نقش سیانوباکتری‌های مولد EPS در خاک‌های بیابانی

مقدمه

خاک بستری زنده در محیط زیست و اکوسیستم‌های خشکی محسوب می‌شود که از مواد معدنی و آلی ساخته شده است. کیفیت خاک با ویژگی‌های فیزیکی، شیمیایی و زیستی سنجیده می‌شود (1). میکروارگانیسم‌های خاک، تنها ۵ درصد از حجم کل خاک کره زمین را تشکیل می‌دهند؛ اما تأثیرات بسیار شگرفی بر زیستگاه‌های خاکی می‌گذارند (2). فعالیت میکروارگانیسم‌های خاک بر بافت خاک، پایداری خاک، کیفیت و باروری خاک بسیار مؤثرند و نیز نقش مهمی در تجزیة ترکیبات مختلف و ماکرومولکول‌ها و در چرخة عناصری مانند نیتروژن، گوگرد و فسفر نقش دارند (3).

سیانوباکتری‌ها^[1]، شاخه‌ا‌ی از باکتری‌های موجود در خاک‌اند (4) که جزء پروکاریوت‌های گرم منفی، فتوتروف و مولد اکسیژن هستند. برخی از سیانوباکتری‌ها قادر به تثبیت ازت اتمسفر هستند (5). سیانوباکتری‌ها از سال‌ها پیش به‌عنوان تولیدکننده‌های پلی‌ساکاریدی خارجی^[2]  (EPS)شناخته شده‌اند؛ این ترکیب به‌صورت یک غلاف نازک یا ضخیم یا به‌صورت لایه موسیلاژی در اطراف سلول‌ها قرار دارد (6). این پوشش سبب نگه‌داشتن آب در اطراف سلول می‌شود و به این طریق سیانوباکتری‌ها، مقاومت زیادی در برابر خشکی پیدا می‌کنند. سیانوباکتری‌ها، به‌دلیل ویژگی‌های منحصربه‌فرد ساختار سلولی خود، در بسیاری از اکوسیستم‌های خشکی و آبی یافت می‌شوند و نقش مهمی در این زیستگاه‌ها دارند (6، 7، 8).

سیانوباکتری‌ها از میکروارگانیسم‌های پیش‌قراول و مؤثر در تشکیل پوسته‌های زیستی به‌خصوص در اکوسیستم‌های خشک و نیمه‌خشک هستند (9، 10). پوسته‌های زیستی خاک^[3] از گروه‌های ماکروسکوپی موجودات زنده مانند خزه‌ها، گلسنگ‌ها، گیاهان ساده و پست و نیز گروه‌های میکروسکوپی همچون سیانوباکتری‌ها، ریزجلبک‌ها، قارچ‌ها، باکتری‌ها و آرکی‌ها تشکیل شده‌اند (6، 11، 12). سیانوباکتری‌ها با ترشح مواد کربوهیدراتی که عمده آن را EPS تشکیل می‌دهد، نقش مهمی در اتصال ذرات خاک به یکدیگر دارند و موجب بهبود پایداری بافت خاک می‌شوند. از دیگر اثرات مفید حضور سیانوباکتری‌ها بر خاک، علاوه ‌بر افزایش مقدار نیتروژن، افزایش مواد آلی خاک و به‌دنبال آن غنی‌سازی خاک و افزایش مواد غذایی ناشی از تجزیة پیکره مردة باکتری‌هاست (10، 12، 13، 14). تنفس خاک (15)، افزایش سطح رطوبت خاک (16)، کاهش فرسایش آبی و بادی خاک و پایداری خاک توسط این موجودات در بسیاری از منابع علمی گزارش شده‌اند (13). همچنین پوسته‌های زیستی با تثبیت خاک می‌توانند به‌عنوان روشی برای بیابان‌زدایی مطرح شوند.

با توجه به اینکه کشور ایران سطوح بیابانی‌ متعددی دارد (17)، می‌توان از روش‌های گوناگونی مانند روش‌های زیستی برای بیابان‌زدایی استفاده کرد که امروزه شایان توجه بسیاری از دانشمندان در حوزة محیط زیست است؛ ازجمله روش‌های زیستی مهم در بیابان‌زدایی، تقویت پوسته‌های زیستی است.

مواد و روش‌ها.

سویه‌های استفاده‌شده در این تحقیق: در این مطالعه از ۱۹ سویة سیانوباکتریایی استفاده شد که به‌ترتیب ۹ سویه (از شماره ۱ تا ۹ در جدول ۱) متعلق به بانک میکروبی دانشگاه الزهرا ^(س) و ۱۰ سویه (از شماره ۱۰ تا ۱۹ در جدول ۱) متعلق به بانک میکروبی دانشگاه شهید بهشتی بود. تمامی سویه‌های سیانوباکتریایی، از خاک استان‌های مختلف کشور جدا شده‌اند که اطلاعات آنها در جدول ۱ ارائه شده است.

غربالگری برترین سویة سیانوباکتریایی مولد کربوهیدرات ترشحی: کشت سیانوباکتری‌ها: به‌منظور غربالگری سیانوباکتری‌های مولدِ بیشترین مقدار کربوهیدرات ترشحی، تعداد حدود 5 کلنی از کشت تازه هر ۱۹ سویة سیانوباکتری رشدیافته از محیط کشت جامدBG-11  (18) برداشته شد. سپس به ارلن‌هایی با حجم ۱۰۰ میلی‌لیتر و حاوی ۵۰ میلی‌لیتر محیط کشت مایع  BG-11تلقیح و در دمای ۲۵ درجه سانتی‌گراد با نورفلورسنت سفید و با شدت ۳۰۰۰ لوکس و طول نوردهی ۱۶ ساعت روشنایی و ۸ ساعت تاریکی به ‌مدت ۳ هفته در شیکر انکوباتور با دور  rpm۹۰ گرماگذاری شد تا مقدار مناسبی زیست‌توده برای سنجش مقدار کربوهیدرات به دست آمد. تجربه نشان داد در این شرایط سویه‌های سیانوباکتری رشد خوبی دارند.

سنجش مقدار کربوهیدرات ترشحی سیانوباکتری: زیست‌تودة سیانوباکتری‌ها به مدت ۳۰ دقیقه در دور g۱۲۶۰ سانتریفیوژ شد (19). سپس مایع رویی جدا و برای سنجش میزان کربوهیدرات ترشحی به روش فنول - اسید سولفوریک استفاده شد (20).

جدول 1- سویه‌های استفاده‌شده در پژوهش

تشکیل پوستة زیستی در خاک توسط ۳ سویة منتخب سیانوباکتری.

تهیه زیست‌توده سیانوباکتریایی: سه سویة Anabaena sphaerica، Geitlerinema.sp و Nostoc pruniformeکه بیشترین مقدار کربوهیدرات ترشحی را مطابق روش فنول - اسید سولفوریک تولید کرده بودند، برای مراحل بعدی آزمون‌ها انتخاب شدند. دراین مرحله به‌منظور تهیه زیست‌تودة سیانوباکتریایی، ابتدا ۹۰۰ میلی‌لیتر محیط کشت مایع BG-11 در بطری‌های ۱ لیتری (شکل ۱) استریل شد. پس از آن، به مقدار مساوی از ۳ سویة سیانوباکتریایی به درون بطری‌ها تلقیح شد. هوادهی به میزان ۳ لیتر در دقیقه توسط پمپ انجام شد. در مسیر شیلنگ‌های هوادهی، فیلتر استریل ۲/۰ میکرومتری قرار داده شد تا از ورود آلودگی‌های محیطی و میکروبی جلوگیری شود. سپس بطری‌های کشت در شرایط مشابه قبلی گرماگذاری شد. پس از گذشت ۴ هفته، از زیست‌تودة به‌دست‌آمدة سیانوباکتری‌ها به‌منظور تلقیح به خاک استفاده شد.

تهیه و آماده‌سازی خاک: خاک استفاده‌شده در این تحقیق خاک ضعیف با مقدار کم نیتروژن و ماده آلی و نیز بدون پوشش گیاهی و کشت بود که از عمق ۱۵-۰ سانتی متری سطح خاک موجود در مؤسسه تحقیقات خاک و آب برداشته شد. این خاک طی دو مرحله الک شد تا بافت آن همگن شود. در جدول ۲ ویژگی‌های این خاک ارائه شده‌اند.  

شکل ۱- الف) Anabaena sphaerica، ب) Nostoc pruniforme، پ)Geitlerinema.sp  زیست‌تودة به‌دست‌آمده را در ۳ سویة برتر سیانوباکتری نشان می‌دهد.

جدول 2- ویژگی‌های شیمیایی و فیزیکی خاک استفاده‌شده در این پژوهش

آزمایش‌های گلدانی: تعداد ۱۴ گلدان به ابعاد ارتفاع ۱۰ سانتی‌متر، طول آن ۲۵ سانتی‌متر و عرض ۵/۲۱ سانتی‌متر تهیه شدند و در هر گلدان ۲ کیلوگرم خاک غیرسترون ریخته و میزان رطوبت نسبی خاک برابر با ۸۰ درصد تنظیم شد (9).

تلقیح ۳ سویة منتخب سیانوباکتری به خاک: مجموعه آزمایش‌های گلدانی با ۵ نوع تیمار انتخاب و برای هر تیمار ۳ تکرار و برای کنترل ۲ تکرار در نظر گرفته شد. الف) تیمار ۱: خاک بدون تلقیح سیانوباکتری و آبیاری‌شده با ۲۰۰ میلی‌لیتر محیط کشتBG-11  (کنترل)، ب) تیمار ۲: خاک با تلقیح ۲۰۰ میلی‌لیتر زیست‌تودة Geitlerinema.sp، پ) تیمار ۳: خاک با تلقیح ۲۰۰ میلی‌لیتر زیست‌تودة Nostoc pruniforme، ت) تیمار ۴: خاک با تلقیح ۲۰۰ میلی‌لیتر زیست‌تودة Anabaena sphaerica، ج) تیمار ۵: خاک با تلقیح ۲۰۰ میلی‌لیتر از مخلوط 3 زیست‌تودة سویه‌های سیانوباکتریایی منتخب که برای تهیه تیمار 5 از هر سویة سیانوباکتریایی ۲۰۰ میلی‌لیتر برداشته و با یکدیگر مخلوط شد. سپس به هر گلدان مقدار ۲۰۰ میلی‌لیتر از این مخلوط سیانوباکتریایی تلقیح شد. گفتنی است حجم مشخص و مشابهی از بیومس سیانوباکتری‌ها برای این منظور تلقیح شد.

نحوه نگهداری گلدان‌ها: به هر گلدان، در ۲ نوبت روز اول و روز بیستم مقدار 200 میلی‌لیتر زیست‌تودة سیانوباکتری اضافه شد. تمامی گلدان‌ها، به مدت ۴۵ روز در شرایط مشابه قبلی گرماگذاری شدند که برای رشد سیانوباکتری‌ها گفته شده بود. آبیاری گلدان‌ها به روش وزنی و به‌صورت ۳ بار در هفته با محیط کشت مایع BG-11 فاقد نیتروژن رقیق‌شده به نسبت 1:1 با آب انجام شد (9).

بررسی ویژگی‌های فیزیکی و شیمیایی خاک: پس از گذشت ۴۵ روز از رشد سیانوباکتری‌ها، به‌منظور سنجش پارامترهای مختلف فیزیکی و شیمیایی، خاک از عمق ۱-۰ سانتی‌متری سطح خاک گلدان‌ها برداشته شد. سپس این نمونه‌های خاک، در هوای آزمایشگاه خشک شدند. به‌منظور سنجش مقدار pH خاک، ۲۰ گرم از خاک الک‌شده، توزین و ۵۰ میلی‌لیتر آب مقطر به آن اضافه شد و به مدت ۲ ساعت روی شیکر قرار گرفت و درنهایت pH خاک اندازه‌گیری شد (21). هدایت الکتریکی،‌ وزن مخصوص ظاهری خاک (21)، درصد پایداری خاکدانه در آب (WSA)^[4] (22)، میانگین وزنی قطر ذرات خاک (MWD)^[5] (23)، نیتروژن کل خاک به روش کجلدال (24) و کربن آلی کل (25) در آزمایشگاه خاک‌شناسی مؤسسه جنگل‌ها و مراتع کشور انجام شدند.

.بررسی استرئومیکروسکوپی و میکروسکوپ الکترونی روبشی^[6] پوسته‌های زیستی: پس از گذشت ۴۵ روز از رشد سیانوباکتری‌ها روی خاک‌های مدنظر، برای مشاهده و بررسی تغییرات سطحی، از هر تیمار خاک، قالب ۱ سانتی‌متری جدا شد و پس از خشک‌شدن در هوای آزمایشگاه، سطح خاک توسط استرئومیکروسکوپ مشاهده و عکسبرداری شد. همچنین تشکیل پوسته‌های زیستی سطح تیمارهای ذکرشدة خاک توسط میکروسکوپ الکترونی روبشی مدل TESCAN VEGA3 بررسی و تصویربرداری شد.

نتایج

.نتایج غربالگری سویه‌های منتخب سیانوباکتریایی مولد بیشترین مقدار کربوهیدرات ترشحی: از میان ۱۹ سویة ذکرشده، با در نظر گرفتن بیشترین مقدار زیست‌توده و کربوهیدرات تولیدشده (جدول ۳) Anabaena sphaerica،Geitlerinema.sp  و Nostoc pruniforme از میان سایر سویه‌ها به‌‌عنوان سویه‌های برتر انتخاب شدند. به‌منظور تشکیل پوستة زیستی، زیست‌تودة این سه سویه به خاک تلقیح شد.

نتایج تلقیح سویه‌های برتر سیانوباکتریایی بر برخی ویژگی‌های خاک و تشکیل پوسته‌های زیستی: انواع تیمارهای اعمال‌شده بر خاک در جدول 4 ارائه شده‌اند.

جدول ۳- مقدارکربوهیدرات ترشحی در سویه‌های سیانوباکتریایی

جدول ۴- انواع تیمارهای خاک

.نتایج تلقیح سویه‌های برتر سیانوباکتریایی بر .ویژگی‌های فیزیکی خاک

الف- سنجش وزن مخصوص ظاهری خاک: وزن مخصوص ظاهری خاک در تیمار ۵ برابر با ۴/۱ گرم بر سانتی‌متر‌ مکعب، در تیمارهای شماره ۲ و ۳ برابر با ۶/۱ گرم بر سانتی‌متر ‌مکعب و در تیمارهای ۱ و ۴ برابر با ۵/۱ گرم بر سانتی‌متر ‌مکعب بود (شکل ۲- الف).

.ب- سنجش میانگین وزنی قطر ذرات خاک: بیشترین میانگین وزنی قطر ذرات خاک در تیمار ۲ برابر با ۷۳/۰ میلی‌متر، در خاک کنترل برابر با ۶۱/۰ میلی‌متر و در تیمار‌های ۳، ۴ و ۵ به‌ترتیب برابر با ۵۲/۰، ۴۷/۰ و ۵۹/۰ میلی‌متر بود (شکل ۲- ب).

پ- درصد پایداری خاکدانه: بیشترین مقدار پایداری خاکدانه در تیمار ۲ مشاهده شد که برابر با ۵۲/۰ بود. این پارامتر در تیمار ۱ و ۵ برابر با ۴۹/۰ و در تیمار‌های ۳ و ۴ به‌ترتیب برابر با ۴۷/۰ و ۴۶/۰ بود (شکل ۲- ت).

شکل۲- تغییر ویژگی‌های فیزیکی خاک شامل الف) وزن مخصوص ظاهری خاک، ب) میانگین وزن قطر ذرات خاک، ت) پایداری خاکدانه در آب، در خاک کنترل و خاک تیمارشده با سویه‌های سیانوباکتری‌ها نشان داده شده است. تیمار ۱ خاک کنترل، تیمار ۲ خاک تلقیح‌شده با Geitlerinema.sp، تیمار ۳ خاک تلقیح‌شده با Nostoc pruniforme، تیمار ۴ خاک تلقیح‌شده با Anabaena sphaerica، تیمار ۵ خاک تلقیح‌شده با زیست‌تودة مخلوط هر ۳ سویة سیانوباکتریایی است.

.نتایج تلقیح سویه‌های برتر سیانوباکتریایی بر .ویژگی‌های شیمیایی خاک

الف- سنجش درصد نیتروژن کل خاک: نتایج سنجش‌ها نشان می‌دهند مقدار درصد نیتروژن کل خاک پس از ۴۵ روز، در خاک کنترل به مقدار ۰۴/۰، در تیمارهای 2 و ۴ برابر با ۰۶/۰ و تیمارهای ۳ و ۵ به مقدار ۰۵/۰ افزایش یافته‌ است (شکل ۳- الف).

ب- سنجش درصد کربن آلی کل خاک: نتایج آزمایش‌ها نشان می‌دهند مقدار کل کربن آلی خاک تیمارهای 4 و 5 به‌ترتیب برابر با 42/0 و 43/0 است و در مقایسه با کنترل و تیمار‌های ۲ و ۳ که به‌ترتیب برابر با ۲۹/۰، ۲۹/۰ و ۳۹/۰ هستند، به‌طور چشمگیری افزایش یافته است (شکل۳- ب).

ت- سنجش pH خاک: نتایج نشان می‌دهند مقدار اسیدیتة خاک‌ تیمار ۲، برابر با ۸۹/۷ است و در مقایسه با خاک کنترل و تیمارهای ۳، ۴ و ۵ که به‌ترتیب برابر با ۷۵/۷، ۷۴/۷، ۷۹/۷ و۸۰/۷ هستند، افزایش یافته است (شکل ۳- ت).

ث- سنجش هدایت الکتریکی خاک: میزان هدایت الکتریکی خاک تحت تیمار ۳، برابر با ۴/۱۴ دسی‌سیمنس بر متر است که در مقایسه با خاک کنترل و تیمارهای ۲، ۴ و ۵، به‌ترتیب برابر با ۹، ۹، ۱۰ و ۲/۱۱ دسی‌سیمنس بر متر، بیشتر است (شکل ۳- ث).

شکل ۳- تغییرات ویژگی‌های شیمیایی خاک شامل الف) درصد نیتروژن کل خاک، ب) درصد کربن آلی خاک، ت) pH خاک و ث) هدایت الکتریکی خاک در خاک کنترل و تیمارشده با سیانوباکتری‌ها. تیمار ۱ خاک کنترل، تیمار ۲ خاک تلقیح‌شده با Geitlerinema.sp، تیمار ۳ خاک تلقیح‌شده با Nostoc pruniforme، تیمار ۴ خاک تلقیح‌شده با Anabaena sphaerica و تیمار ۵ خاک تلقیح‌شده با زیست‌تودة مخلوط ۳ سویة سیانوباکتریایی است.

..نتایج بررسی ظاهری پوسته‌های ‌زیستی خاک‌های تیمارشده با سیانوباکتری.

نتایج ظاهری و میکروسکوپی خاک کنترل: شکل ۴ تصاویر به‌دست‌آمده با دوربین عکاسی، استرئومیکروسکوپ و میکروسکوپ الکترونی روبشی از سطح خاک کنترل است که فقط با محیط کشت مایع رقیق‌شدة  BG-11فاقد نیتروژن آبیاری شده است که تغییرات چشمگیری در سطح خاک کنترل، طی دورة گرماگذاری مشاهده نمی‌شود. همان‌طور که در شکل میکروسکوپ الکترونی روبشی (۴- ث) مشاهده می‌شود، ذرات خاک کاملاً پراکنده‌اند و اتصال محکمی بین ذرات دیده نمی‌شود.

.نتایج ظاهری و میکروسکوپی خاک تلقیح‌شده با Geitlerinema.sp: شکل ۵ مربوط به تصاویر به‌دست‌آمده با دوربین عکاسی و استرئومیکروسکوپ از سطح خاک تیمار ۲ در روز‌های مختلف است که نشان‌دهندة رشد سیانوباکتری‌ها و استقرار آنها بر سطح خاک طی زمان گرماگذاری است. همچنین حضور پوستة زیستی‌ با ضخامت کم نیز در سطح خاک، به خوبی با چشم غیرمسلح دیده می‌شود. تصاویر استرئومیکروسکوپی، لایه‌ای از سیانوباکتری مورد اشاره را بر سطح خاک به خوبی نشان می‌دهد. شکل ۶ تصاویر میکروسکوپ الکترونی روبشی از سطح خاک تیمار ۲ است که لایه‌ای از رشته‌های سیانوباکتریایی و EPS تولیدشده توسط آنها را نشان می‌دهند که ذرات خاک را به خوبی پوشش داده‌اند.

شکل ۴- الف) تصویر روز هفتم سطح خاک کنترل، ب) تصویر روز چهل و پنجم سطح خاک کنترل، ت) تصویر استرئومیکروسکوپی سطح خاک کنترل در روز چهل و پنجم، ث) تصویر میکروسکوپ الکترونی روبشی سطح خاک کنترل با بزرگنماییmµ 20 در روز چهل و پنجم

شکل ۵- الف) تصویر روز هفتم سطح خاک تیمار ۲، ب) تصویر روز چهل و پنجم سطح خاک تیمار ۲، ت) تصویر استرئومیکروسکوپی سطح خاک تیمار ۲ در روز چهل و پنجم

شکل ۶- تصاویر میکروسکوپ الکترونی روبشی از سطح خاک تیمار۲، الف) سطح خاک با بزرگنماییmµ  20، ب) همان زمینه با بزرگنمایی بیشتر، علامت ستاره حضور لایة EPS ضخیم را نشان می‌دهد که روی سلول‌ها و ذرات خاک را پوشانده است.

.نتایج ظاهری و میکروسکوپی خاک تلقیح‌شده با Nostoc prunifurme: شکل ۷ تصاویر به‌دست‌آمده با دوربین عکاسی و استرئومیکروسکوپ از سطح گلدان تیمار ۳ در روز‌های مختلف است که نشان‌دهندة حضور و رشد Nostoc prunifurme بر سطح خاک طی زمان گرماگذاری است. تشکیل پوستة زیستی با ضخامت کم نیز به خوبی با چشم غیرمسلح دیده می‌شود. شکل ۸ تصاویر به‌دست‌آمده با میکروسکوپ الکترونی روبشی از سطح خاک تیمار ۳ است که به خوبی حضور سیانوباکتری و لایة EPS را روی سطح خاک نشان می‌دهد.

شکل ۷- الف) تصویر روز هفتم سطح خاک تیمار 3، ب) تصویر روز چهل و پنجم خاک تیمار ۳، ت) تصویر استرئومیکروسکوپی سطح خاک تیمار ۳ که با علامت دایره به ضخامت پوستة زیستی تشکیل‌شده روی آن اشاره شده است.

شکل ۸- تصاویر میکروسکوپ الکترونی روبشی از سطح خاک تیمار ۳، الف) حضور سلول‌های سیانوباکتری و لایة EPS که روی ذرات خاک را پوشانده است، به خوبی دیده می‌شود و با علامت ستاره به آن اشاره شده است، ب) تصویر الف با بزرگنمایی بیشتر، ت) حضور رشته‌های EPS بین ذرات خاک که باعث اتصال آنها شده است و با علامت ستاره نشان‌دار شده است، به وضوح دیده می‌شود.

نتایج تیمار خاک با Anabaena sphaerica: شکل ۹ تصاویر تهیه‌شده با دوربین عکاسی و استرئومیکروسکوپ از سطح گلدان تیمار ۴ در روز‌های مختلف است که نشان‌دهندة حضور و رشد Anabaena sphaerica بر سطح خاک است. تشکیل پوستة زیستی روی خاک به خوبی با چشم غیرمسلح دیده می‌شود. بررسی عکس‌های الکترونی روبشی از سطح خاک تیمار ۴ در شکل 1۰، تغییرات سطح خاک را نسبت به کنترل و دیگر تیمار‌ها به خوبی نشان می‌دهد. همچنین حضور سیانوباکتری‌ها و EPS آنها بر سطح خاک مشاهده می‌شود؛ به‌طوری‌که ذرات خاک را کاملاً پوشانده و مانند یک سیمان زیستی روی سطح خاک را فراگرفته است.

شکل ۹- الف) تصویر روز اول سطح خاک تیمار 4، ب) تصویر روز چهل و پنجم سطح خاک تیمار ۴، ت) تصویر استرئومیکروسکوپی روز چهل و پنجم سطح خاک تیمار 4 و علامت دایره به ضخامت پوستة زیستی تشکیل‌شده روی آن اشاره دارد.

شکل ۱۰- تصویر میکروسکوپ الکترونی روبشی از سطح خاک تیمار ۴، الف) حضور سلول‌ها همراه با EPS به خوبی دیده می‌شود که با علامت ستاره مشخص شده است، ب) لایه‌های EPS مترشحه توسط سلول‌ها روی سطح خاک به خوبی مشاهده می‌شود و با علامت ستاره نشان‌دار شده است.

.نتایج‌ خاک‌ تلقیح‌‌شده ‌با مخلوط Anabaena sphaerica، Nostoc prunifurme وGeitlerinema.sp : شکل ۱۱ تصاویر تهیه‌شده با دوربین عکاسی و استرئومیکروسکوپ از سطح گلدان تیمار ۵ است که حضور و رشد سیانوباکتری‌ها بر سطح خاک را نشان می‌دهد؛ تشکیل پوستة زیستی‌ به خوبی در آن با چشم غیرمسلح دیده می‌شود. مقایسة چشمی تصاویر نشان می‌دهد میزان رشد در این تیمار کمتر از سایر تیمارها است. شکل ۱۲ تصاویر میکروسکوپ الکترونی روبشی از سطح خاک تیمار ۵، به خوبی حضور سلول‌های سیانوباکتریایی و لایة ضخیمی از EPS بر سطح خاک را نشان می‌دهد.

شکل ۱۱- الف) تصویر روز هفتم سطح خاک با تیمار 5، ب) تصویر روز چهل و پنجم سطح خاک با تیمار ۵، ت) تصویر استرئومیکروسکوپی روز چهل و پنجم سطح خاک با تیمار 5.

شکل ۱۲- تصاویر میکروسکوپ الکترونی روبشی از سطح خاک تیمار ۵، الف) در این تصویر حضور سلول‌های سیانوباکتریایی در سطح خاک با علامت ستاره مشخص شده است، ب) حضور لایة ضخیمی از EPS بر سطح خاک، باعث چسبندگی ذرات خاک شده و به‌صورت کامل سطح آن را پوشانده است و با علامت ستاره نشان‌دار شده‌اند.

بحث و نتیجه‌گیری

پلی ساکارید خارج سلولی (EPS) در سیانوباکتری‌ها به اشکال مختلفی دیده می‌شود که شامل پلی‌ساکارید خارج سلولی به‌صورت غلاف، کپسول لعابی و پلی‌ساکارید خارج سلولی آزادشده در محیط است (23، 24). در این پژوهش مقدار کربوهیدرات ترشحی موجود در مایع رویی کشت سیانوباکتری که شامل مونوساکارید، دی‌ساکارید و پلی‌ساکارید‌های خارج سلولی سیانوباکتریایی است، به روش پتل^[vii] و همکاران سنجیده شد (19). برای انتخاب سیانوباکتری برتر با بیشترین مقدار کربوهیدرات ترشحی، از روش فنول - اسید سولفوریک استفاده شد.

خاک استفاده‌شده در این تحقیق از مؤسسه تحقیقات خاک و آب تهیه شد. با توجه به ویژگی‌های شیمیایی و فیزیکی ارائه‌شده در جدول ۲، این خاک از لحاظ مواد مغذی جزء خاک‌های ضعیف و فقیر محسوب می‌شود و درصد کمی نیتروژن و ماده آلی دارد. ویژگی‌های خاک استفاده‌شده در این تحقیق با ویژگی‌های خاک نواحی بیابانی نیمه‌خشک که نیشا^[viii] و عیسی^[ix] و همکاران گزارش داده بود (27، 28) مشابه بود.

همان‌طور که قبلاً ذکر شد در این پژوهش، از خاک غیر‌سترون برای بررسی تشکیل پوستة زیستی استفاده شد؛ زیرا در شکل‌گیری و توسعة پوسته‌های زیستی، علاوه بر سیانوباکتری‌ها، دیگر میکروارگانیسم‌ها مانند ریزجلبک‌ها، قارچ‌ها، باکتری‌ها و آرکی‌ها نیز نقش بسیار مهمی دارند (12)؛ هرچند به نظر می‌رسد سیانوباکتری‌ها در این حوزه پیش قراول هستند. به‌منظور کوتاه‌کردن مدت زمان رشد سیانوباکتری‌ها و تشکیل پوسته‌های زیستی که حدود ۶ هفته به طول انجامید، میزان رطوبت خاک تا ۸۰ درصد افزایش یافت (29). در تحقیقات دیگری که نیشا و همکاران انجام دادند، مدت زمان رشد سیانوباکتری درخاک، با تأمین رطوبت حدود ۱۲ درصد و ۶ درصد، حدود 240 روز بوده است (27). نوع گلدان استفاده‌شده در پژوهش به‌صورت مستطیل و پهن انتخاب شد تا سطح بیشتری از خاک در مقابل نور قرار گیرد و شرایط برای نوردهی و رشد سیانوباکتری‌ها و به‌دنبال آن امکان تشکیل پوسته‌های زیستی بهتر فراهم شود. با توجه به  اینکه هدف، تشکیل پوسته‌های زیستی در مدت زمان کوتاه بود، تلقیح سیانوباکتری در دو نوبت انجام شد و به‌منظور بررسی امکان تثبیت نیتروژن توسط سویه‌ها و به‌دنبال آن افزایش مقدار نیتروژن خاک، از محیط کشت BG-11 فاقد نیتروژن برای آبیاری گلدان‌ها استفاده شد. وزن مخصوص ظاهری جزء ویژگی‌های فیزیکی مهم خاک محسوب می‌شود. دو عامل MWD وWSA  جزء شاخص‌های فیزیکی کیفیت خاک به شمار می‌روند. بیزونایس^[x] در گزارش خود MWD خاک‌های مختلف را به ۵ دسته تقسیم کرد: MWD<۴/۰ میلی‌متر نشان‌دهندة خاک بسیار ناپایدار، مقدار MWD در بازة 08/0-04/0 میلی‌متر خاک ناپایدار، مقدار MWD در بازة 3/1-08/0 میلی‌متر خاک تا حدی پایدار، مقدار MWD در بازة ۲-۳/۱ میلی‌متر خاک پایدار و مقدار MWD>۲ میلی‌متر خاک بسیار پایدار است (23). نتایج آنالیز این خاک‌ها نشان می‌دهند خاک‌های تحت تیمار در این پژوهش، در بازة ناپایدار قرار دارند؛ اگرچه مقدار MWD و WSA خاک تیمار ۲ به‌طور مشهودی افزایش یافت. این موضوع می‌تواند به حضور رشته‌های سیانوباکتری تلقیح‌شده در خاک و تأثیر چسبندگی غلاف پلی‌ساکاریدی تولیدشدة آنها نسبت داده شود که مشابه نتایج سایر محققان بوده است (28).

چنین به نظر می‌رسد که استفاده از سیانوباکتری‌ها در تشکیل پوستة زیستی، در خاک‌های خشک و ضعیف می‌تواند در افزایش مقدار نیتروژن، کربن و سایر مواد مغذی خاک مؤثر باشد (27). سیانوباکتری‌های تلقیح‌شده در تیمار ۴ جزء‌ سیانوباکتری‌های دارای هتروسیست هستند و به خوبی توانایی تثبیت نیتروژن را دارند. هنگامی که پیکرة سیانوباکتری وارد خاک می‌شود، می‌تواند مواد آلی را به خاک اضافه کند و این نتایج مشابه با گزارش‌های محققان دیگر است (28). گفتنی است آنزیم‌های نیتروژناز در pH اسیدی فعالیت بهتری دارند و در  pH قلیایی، تثبیت نیتروژن کمتر انجام می‌شود. در این مطالعه میزان pH خاک‌های تیمارشده نسبت به خاک کنترل افزایش یافته است. نتایج این پژوهش با نتایج نیشا و همکاران تفاوت دارد. آنها گزارش کردند تلقیح سیانوباکتری به خاک باعث کاهش چشمگیر pH خاک شد که می‌تواند به حضور اسیدهای اورونیک موجود در پلی‌ساکارید غلاف نسبت داده شود (27). هدایت الکتریکی یک محلول، جزء خواص الکتروشیمیایی محلول و شاخصی از مقدار املاح موجود در آن است. هر چقدر غلظت کاتیون‌ها و آنیون‌های حامل بار الکتریکی یک محلول افزایش یابد، هدایت الکتریکی آن نیز بیشتر می‌شود (21). نتایج تلقیح مخلوط سویه‌ها به خاک در تیمار 5 نشان می‌دهند میزان رشد سویه‌ها در این تیمار، کمتر از سایر تیمارها است که این کاهش می‌تواند به رقابت سویه‌ها یا اثرات آنتاگونیستی آنها نسبت داده شود.

در این بررسی سویة Anabaena sphaerica دارای بیشترین مقدار کربوهیدرات ترشحی، بیشترین میزان رشد و بیشترین مقدار زیست‌توده در مقایسه با دیگر سویه‌های مطالعه‌شده بود. به عبارت دیگر، با حضور این سیانوباکتری در خاک و با گذشت ۴۵ روز، پوسته‌های زیستی به خوبی تشکیل شدند. نتایج تصاویر کشت گلدان‌ها، استرئومیکروسکوپ و میکروسکوپ الکترونی روبشی از سطح خاک تیمارها نشان‌دهندة تفاوت‌های چشمگیری بین خاک تلقیح‌یافته و بدون تلقیح است که مشابه با گزارش مکوبلا و همکاران است. آنها دریافتند با تلقیح سیانوباکتری نوستوک^[xi] به خاک، اتصال ذرات و همچنین میزان کربن و نیتروژن خاک مطالعه‌شده افزایش یافته است (28). همچنین روگرز و برنز^[xii] بیان کردند تلقیح سیانوباکتری Nostoc muscorum به خاک ضعیف، تأثیرات مهمی بر بهبود ویژگی‌های فیزیکی و شیمیایی خاک می‌گذارد (30). مطالعات مشابه برای سویة Anabaena sphaerica دربارة جداسازی آن از خاک‌های خشک و شور است و چون این سویه توانایی تولید پلی‌ساکارید خارج سلولی را دارد، گزینة مناسبی برای تشکیل پوستة زیستی در خاک‌های بیابانی است (31). همچنین به‌دلیل تحمل شوری می‌تواند برای اصلاح خاک‌های شور و رشد و جوانه‌زنی بذرها کاندیدای مناسبی باشد (32).

در پژوهش حاضر براساس تولید بیشترین مقدار کربوهیدرات ترشحی، غربالگری اولیه از میان ۱۹ سویة سیانوباکتری انجام شد؛ درنهایت، سه سویة سیانوباکتریایی برای تلقیح به خاک و بررسی اثرات آنها بر ویژگی‌های خاک انتخاب شدند. نتایج مشاهدات میکروسکوپی به‌دست‌آمده نشان دادند هر سه سویة سیانوباکتریایی قادر به تشکیل پوسته‌های زیستی بر خاک بودند. سیانوباکتری Anabaena sphaerica به‌دلیل تولید حداکثر زیست‌توده و تولید EPS بیشتر، برای آزمون‌های بعدی پیشنهاد می‌شود. با توجه به اینکه سیانوباکتری‌ها موجوداتی فتوتروف‌اند و برای رشد به محیط‌های کشت غنی و پیچیده نیاز ندارند، استفاده از این سویه‌ها برای بهبود ویژگی‌های فیزیکی، شیمیایی و زیستی خاک مناطق خشک و بیابانی و تقویت پوسته‌های زیستی پیشنهاد می‌شود.

سپاسگزاری

این پروژه در مجموعة آزمایشگاهی دکتر شایسته سپهر دانشگاه الزهرا ^(س) و با حمایت معاونت محترم پژوهشی دانشگاه انجام شد که بدین ترتیب تقدیر می‌شود. از سرکار خانم دکتر شریعتمداری، استادیار محترم دانشکده علوم و فناوری زیستی دانشگاه شهید بهشتی، به‌دلیل در اختیار قرار دادن تعدادی از سویه‌های سیانوباکتری تشکر می‌شود.

[1]- Cyanobacteria

[2]- Exopolysaccharide

[3]- Biological soil crusts

[4]- Water Stable Aggregate

[5]- Mean Weight Diameter

[6]- Scanning Electron Microscope (SEM)

[vii]- Patel

[viii]- Nisha

[ix]- Issa

[x]- Bissonnais

[xi]- Nostoc

[xii]- Rogers & Burns