیز اختلاف معنی­داری مشاهده نشد. همچنین بین محیط کشت­های دارای فقط 2,4-D یا IBA (در غلظت­های مختلف) و محیط کشت­های دارای 2,4-D یا IBA به همراه BAP یا Kin (در غلظت­های مختلف) اختلاف معنی­داری از نظر آماری مشاهده شد (شکل1-B). امّا اختلاف معنی­داری بین محیط کشت دارای فقط NAA و محیط کشت دارای NAA به همراه BAP یا Kin مشاهده نشد. بیشترین درصد تولید ریشه از بافت کالوس حاصل شده از ریز نمونه گیاه رازیانه (100 درصد) مربوط به محیط کشت MS+2 2,4-D+0/1BAP بود (شکل2-D و E). از نظر درصد تولید اندام هوایی از بافت کالوس حاصل نیز بین تیمار شاهد (محیط کشت فاقد تنظیم­کننده­های رشد گیاهی) و اکثر تیمارهای هورمونی اختلاف معنی­داری مشاهده نشد (شکل1-C). همانطوری که در شکل1-C مشاهده می­شود از نظر درصد تولید ریشه از بافت کالوس حاصل از ریزنمونه­های گیاه رازیانه بین تیمار شاهد و محیط کشت­های دارای فقط سیتوکینین (BAP یا Kin در غلظت­های مختلف) و همچنین محیط کشت­های دارای 2,4-D (در غلظت­های 5/0 یا 1 یا 2 یا 4 میلی­گرم بر لیتر) به همراه BAP (در غلظت­های 1/0 یا 5/0 میلی­گرم بر لیتر) اختلاف معنی­داری مشاهده شد. همچنین بیشترین درصد تولید اندام هوایی از بافت کالوس حاصل (53/55 درصد) نیز مربوط به محیط کشت MS+1 2,4-D+0/5BAP بود (شکل1-C) (شکل2-F وG). همچنین از نظر وزن کالوس به دست آمده نیز بین تیمار شاهد (محیط کشت فاقد تنظیم­کننده­های رشد گیاهی) و محیط کشت­های دارای فقط سیتوکینین اختلاف معنی­داری مشاهده نشد. اما بین تیمار شاهد و محیط کشت­های دارای فقط اکسین و محیط کشت­های دارای اکسین به همراه سیتوکینین (در غلظت­های مختلف و در ترکیب با یکدیگر) اختلاف معنی­داری مشاهده شد (شکل1-D). بیشترین میزان وزن کالوس جمع­آوری شده از محیط­های کشت (43/1 گرم) مربوط به محیط کشت MS+2NAA+0.1BAP بود (شکل1-D) (شکل2-H). همانطوری­که از شکل 1-D استنباط می­شود استفاده از 2,4-D در ترکیب با Kin و نیز استفاده از NAA در ترکیب با BAP یا Kin تأثیر بیشتری بر وزن تر کالوس حاصل از ریز نمونه­های گیاه رازیانه دارد. نوع (زبر یا نرم بودن بافت کالوس حاصل) و رنگ آن در جدول7 و به صورت کیفی نشان داده شده است. طبق نتایج حاصل اکثر کالوس­های حاصل از ریز نمونه­های گیاه رازیانه به رنگ قهوه­ای و از نوع نرم بودند (شکل2-K). امّا نمونه کالوس­های به دست آمده از محیط­ کشت­های حاوی غلظت­های مختلف NAA به همراه 1/0 میلی­گرم بر لیتر Kin سبز رنگ و از نوع زبر بودند (شکل2-I و L).

شکل 1 - تأثیر تنظیم­کننده­های رشد گیاهی: A) درصد تولید کالوس، B و C) درصد تولید ریشه و اندام هوایی از بافت کالوس حاصل (به ترتیب) و D) وزن تر بافت کالوس حاصل.

Figure 1- Effect of plant growth regulators: A) Callus production percentage,( B and C) The percentage of root and shoot production from the resulting callus tissue (respectively) and( D) Fresh weight of the resulting callus tissue

شکل 2- استقرار و تولید کالوس توسط ریزنمونه­های گیاه رازیانه (F. vulgare) در شرایط درون­شیشه­ای. A) تیمار کنترل محیط کشت MS فاقد تنظیم کننده­های رشد گیاهی، B وC ) تولید بافت کالوس از محیط کشت  MS+1 NAA+0.1 Kin و MS+2 NAA+0.1 Kin (به ترتیب)، D و­E) تولید ریشه از بافت کالوس و محیط کشت MS+4 2,4-D+0.1 BAP و  MS+2 2,4-D +0.1 BAP(به ترتیب)، G و F) تولید شاخساره از بافت کالوس محیط کشت MS+0.5 BAP و MS+1 2,4-D +0.5 BAP (به ترتیب)، H) بیشترین وزن تازه ثبت شده بافت کالوس MS+2 NAA +0.1 BAP، I) تولید بافت کالوس با رنگ سبز محیط کشت MS+0.5 BAP و MS+2 NAA +0.1 Kin، J) تولید بافت کالوس با رنگ سفید محیط کشت MS+0.5 NAA +0.1 BAP، K) تولید بافت کالوس با رنگ قهوه­ای محیط کشت MS+2 IBA +0.1 BAP، L) تولید بافت کالوس زبر محیط کشت MS+2 2,4-D +0.5 BAP.

Figure 2- Establishment and production of callus tissue by fennel (F. vulgare) explants in in vitro. A) Control (MS without plant growth regulators), B and C) production of callus tissue (MS+1NAA+0/1Kin and MS+2NAA+0/1Kin (respectively)), D and E) root production from callus tissue (MS+4 2,4-D+0/1BAP and MS+2 2,4-D +0/1BAP(respectively)), F and G) shoot production from callus tissue (MS+0/5BAP and MS+1 2,4-D + 0/5BAP(respectively)), H) The highest fresh weight of callus recorded (MS+2 NAA + 0/1BAP), I) callus with green color (MS+2 NAA + 0/1Kin), J) callus with white color (MS+0.5 NAA + 0/1BAP), K) callus with brown color (MS+2 IBA + 0/1BAP), L) rough callus (MS+2 2,4-D+0/5BAP).

بررسی میزان ترکیبات بیوشیمیایی نمونه کالوس­های منتخب

نتایج حاصل از تجزیه داده­ها نشان دادند انواع مختلف تنظیم­کننده­های رشد گیاهی به­طور معنی­داری و در سطح احتمال 1 درصد بر میزان فعالیت آنزیم­های پراکسیداز و کاتالاز، میزان تجمع اسید آمینه پرولین، فلاونوئید­کل و آنتوسیانین نمونه کالوس­های گیاه رازیانه (F. vulgare) در شرایط درون­شیشه­ای موثر است (جدول6).

 جدول6- تجزیه واریانس تأثیر تنظیم­کننده­های رشد گیاهی بر ویژگی­های بیوشیمیایی و متابولیت­های ثانویه نمونه کالوس­های گیاه رازیانه (F. vulgare) در شرایط درون­شیشه­ای

Table 6- Mean square effect of plant growth regulators on biochemical characteristics and secondary metabolites of callus samples of (F. vulgare) in in vitro conditions

میانگین مربعات  MS

درجه آزادی

df

منبع تغییرات

Source of Variation

 

 

آنتوسیانین

Anthocyanin

فلاونوئید

Flavonoid

پرولین

 Perolin

کاتالاز

 Catalase

پراکسیداز Peroxidase

 

 

 

12.76 **

0.19 **

0.38 **

492908.51 ns

14257.30 **

24

تیمار

Treatment

 

1.18

0.003

0.006

50088.23

1443.85

50

خطا

Error

 

17.16

27.38

8.24

29.97

32.14

-

CV (%) ضریب تغییرات
                     

   ns, ** and *: Non-significant and significant at 1 and 5 % level of probability, respectively.

طبق نتایج حاصل از مقایسه میانگین داده­ها (جدول7)، از نظر فعالیت آنزیم پراکسیداز و کاتالاز، تجمع اسیدآمینه پرولین، میزان فلاونوئیدکل و آنتوسیانین نمونه کالوس­های گیاه رازیانه (F. vulgare) جمع­آوری شده بین اکثر تیمارها اختلاف معنی­داری مشاهده نشد.

جدول 7- تأثیر تنظیم­کننده­های رشد گیاهی مختلف بر میزان فعالیت آنزیم­های پراکسیداز و کاتالاز، میزان تجمع اسید آمینه پرولین، فلاونوئید­کل و آنتوسیانین نمونه کالوس­های گیاه رازیانه (F. vulgare) در شرایط درون­شیشه­ای

Table 7- The effect of different plant growth regulators on the activity level of peroxidase and catalase enzymes, the amount of amino acid accumulation of proline, flavonoids, and anthocyanin in callus samples of fennel plant (F. vulgare) in in vitro conditions

Anthocyanin

(µmol.g-1 )

Flavonoid                      (mg Quercetin.g-1)

Prolin

(µg.mg-1)

Catalase

protein) ­(µmol H2O2 min-1 mg-1

Peroxidase

protein) ­(µmol H2O2 min-1 mg-1

Cell media (MS)

5.55 efg

0.10 fg

0.62 ij

708.80 bc

89.54 def *

MS (free)

 

9.50 a

0.29 abc

0.62  ij

608.62 c

100.23 def

1 2,4-D+0.1 BAP

 

7.17 b-e

0.20 c-f

0.60  j

689.33 bc

95.13 def

2 2,4-D+0.1 BAP

 

8.48 ab

0.38 a

0.83 fg

575.38 c

87.81 def

1 2,4-D+0.5 BAP

 

9.80 a

0.34 ab

0.73 g-j

515.43 c

80.02 ef

2 2,4-D+0.5 BAP

 

5.85 d-g

0.15 def

0.60  j

480.19 c

70.40 e

1 2,4-D+0.1 Kin

 

7.77 a-d

0.20 c-f

0.73  g-j

498.11 c

80.13 ef

2 2,4-D+0.1 Kin

 

7.77 a-d

0.24 cd

0.68 hij

444.16 c

67.73 e

1 2,4-D+0.5 Kin

 

8.68 ab

0.21cde

0.75 ghi

424.44 c

86.36 ef

2 2,4-D+0.5 Kin

 

6.16 c-g

0.17 def

0.70 g-j

465.13 c

75.30 ef

1 NAA+0.1 BAP

 

7.97 abc

0.20 c-f

0.75 ghi

443.63 c

68.67 e

2 NAA+0.1 BAP

 

8.98 ab

0.22 cde

0.75 ghi

389.44 c

80.88 ef

1 NAA+0.5 BAP

 

8.88 ab

0.38 a

0.75 ghi

487.85 c

87.80 def

2 NAA+0.5 BAP

 

5.15 e-h

0.04 g

0.79 fgh

743.40 bc

96.84 def

1 0.5 NAA+0.1 Kin

 

5.75 d-g

0.11efg

0.99 e

627.40 c

100.89 def

2 NAA+0.1 Kin

 

6.06 c-g

0.15 def

0.78 fgh

459.22 c

73.68 ef

1 NAA+0.5 Kin

 

6.46 c-f

0.21 cde

0.9 ef

383.65 c

66.53 e

2 NAA+0.5 Kin

 

4.44 f-i

0.15 def

1.01 e

691.42 bc

101.15 def

1 IBA+0.1 BAP

 

4.44 f-i

0.17 def

1.23 cd

1064.85 b

161.36 cd

2 IBA+0.1 BAP

 

3.03 i

0.25 bcd

1.79  a

1813.89 a

273.45 a

1 IBA+0.5 BAP

 

4.44 f-i

0.18 def

1.29 c

1081.99 b

149.78cde

2 IBA+0.5 BAP

 

5.55 e-h

0.15 def

 1.20 cd

794.58 bc

104.09 def

1 IBA+0.1 Kin

 

3.43 hi

0.19 def

1.46 b

1105.03 b

203.93 bc

2 IBA+0.1 Kin

 

4.24 ghi

0.18 def

1.16 d

1516.20 a

227.37 b

1 IBA+0.5 Kin

 

3.13  hi

0.21cde

1.53b

1610.75 a

265.64 b

2 IBA+0.5 Kin

 
                       

* Different letters in each column indicate statistically significant differences at the 5% probability level of Duncan's Multiple Range Test (DMRT).

بیشترین میزان فعالیت آنزیم پراکسیداز و کاتالاز (به ترتیب 45/273 و 89/1813 µmol H2O2 min-1 mg-1) و تجمع اسیدآمینه پرولین (79/1 میکروگرم در میلی­گرم) مربوط به محیط کشت MS+1 IBA+0.5 BAP بود. همچنین بیشترین مقدار فلاونوئید (38/0mg.­Quercetin.g-1 ) مربوط به محیط کشت MS+2 NAA+0.5 BAP و بیشترین مقدار آنتوسیانین (80/9 µmol.g-1) نیز مربوط به محیط کشت MS+2 2,4-D+0.5 BAP مشاهده شدند.

 بحث

تنظیم­کننده­های رشد گیاهی به­ویژه اکسین‌ها و سیتوکینین‌ها در شرایط طبیعی و آزمایشگاهی (in vitro) رشد و نمو سلول‌های گیاهی را کنترل می­کنند. اکسین‌ها و سیتوکینین‌ها در تقسیم سلولی، رشد سلولی و اندام­زایی گیاهان نقش بسیار مهمی دارند. اکسین‌ها با اسیدی نمودن دیواره سلولی و افزایش قدرت توسعه‌پذیری آن منجر به رشد سلولی می‌شوند. سیتوکینین‌ها با تنظیم سنتز پروتئین‌های درگیر در شکل‌گیری دوک‌های میتوزی به­طور مستقیم چرخه سلولی را تحت تأثیر قرار می‌دهند (Noruzpour et al., 2022). در پژوهش حاضر، از 2,4-D، NAA و IBA به عنوان اکسین و BAP و Kin به عنوان سیتوکینین (در غلظت­های مختلف) جهت بررسی تأثیر این نوع از تنظیم­کننده­های رشد گیاهی (به تنهایی و در ترکیب با یکدیگر) بر درصد تولید کالوس، درصد تولید ریشه و اندام هوایی از بافت کالوس حاصل و وزن تر کالوس تولید شده از ریزنمونه­های گیاه رازیانه درون محیط کشت پایه MS استفاده شد. طبق نتایج حاصل در این پژوهش افزودن NAA در غلظت 2 میلی­گرم بر لیتر به درون محیط کشت در مقایسه با سایر اکسین­ها در غلظت­های مختلف درصد تولید کالوس از ریزنمونه­های گیاه رازیانه (F. vulgare) و وزن تر آن را به طور معنی­داری افزایش می­دهد (جدول3). استفاده از NAA به جای 2,4-D و IAA میزان القا و تولید کالوس در ریزنمونه­های گیاه مارچوبه (Asparagus densiflorus) را تا 100 درصد افزایش می­دهد (Toma & Rsheed, 2012). طبق یافته­ها بیشترین درصد تولید کالوس و وزن تر آن زمانی به دست آمد که از غلظت­های بالاتر اکسین­های مختلف (2 و 4 میلی­گرم بر میلی لیتر) درون محیط کشت استفاده شده است (جدول3). همچنین طبق نتایج این پژوهش، از نظر نوع و غلظت­های مختلف اکسین مورد استفاده درون محیط کشت، بالاترین درصد تولید ریشه از بافت کالوس حاصل زمانی به دست آمد که از 2,4-D (به تنهایی و یا در ترکیب با سیتوکینین­های مختلف) و در غلظت 2 میلی­گرم بر لیتر استفاده شده باشد (جدول3). از نظر درصد تولید اندام هوایی از بافت کالوس به دست آمده نیز استفاده از 2,4-D و در غلظت 1 میلی­گرم بر لیتر (به تنهایی و یا در ترکیب با سیتوکینین­های مختلف) به طور معنی­داری عملکرد بهتری نسبت به سایر اکسین­های مورد استفاده درون محیط کشت داشته است (جدول3). از سوی دیگر، طبق یافته­ها (جدول-4)، استفاده از Kin (به تنهایی و یا در ترکیب با اکسین­های مختلف) در ترکیب با اکسین های مختلف به جای BAP تأثیر معنی­داری بر درصد تولید کالوس و وزن تر کالوس حاصل داشته است. مطابق با نتایج پژوهش حاضر، Zare et al., (2021)  بیان کردند استفاده از Kin در مقایسه با BA تولید کالوس از ریزنمونه­های گیاه Stevia rebaudiana را به طور معنی­داری افزایش می­دهد (Zare et al., 2021). همچنین مشخص شد بیشترین درصد تولید ریشه و اندام هوایی از بافت کالوس ریزنمونه­های گیاه رازیانه مربوط به محیط کشت دارای BAP به عنوان سیتوکینین و 2,4-D به عنوان اکسین بوده است (جدول-4). نتایج نشان دادند از نظر درصد تولید ریشه و اندام هوایی استفاده از BAP به جای Kin عملکرد بهتری دارد.et al., (2018)  Hu، با بررسی نوع سیتوکینین مورد استفاده جهت تولید اندام هوایی از بافت کالوس گیاه Papaver pseudo-orientale نشان دادند بیشترین درصد تولید اندام هوایی مربوط به محیط کشت حاوی 5/0 میلی­گرم بر لیتر Kin (در ترکیب با اکسین­های مختلف) بود (Hu et al., 2018). از سوی دیگر، طبق نتایج این پژوهش (شکل1-A وD) از نظر درصد تولید کالوس و وزن تر حاصل از ریزنمونه های گیاه رازیانه، بین محیط کشت دارای فقط سیتوکینین (Kin یا BAP) و تیمار شاهد (محیط کشت فاقد تنظیم­کننده­های رشد گیاهی) اختلاف معنی­داری مشاهده نشد. امّا با افزودن اکسین به محیط کشت دارای سیتوکینین درصد تولید کالوس و وزن تر آن به طور معنی­داری افزایش یافت (شکل­1-A  و D). استفاده از Kin  در غلظت­های 5/0، 1 و 2 میلی­گرم برلیتر (به تنهایی و بدون اکسین) امکان تولید کالوس از ریزنمونه­های گیاه پریوش(Catharanthus roseus) را در مقایسه با ترکیب اکسین/سیتوکینین به طور معنی­داری کاهش می­دهد (Rahman et al., 2019).et al (2012)  Arivalagan, با بررسی تأثیر انواع تنظیم­کننده­های رشد گیاهی بر میزان تولید کالوس حاصل از ریزنمونه­های گیاه endogynous Sauropus بیان کردند هیچ بافت کالوسی از محیط کشت حاوی Kin به تنهایی حاصل نمی­شود و افزودن NAA به عنوان اکسین به محیط کشت دارای Kin تولید کالوس را القا می­کند (Arivalagan et al., 2012). همچنینet al (2019)  Rahman,، نشان دادند افزودن Kin (به ویژه در غلظت­های پائین­تر) به عنوان سیتوکینین به محیط کشت حاوی اکسین القا و تولید کالوس را در ریزنمونه­های پریوش در مقایسه با محیط کشت حاوی فقط اکسین را به طور معنی­داری افزایش می­دهد (Rahman et al., 2019)، که با نتایج این پژوهش مطابقت دارد. با توجه به شکل 1-A و D استفاده هم زمان از Kin یا BAP (به عنوان سیتوکینین) و 2,4-D یا NAA یا IBA (به عنوان اکسین) درون محیط کشت جهت القا و تولید کالوس از ریزنمونه­های گیاه رازیانه، عملکرد معنی­دار و بهتری را نسبت به محیط کشت دارای فقط اکسین یا فقط سیتوکینین نشان می­دهد. طبق نتایج حاصل از مقایسه میانگین داده­ها استفاده از Kin  در ترکیب با NAA درصد تولید کالوس از ریزنمونه های گیاه رازیانه را افزایش می دهد (شکل1-A). همچنین بر اساس شکل­1-A در اکثر موارد کاهش غلظت سیتوکینین­ها و افزایش غلظت اکسین­ها تولید کالوس را در ریزنمونه­های گیاه رازیانه افزایش داد که نتایج این پژوهش با یافته­های سایر پژوهشگران بسیار مشابه است. افزایش غلظت NAA از 5/0 میلی­گرم بر لیتر به 1 و 2 میلی­گرم بر لیتر در کنار کاهش غلظت Kin درون محیط کشت MS میزان کالوس­زایی ریزنمونه­های گیاه رازیانه (F. vulgare) را افزایش می­دهد (Hussian et al., 2021). این درحالی است که طبق نتایج پژوهش حاضر، بین تیمار شاهد (محیط کشت فاقد تنظیم­کننده­های رشد گیاهی) و محیط کشت های دارای فقط اکسین و اکسین/سیتوکینین از نظر درصد تولید ریشه از بافت کالوس به دست آمده از ریزنمونه­های گیاه رازیانه در شرایط درون­شیشه­ای اختلاف معنی­داری مشاهده شد (شکل1-B). بیشترین درصد تولید ریشه از بافت کالوس نیز (50 درصد) مربوط به محیط کشت MS+4 2,4-D+1.0 BAP بود.(2020)  & Sharma Mandal، با بررسی تأثیر محیط کشت­های مختلف جهت باززایی گیاه رازیانه Foeniculum vulgare بیان کردند بهترین محیط کشت و تیمار هورمونی برای تولید ریشه از بافت کالوس این گیاه محیط کشت SH به همراه 1 میلی­گرم بر لیتر NAA و 5/0 میلی­گرم بر BAP است (Sharma & Mandal, 2020). از نظر درصد تولید اندام هوایی از بافت کالوس گیاه رازیانه نیز مشخص شد استفاده از BAP در مقایسه با Kin شاخساره­های بیشتری تولید می­شود (شکل1-C). بیشترین درصد تولید اندام هوایی (53/55 درصد) مربوط به محیط کشت MS+1 2,4-D+5.0 BAP بود. بهترین محیط کشت به همراه تنظیم­کننده­های رشد گیاهی جهت تولید شاخه­های نابه­جا از بافت کالوس گیاه رازیانه Foeniculum vulgare در فرایند باززایی گیاهی مربوط به محیط کشت SH حاوی 5/0 میلی گرم بر لیتر NAA به همراه 1 میلی­گرم بر لیتر BA است (Sharma & Mandal, 2020). کشت سلول­های گیاهی یک منبع مناسب و مهم برای تولید متابولیت­های ثانویه با ارزش در اکثر گیاهان است (Espinosa-Leal et al., 2018). براساس فرضیه توتی‌پتانسی، هر سلول گیاهی تمام اطلاعات ژنتیکی گیاه والد را داراست و می‌تواند دامنه وسیعی از مواد بیوشیمیایی که در گیاه کامل یافت می­شود را تولید کند (Fehér, 2019). نوع و مقدار اکسین یا سیتوکنین، یا نسبت اکسین به سیتوکنین، تشکیل و تجمع متابولیت­های ثانویه را در سلول­های گیاهی کشت شده تغییر می­دهد (Hussain et al., 2021). استفاده از BAP، 2ip و زآتین تأثیر مناسبی بر سطح متابولیت­های ثانویه در بسیاری از آزمایش­های داشته است. همچنین مشخص شده است جیبرلیک­اسید و آبسیزیک­اسید، تولید آنتوسیانین را در برخی از کشت­های درون­شیشه متوقف می­سازند (Hu et al., 2018). در بسیاری از موارد مشاهده شد تنظیم­کننده رشد گیاهی 2,4-D مانع تولید متابولیت­های ثانویه می­شود. برای مثال، حذف 2,4-D و یا جایگزینی آن با NAA یا IAA سبب افزایش تولید آنتوسیانین در کشت تعلیقی carota Daucus، نیکوتین در کشت تعلیقی Nicotiana tabacum، شیکونین در کشت تعلیقی Portulaca grandiflora  می­شود (Srivastava, 2018). با وجود این، تحریک توسط 2,4-D در بیوسنتز کارتنوئید در کشت تعلیقی Daucus carota و تولید آنتوسیانین در کشت کالوس Oxolis linearis گزارش شده است ((Nartop, 2018; Ozsan et al., 2018. سیتوکنین­ها بسته به نوع متابولیت و گونه گیاهی اثرات متفاوتی دارند. برای مثال، Kin تولید آنتوسیانین را در کشت  Salix tetrasperma Roxb تحریک کرده ولی مانع تولید آن در کشت سلول جنس Populus می­شود (Shahid & Anis, 2018).

نتیجه­ گیری کلی

 با توجه به یافته­های پژوهش حاضر، استفاده از سیتوکینین و اکسین در ترکیب با یکدیگر امکان القاء و تولید کالوس با وزن تر بالا در ریزنمونه­های گیاه رازیانه (F. vulgare) را فراهم می­کند. این در حالی است که استفاده از سیتوکینین و اکسین به تنهایی درون محیط کشت تأثیر مناسبی بر میزان تولید کالوس ندارد. همچنین نتایج حاصل نشان دادند استفاده از Kin به عنوان سیتوکینین در غلظت 1/0 میلی­گرم بر لیتر و NAA به عنوان اکسین در غلظت­های 2 و 4 میلی­گرم بر لیتر تأثیر مثبت و معنی­داری بر درصد تولید کالوس و وزن کالوس حاصل از ریزنمونه­های گیاه رازیانه (F. vulgare) داشته است. در این پژوهش بیشترین درصد تولید ریشه و اندام هوایی از بافت کالوس حاصل زمانی به دست آمد که از 2,4-D (به عنوان اکسین) و BAP (به عنوان سیتوکینین) استفاده شد. همچنین طبق یافته­های پژوهش حاضر، مشخص شد بین میزان فعالیت آنزیم­های پراکسیداز، کاتالاز، تجمع اسیدآمینه پرولین، فلاونوئید و آنتوسیانین و تنظیم­کننده­های رشد گیاهی مختلف، اختلاف معنی­داری وجود دارد.

References

Arivalagan, U., Alderson, P. G., & Nagarajan, A. (2012). Effect of growth hormones on callus induction of Sauropus androgynous (Sweet shoot). Annals of Biological Research, 3, 4668-4674.

Asree, H. J., & Khirallah, A. A. (2020). Induced callus of Fennel plant (Foeniculum Vulgare Mill.) in InVitro. Plant Archives, 20(1), 2949-2952.

Bates, L. S., Waldren, R. A., & Teare, I. (1973). Rapid determination of free proline for water-stress studies. Plant and Soil, 39, 205-207. https://doi.org/10.1007/bf00018060 

Bradford, M. M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, 72(1-2), 248-254. https://doi.org/10.1006/abio.1976.9999 

Chanes, B., & Mahely, A. (1996). Assay of catalase and peroxidase. Methods in Enzymology. Academic Press. New York, 2, 764-791.

Chang, C. C., Yang, M. H., Wen, H. M., & Chern, J. C. (2002). Estimation of total flavonoid content in propolis by two complementary colometric methods. Journal of Food and Drug Analysis, 10(3), 3. https://doi.org/10.38212/2224-6614.2748 

Espinosa-Leal, C. A., Puente-Garza, C. A., & García-Lara, S. (2018). In vitro plant tissue culture: means for production of biological active compounds. Planta, 248, 1-18. https://doi.org/10.1007/s00425-018-2910-1 

Fehér, A. (2019). Callus, dedifferentiation, totipotency, somatic embryogenesis: what these terms mean in the era of molecular plant biology? Frontiers in Plant Science, 10, 536. https://doi.org/10.3389/fpls.2019.00536 

Han, Y., Jin, X. l., Wu, F. b., & Zhang, G. P. (2011). Genotypic differences in callus induction and plant regeneration from mature embryos of barley (Hordeum vulgare L.). Journal of Zhejiang University Science B, 12, 399-407. https://doi.org/10.1631/jzus.b1000219 

Hu, Z., Weijian, L., Yali, F., & Huiquan, L. (2018). Gibberellic acid enhances postharvest toon sprout tolerance to chilling stress by increasing the antioxidant capacity during the short-term cold storage. Scientia Horticulturae, 237, 184-191. https://doi.org/10.1016/j.scienta.2018.04.018 

Hussain, S., Nanda, S., Zhang, J., Rehmani, M. I. A., Suleman, M., Li, G., & Hou, H. (2021). Auxin and cytokinin interplay during leaf morphogenesis and phyllotaxy. Plants, 10(8), 1732. https://doi.org/10.3390/plants10081732 

Khan, R. U., Fatima, A., Naz, S., Ragni, M., Tarricone, S., & Tufarelli, V. (2022). Perspective, opportunities and challenges in using fennel (Foeniculum vulgare) in poultry health and production as an eco-friendly alternative to antibiotics: a review. Antibiotics, 11(2), 278. https://doi.org/10.3390/antibiotics11020278 

MacAdam, J. W., Nelson, C. J., & Sharp, R. E. (1992). Peroxidase activity in the leaf elongation zone of tall fescue. Plant Physiology, 99(3), 872-878. https://doi.org/10.1104/pp.99.3.872 

Magyar-Tábori, K., Dobránszki, J., Teixeira da Silva, J. A., Bulley, S. M., & Hudák, I. (2010). The role of cytokinins in shoot organogenesis in apple. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC), 101, 251-267. https://doi.org/10.1007/s11240-010-9696-6 

Mehra, N., Tamta, G., & Nand, V. (2021). A review on nutritional value, phytochemical and pharmacological attributes of Foeniculum vulgare Mill. Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, 10(2), 1255-1263. https://doi.org/10.22271/phyto.2021.v10.i2q.13983 

Nartop, P. (2018). Engineering of biomass accumulation and secondary metabolite production in plant cell and tissue cultures. In Plant Metabolites and Regulation under Environmental Stress, pp. 169-194. Elsevier. https://doi.org/10.1016/b978-0-12-812689-9.00009-1 

Nikolova, M., Evstatieva, L., & Nguyen, T. D. (2011). Screening of plant extracts for antioxidant properties. Botanica Serbica, 35(1), 43-48.

 

 

 

Noruzpour, M., Zare, N., Asghari-Zakaria, R., & Sheikhzade-Mosadegh, P. (2019). Vaccinium arctostaphylos L. Iranian Journal of Horticultural Science, 50(2), 435-48. https://doi.org/10.22059/ijhs.2018.252894.1415

Noruzpuor, M., Zare, N., Asghari Zakaria, R., & Sheikhzade, P. (2022). Effects of benomyl and cytokinin on in vitro contamination and growth of Vaccinium arctostaphylos L. node explants. Iranian Journal of Medicinal and Aromatic Plants Research, 38(1), 150-165. https://doi.org/10.22092/ijmapr.2022.356225.3070

Noshad, M., & Falah, F. (2020). Study the chemical composition of essential oil of Foeniculum vulgare and antioxidant activity and its cell toxicity. Journal of Food Science and Technology, 17(104), 124-133. https://doi.org/10.52547/fsct.17.104.124

Ozsan, T., Kanmaz, M. G., & Onus, A. N. (2018). In vitro carrot (Daucus carota L.) regeneration: a study on the use of 2, 4-D and activated charcoal. International Journal of Agricultural and Natural Sciences, 1(1), 29-32.

 Rahman, N. N. A., Rosli, R., Kadzimin, S., & Hakiman, M. (2019). Effects of auxin and cytokinin on callus induction in Catharanthus roseus (L.) G. Don. Fundamental and Applied Agriculture, 4(3), 928-932. https://doi.org/10.5455/faa.54779 

Rasheed, D. M., Emad, A. M., Ali, S. F., Ali, S. S., Farag, M. A., Meselhy, M. R., & Sattar, E. A. (2021). UPLC‐PDA‐ESI/MS metabolic profiling of dill shoots bioactive fraction; evidence of its antioxidant and hepatoprotective effects in vitro and in vivo. Journal of Food Biochemistry, 45(6), e13741. https://doi.org/10.1111/jfbc.13741 

Saremirad, A., Azarkish, R., & Abbasi, S. (2021). Optimization callus induction in Fennel (Foeniculum vulgare M.). Journal of Medicinal Plants Biotechnology, 6(2), 1-18.

Shahid, A., & Anis, M. (2018). Production and enhancement of anthocyanin pigment in callus cultures of Salix tetrasperma Roxb. The Journal of Plant Science Research, 34(1), 9-14. https://doi.org/10.32381/jpsr.2018.34.01.2 

Sharma, P., & Mandal, J. (2020). In vitro shoot regeneration of hypocotyl explants of Foeniculum vulgare-a culinary and medicinal herb. International Research Journal on Advanced Science Hub, 2(Special Issue ICAMET 10S), 53-61. https://doi.org/10.47392/irjash.2020.199 

Srivastava, A. (2018). In vitro mutagenic studies of Portulaca Spp. (Doctoral dissertation, Maharaja Sayajirao University of Baroda (India)).

Toma, R. S., & Rsheed, K. A. (2012). In vitro propagation through seed culture and regeneration of Asparagus densiflorus L. through callus cultures derived from hypocotyls. International Journal of Pure and Applied Sciences and Technology, 9(2), 94.

Wagner, G. J. (1979). Content and vacuole/extravacuole distribution of neutral sugars, free amino acids, and anthocyanin in protoplasts. Plant Physiology, 64(1), 88-93. https://doi.org/10.1104/pp.64.1.88 

Yang, I. J., Lee, D. U., & Shin, H. M. (2015). Anti-inflammatory and antioxidant effects of coumarins isolated from Foeniculum vulgare in lipopolysaccharide-stimulated macrophages and 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate-stimulated mice. Immunopharmacology and Immunotoxicology, 37(3), 308-317. https://doi.org/10.3109/08923973.2015.1038751 

Zare, N., Noruzpour, M., & Sheikhzadeh, P. (2021). Effects of yeast extract on growth, biochemical properties and production of secondary metabolites in in vitro cultures of Vaccinium arctostaphylos L. Iranian Journal of Plant Biology, 13(1), 37-54. [in persian] https://doi.org/10.22108/IJPB.2021.125157.1230

Statistics
Article View: 1,024
PDF Download: 365


Journal management system. designed by sinaweb