Genealogy of Lesser Whitethroat Subspecies (Sylvia Curruca Halimodendri) in Qeshm Island Using a Systematic Molecular Approach

مقدمه
ردۀ پرندگان یکی از بزرگ‌‌ترین رده‌‌های جانوری با ‏بیش از 10 هزار گونۀ شناخته‌‌شده است. راستۀ ‏گنجشک‌سانان (‏Passeriformes‏)‏‎ ‎بزرگ‌‌ترین راسته از ‏ردۀ پرندگان با بیش از 140 خانواده و‎ ‎بیش از 6500 گونۀ ‏شناخته‌‌شده در جهان است (‏Gill and Donsker, ‎‎2018‎‏). خانوادۀ سسک‌‌ها ‏‎(Sylviidae)‎‏ از راستۀ ‏گنجشک‌سانان یکی‎ ‎از خانواده‌‌هایی است که به‌‌دلیل ‏شباهت‌‌های ریختی زیاد، ابهامات متعددی در شناسایی و ‏طبقه‌‌بندی آنها وجود دارد. طبق چک‌لیست ‏Clements، ‏از معتبرترین چک‌لیست‌‌‌‌های طبقه‌‌بندی پرندگان، 99 ‏آرایه از خانوادۀ سسک‌‌ها تاکنون شناسایی شده است ‏‏(‏Clements et al., 2019‎‏). سسک گلوسفید کوچک ‏‏(‏Sylvia curruca‏) که نخستین‌‌بار در سال 1758 توسط ‏Carl Linné‏ توصیف شد، یکی از اعضای جنس ‏Sylvia‏ است که شباهت زیاد این گونه با سایر اعضای ‏این جنس و تغییرات تدریجی به‌‌صورت کشانه (‏cline‏)، ‏بررسی وضعیت آرایه‌‌شناسی این گونه را بسیار دشوار و ‏پیچیده کرده است؛ به طوری که بسیاری از پرنده‌شناسان ‏این آرایه را گونه‌‌ای چندسنخی می‌‌دانند که دربردارندۀ ‏زیرگونه‌های مختلفی است (‏Loskot, 2005‎‏ ‏Del ‎Hoyo et al., 1992;‎‏). این گونه در فهرست پرندگان ‏حمایت‌‌شدۀ جهانی قرار ندارد؛ اما وضعیت رده‌‌بندی آن ‏تا حد زیادی مبهم و پیچیده است. زیرگونه‌‌های احتمالی ‏آن در مناطق مختلف ممکن است یکی از زیرگونه‌های ‏S.c.curruca، ‏S.c.althaea، ‏S.c.minula، ‏S.c.blythi، ‏S.c.halimodendri، ‏S.c.margelanica‏ وS.c.zagrossiensis ‎‏ یا حتی ‏زیرگونه‌‌ای جدید قلمداد شود (‏Abdlizadeh et al., ‎‎2020‎‏ ‏Olsson et al., 2013;‎‏). این پرندگان ‏کوچک‌‌جثه به واسطۀ ارتباط‌‌هایی که با یکدیگر دارند، ‏این پتانسیل را دارند که به‌‌طور دائم، تغییراتی در ژنتیک و ‏همین‌‌طور ریخت‌‌شناسی آنها رخ دهد ‏‏(‏Böhning‐Gaese et al., 2003‎‏)؛ به همین دلیل ‏مطالعۀ تبارشناسی گونۀ سسک گلوسفید کوچک ازنظر ‏گونه‌‌زایی حائز اهمیت است (‏Olsson et al., 2013‎‏).‏
پژوهش‌‌های تبارشناسی اهمیت زیادی در توسعۀ علم ‏بیوسیستماتیک دارد و پیشرفت‌‌های صورت‌گرفته در ‏تبارزایی مولکولی، زمینه‌‌ساز طبقه‌‌بندی‌‌های مختلفی از ‏موجودات زنده شده است (‏Mayr, 1968‎‏). گفتنی است ‏که ‏DNA‏ میتوکندری بارها برای مطالعه و بازبینی روابط ‏فیلوژنتیک در گروههای متفاوت جانوری استفاده شده ‏است. ژن‌های میتوکندریایی به‌‌مراتب سریع‌تر از ژن‌های ‏هسته‌ای تکامل می‌یابند؛ درنتیجه توانایی بیشتری برای ‏نشان‌‌دادن تفاوت‌های موجود بین تاکسون‌های نزدیک ‏دارند (‏Aliabadian et al., 2012‎‏). به‌‌طور معمول از ‏این ژن‌ها به‌‌منظور نشان‌‌دادن واگرایی بین جمعیت‌هایی ‏که برای دورۀ زمانی به‌‌نسبت کوتاهی از یکدیگر جدا ‏شده‌اند، استفاده می‌شود. پیشرفت در روش‌‌های مولکولی، ‏دسترسی به نشانگرهای مختلف ‏DNA‏ را افزایش داده و ‏آنها را به ابزارهای مناسبی در مطالعات حفاظت ‌‌ژنتیکی و ‏تنوع زیستی مبدل کرده است (‏Avise, 2006; Haig, ‎‎2008‎‏)؛ بنابراین استفاده از داده‌‌های ژنتیکی یک گروه از ‏گونه‌‌ها در جایگاه راهکاری مفید در علم زیست‌‌شناسی ‏حفاظت شناخته شده است که در این بین داده‌‌های ‏ژنتیکی موجود در میتوکندری، یکی از ابزارها برای ‏بررسی تبارزایی حیات وحش به شمار می‌‌رود (‏Batista ‎et al., 2011‎‏). از بین ژن‌‌های موجود در ‏DNA‏ ‏میتوکندریایی، ژن‌‌های سیتوکروم ‏b‏ از دستۀ ژن‌‌های ‏کدکنندۀ پروتئین هستند که سریع‌‌تر تکامل می‌‌یابند و ‏این امر باعث شده است در جایگاه ابزاری برای سنجش ‏تاریخ تکاملی در سطوح پایین از قبیل جنس، گونه و ‏حتی زیرگونه برای بیشتر مهره‌داران به‌‌ویژه پرندگان ‏استفاده شوند (‏Johns and Avise, 1998‎‏). به‌‌طور ‏کلی، شناسایی سسک‌‌ها به‌‌دلیل شباهت ظاهری زیاد برای ‏پرنده‌‌نگرها و پرنده‌‌شناسان دشوار است؛ بنابراین مطالعۀ ‏حاضر به‌‌دلیل نبود شناخت کافی و به‌‌تبع آن ‏طبقه‌‌بندی‌‌های متعددی که در مقیاس جهانی با تردید ‏روبه‌‌رو هستند، با هدف شناسایی و طبقه‌‌بندی گونۀ سسک ‏گلوسفید کوچک در یکی از جنوبی‌‌ترین نواحی ‏پراکنش آن در دنیا و در جنوبی‌ترین ناحیۀ پراکنش این ‏گونه در ایران انجام شد. یکی از راههای حفاظت از تنوع ‏زیستی و حیات وحش، شناخت دقیق گونه‌‌ها است؛ زیرا ‏شناخت گونه‌‌ها به برنامه‌‌ریزی‌‌های محیط زیست در قالب ‏حفاظت هرچه بهتر از گونه‌‌ها سامان می‌‌بخشد و با شناخت ‏دقیق زیرگونه‌‌ها در جای جای کشور پهناور ایران، گامی ‏مثبت برای شناساندن هرچه بیشتر غنای گونه‌‌ای ایران ‏کهن به جهان برداشته می‌‌شود.‏
Blondel‏ و همکاران (‏‎1996‎‏) یکی از نخستین ‏مطالعات دربارۀ طبقه‌‌بندی خانوادۀ سسک‌‌ها را انجام و ‏سسک‌‌ها را در سه گروه گونه‌‌ای شرق مدیترانه‌‌، مرکز ‏مدیترانه و غرب مدیترانه جای دادند. مطالعۀ دیگری ‏توسط ‏Brambilla‏ و همکاران (‏‎2008‎‏) روی گروه ‏گونه‌‌ای ‏Sylvia cantillans‏ در حوزۀ مدیترانه انجام ‏شد. ‏Olsson‏ و همکاران (‏‎2013‎‏) مطالعۀ جامعی براساس ‏داده‌‌های چهار ژن ‏cytb، ‏brm(z)‎، ‏myo(a)‎‏ و ‏odc(a)‎‏ ‏در کل محدودۀ پراکنش این گونه با استفاده از 213 فرد ‏از جنس سسک گلوسفید کوچک انجام دادند.‏
طبق آخرین مطالعات صورت‌‌گرفته، محدودۀ ‏پراکنش گونۀ سسک گلوسفید کوچک شامل ‏محدوده‌‌ای از غرب پالئارکتیک تا شرق روسیه، ‏قسمت‌‌های وسیعی از فلات تبت به همراه بخش‌‌هایی از ‏هند و چین، ایندومالایا و فلات آناتولی و یکی از ‏جنوبی‌‌ترین محدودۀ پراکنش آن در قشم و کویر لوت ‏می‌‌شود (‏Olsson et al., 2013‎‏). از مناطق پراکنش ‏گونۀ سسک گلوسفید کوچک در ایران و جهان، بخشی ‏از ابهامات مربوط به جایگاه کلادیستیک این گونه به‌‌طور ‏تقریبی رفع شده ‌‌است (‏Abdilzadeh et al., 2019, ‎‎2020‎‏)؛ اما یکی از جنوبی‌‌ترین ناحیه‌‌های پراکنش گونۀ ‏سسک گلوسفید کوچک در ایران که شامل جزیرۀ قشم ‏می‌‌شود، همچنان با ابهاماتی در جایگاه آرایه‌‌شناسی گونه ‏یا زیرگونه‌‌های این منطقه مواجه است. هدف از انجام این ‏مطالعه، پاسخ به این پرسش است که زیرگونۀ سسک ‏مطالعه‌‌شده به‌‌طور دقیق در کدام کلاد طبقاتی از آرایۀ ‏سسک‌‌ها قرار می‌‌گیرد؛ به عبارتی دیگر این زیرگونه در ‏جزیرۀ قشم ‏minula‏ است یا ‏halimodendri‏ و در ‏صورت اثبات دومی، همگی یک منشأ تولید مثلی دارند ‏یا خیر.‏

مواد و روش‌ها
معرفی محدودۀ مطالعاتی
منطقۀ مطالعه‌‌شده در این پژوهش شامل یکی از ‏جنوبی‌‌ترین مناطق پراکنش گروه گونه‌‌ای سسک ‏گلوسفید کوچک در ایران است که در جزیرۀ قشم ‏زیست می‌‌کند. جزیرۀ قشم با طول تقریبی 135 کیلومتر و ‏عرض 40 کیلومتر با وسعتی حدود 1491 کیلومتر مربع از ‏جنوبی‌‌ترین گستره‌‌های زیستگاهی سسک گلوسفید ‏کوچک در دنیا است که منطقه‌‌ای مطالعه‌‌نشده برای این ‏گونه محسوب می‌‌شود (شکل 1). اگرچه تاکنون ‏شواهدی از تولید مثل این گونه در جزیرۀ قشم مشاهده ‏نشده است، با توجه به مناطق مرتفع در نزدیک‌‌ترین نقطه ‏از فلات ایران از جزیرۀ قشم (ارتفاعات شهر بابک) ‏امکان مشاهدۀ آن منتفی نیست.‏

 
شکل 1- منطقۀ مطالعه‌‌شده برای بررسی سسک گلوسفید کوچک

 
عملیات میدانی
در منطقۀ مطالعه‌‌شده، جمع‌‌آوری نمونه‌‌ها به‌‌صورت ‏به‌‌طور کامل تصادفی با استفاده از تور زنده‌‌گیری پرندگان ‏انجام و تعداد 33 نمونه از سسک‌‌ گلوسفید کوچک ‏جنس نر یا ماده زنده‌‌گیری شد (شکل 2). مختصات ‏جغرافیایی محل‌‌های نمونه‌‌گیری در جدول 1 مشخص ‏شده است. ‏
 

 
شکل 2- نمونه‌‌گیری سسک گلوسفید کوچک با استفاده از تور زنده‌‌گیری

جدول 1- مختصات نقاط نمونه‌‌گیری سسک گلوسفید کوچک در جزیرۀ قشم
عرض جغرافیایی    طول جغرافیایی    ایستگاه نمونه‌‌گیری
‏26°‏‎ ‎‏37′‏‎ ‎‏39‏‎" N    ‏55°‏‎ ‎‏18′‏‎ ‎‏23‏‎" E    ‏1‏
‏29°‏‎ ‎‏39′‏‎ ‎‏42‏‎" N    ‏55°‏‎ ‎‏28′‏‎ ‎‏04‏‎" E    ‏2‏
‏26°‏‎ ‎‏44′‏‎ ‎‏19‏‎" N    ‏55°‏‎ ‎‏38′‏‎ ‎‏56‏‎" E    ‏3‏
‏26°‏‎ ‎‏49′‏‎ ‎‏46‏‎" N    ‏55°‏‎ ‎‏49′‏‎ ‎‏10‏‎" E    ‏4‏

 
علاوه‌‌بر خون‌‌گیری از نمونه‌‌ها (از زیر بال)، یک ‏جفت شاهپر ثانویه به‌‌طور متقارن از بال‌‌های چپ و راست ‏جدا شد؛ سپس ضمن جمع‌‌آوری پرهای به‌‌جای‌‌مانده در ‏تور زنده‌‌گیری، پرنده در همان محل زنده‌‌گیری به طبیعت ‏بازگردانده شد. با استفاده از زخم حاصل از نوک سرنگ ‏انسولین، از سیاهرگ زیر بال به اندازۀ کمتر از یک ‏میکرولیتر خون از پرنده گرفته شد (‏Seutin et al., ‎‎1996‎‏). بعد از انجام خون‌‌گیری، نمونه‌‌های خون برای ‏استخراج ‏DNA، درون بافر کوئین به آزمایشگاه منتقل ‏شد. نمونه‌‌های پر نیز پس از خشک‌‌کردن در هوای آزاد ‏به‌‌دلیل جلوگیری از قارچ‌‌زدگی در نایلون‌‌های استریل ‏قرار داده و به همراه نمونه‌‌های خون برای انجام ‏آزمایش‌های مولکولی به آزمایشگاه منتقل شد ‏‏(‏Segelbacher, 2002‎‏).‏

روش‌‌های آزمایشگاهی
به‌‌منظور استخراج ‏DNA‏ از خون و همین‌‌طور پر، از ‏روش فنل - کلروفورم استفاده شد (‏Ong and ‎Vellayan, 2008‎‏). در استخراج با این روش ابتدا، در ‏میکروتیوب مقداری خون یا پر پودرشده ریخته و دو ‏مرحله سانتریفیوژ با دور ‏rpm‏500 انجام شد؛ سپس به این ‏میکروتیوب مقدار 50 میکرولیتر محلول 10 درصد ‏SDS، 500 میکرولیتر بافر ‏STE‏ (‏Sodium Chloride, ‎Tris, EDTA‏) و پنج میکرولیتر پروتئیناز ‏k‏ افزوده شد. ‏محلول‌‌ها به مدت 30 دقیقه در حمام آب (بن‌‌ماری) با ‏دمای 56 درجۀ سانتی‌‌گراد قرار داده شد. به ‏میکروتیوب‌‌ها به نسبت 25:24:1 فنل - کلروفورم ‏ایزوآمیل (درمجموع 500 میکرولیتر) افزوده و به مدت ‏‏10 دقیقه با دور ‏rpm‏1200 سانتریفیوژ شد. پس از ‏سانتریفیوژ، محلول رویی به میکروتیوب استریل‌‌شدۀ ‏دیگری منتقل و به آن250 میکرولیتر کلروفورم ‏ایزوآمیل اضافه شد. بعد از سانتریفیوژ دوبارۀ محلول به ‏مدت 10 دقیقه با دور ‏rpm‏1200 و برداشتن محلول رویی ‏و ریختن آن در میکروتیوبی جدید، مقدار 400 ‏میکرولیتر اتانول مطلق سرد اضافه شد و پس از تکرار ‏سانتریفیوژ، ‏DNA‏ در کف میکروتیوب رسوب کرد. ‏پس از تخلیۀ محلول رویی از داخل میکروتیوب، مقدار ‏‏700 میکرولیتر اتانول 75 درصد به‌‌منظور شستشوی ‏‎ ‎DNAچسبیده به کف میکروتیوب اضافه و فرآیند ‏سانتریفیوژ با دور ‏rpm‏1200 و به مدت 10 دقیقه انجام ‏شد. پس از اتمام سانتریفیوژ، محلول رویی برداشته شد و ‏میکروتیوب به‌‌صورت برعکس زیر هود قرار گرفت تا ‏الکل آن از بین برود. درنهایت، 45 میکرولیتر آب مقطر ‏به میکروتیوب حاوی ‏‎ DNAافزوده و به‌‌منظور آزادشدن ‏DNA‏ چسبیده به کف میکروتیوب، نمونه‌‌ها به مدت پنج ‏دقیقه در بن‌‌ماری با دمای 56 درجۀ سانتی‌‌گراد قرار داده ‏شد. درنهایت، محلول حاصل در یخچال و سپس در 20- ‏درجۀ سانتی‌‌گراد نگهداری شد (‏McKiernan and ‎Anielson, 2017‎‏).‏
برای کنترل کمیت و کیفیت ‏‎ DNAاستخراجی، از ‏دستگاه نانودراپ (مدل ‏Thermo 2000c‏) استفاده شد. ‏دستگاه ابتدا با حلال استفاده‌‌شده در رقیق‌‌سازی ‏DNA، ‏یعنی آب مقطر، کالیبره (‏Blank‏) شد. به‌‌منظور خوانش، ‏مقدار دو میکرولیتر از محلول ‏‎ DNAروی پروب ‏دستگاه قرار داده و با کمک دستگاه نانودراپ، کمیت ‏‎ ‎DNAاستخراجی مشخص شد؛ سپس واکنش زنجیره‌‌ای ‏پلیمراز برای تکثیر قطعات مشخصی از ‏DNA‏ استفاده ‏شد. برای این منظور، داخل هر میکروتیوب مقدار یک ‏میکرولیتر از ‏DNA‏ استخراج‌شده، 5/12 میکرولیتر ‏مسترمیکس ‏PCR‏ (تولیدشده توسط شرکت ‏Ampliqon‏)، از آغازگرهای رفت و برگشت هرکدام به ‏اندزۀ 3/1 میکرولیتر و نه میکرولیتر آب دوبار تقطیر ‏اضافه و میکروتیوب حاصل، با پروتوکل‌‌های دمایی ویژه‌‌‏‎ ‎و دمای اتصال 56 درجۀ سانتی‌‌گراد در دستگاه ‏PCR‏ قرار ‏داده شد. ‏
در این مطالعه با اقتباس از پژوهش ‏Olsson‏ و ‏همکاران (‏‎2013‎‏) از آغازگرهای اختصاصی زیر برای ‏تکثیر قطعۀcytb ‎‏ از ‏mtDNA‏ استفاده شد:‏
 

F: L14841 ‎    ‎5´-CCATCCAACATCTCAGCATGATGAAA-3´‎
R: H15149 ‎‏          ‏‎5´-GCCCCTCAGAATGATATTTGTCCTCA-3´‎
 
 
در ادامه، علاوه‌‌بر استفاده از آغازگرهای اشاره‌‌شده، ‏برای آن دسته از نمونه‌‌هایی که مؤفقیت چندانی در تکثیر ‏از خود نشان ندادند از آغازگرهای ‏L14995‎‏ و ‏H16065‎‏ در جایگاه آغازگرهای تکمیلی استفاده شد‎:‎
 

F: L14995 ‎‏              ‏‎5´-CAACATCTCAGCATGATGAAACTTCG-3´‎
R: H16065‎    ‎5´-GGAGTCTTCAGTCTCTGGTTTACAAGAC-3´‎ 

 
پس از مرحلۀ آخر چرخۀ ‏PCR‏ (‏Close Loop‏)، ‏محلول به مدت پنج دقیقه در دمای 72 درجۀ سانتی‌‌گراد ‏قرار داده و محلول نهایی برای نگهداری به یخچال منتقل ‏شد.‏
به‌‌منظور آنالیز کیفی محصولات ‏PCR‏ ابتدا، مقدار ‏یک گرم آگارز در 100 میلی‌‌لیتر آب مقطر حل شد و ‏روی هیتر 100 درجۀ سانتی‌‌گراد قرار گرفت. ژل آگارز با ‏مقدار یک میکرولیتر از رنگ ‏Green Viewer‏ ‏رنگ‌آمیزی شد تا ‏DNA‏ در بستر رنگ‌‌آمیزی‌‌شده و ‏تحت نور ‏UV‏ مشاهده شود. این ماده برخلاف ‏اتیدیم‌‌بروماید فاقد عوارض شناخته‌‌شده برای سلامتی ‏انسان است (‏Voytas, 2000‎‏). ‏

آنالیزهای مولکولی
به‌‌منظور توالی‌‌یابی محصول ‏PCR‏ از دستگاه ‏DNA ‎Sequencer‏ استفاده شد. نمونه‌‌ها برای توالی‌‌یابی به ‏شرکت ‏Bioneer‏ کرۀ جنوبی ارسال شد. این دستگاه ‏قطعات ‏DNA‏ را به‌‌صورت یکجا و با روش موسوم به ‏سنگر (‏Sanger‏) جدا می‌‌کند (‏Min et al., 2011‎‏). ‏خروجی فایل‌‌ها در دو فرمت ‏txt‏ و ‏ab1‎‏ دریافت شد.‏
برای بررسی توالی‌‌ها، مرتب‌‌سازی، ویرایش و ‏محاسبۀ فاصلۀ ژنتیکی براساس مدل جایگزینی ‏K2P، از ‏نرم‌افزارهای ‏BioEdit، ‏MEGA-X‏ و وب‌‌‌سایت‎ Mafft ‎تحت الگوریتم ماسل استفاده شد (‏Hall et al., 2011; ‎Katoh and standley, 2013; Kumar et al., ‎‎2018‎‏). درنهایت، توالی‌‌های مرتب‌‌شده، برای ترسیم ‏درخت‌‌ها و شبکۀ هاپلوتایپی استفاده و نوکلئوتیدهای ‏عامل بروز تفاوت‌‌ها از بین توالی‌‌های مربوط به نمونه‌های ‏سسک گلوسفید کوچک جزیرۀ قشم جداسازی شد ‏‏(جدول 2).‏‎ ‎از آنجایی که انتخاب مدل تکاملی ویژه برای ‏بلوک‌های دربرگیرندۀ داده‌‌های ژنتیکی ممکن است ‏نتایج تحلیل‌‌های تبارشناختی را تغییر دهد،‎ ‎برای ترسیم ‏درخت‌‌های احتمال بیشینه و بیزین، ابتدا بهترین مدل در ‏نرم‌‌افزار ‏jModeltest‏ تعیین (‏TrN+I‏) و سپس در ‏نرم‌‌افزارهای ‏MEGA-X‏ و ‏MrBayes on XSEDE ‎‎3.2.7a‏ به ترتیب با پشتوانه‌‌های تکرار 1000 و 100 ‏میلیون بار تحت وب‌‌‌‌سایت ‏CIPRES‏ رسم شد ‏‏(‏Sulivan and Joyce, 2005; Miller et al., ‎‎2010‎‏). برای برون‌‌گروه از دو نمونۀ ‏Sylvia contilans‏ ‏استفاده شد (‏Brambilla et al., 2008‎‏). به‌‌منظور ‏ترسیم شبکۀ هاپلوتایپی، از نرم‌‌افزار ‏PopART 1.7‎‏ با ‏استفاده از روش اتصال میانه و روش ‏TCS‏ بهره گرفته شد ‏‏(‏Leigh and Bryant, 2015‎‏ ‏Keis et al., 2013;‎‏).‏
نتایج
در مطالعۀ حاضر از تعداد 33 نمونۀ گرفته‌‌شده، 32 ‏استخراج و تکثیر مؤفق حاصل شد. در بررسی کمی و ‏کیفی محصول استخراج نمونه‌‌ها با استفاده از نانودراپ، ‏نسبت 280/260 اغلب بیشتر از 8/1 و نسبت 230/260 ‏بیشتر از دو بود که نشان‌‌دهندۀ مزاحمت‌‌نداشتن پروتئین و ‏کربوهیدرا‌‌ت‌‌ها از نمونه‌‌های موجود است؛ بنابراین ‏توالی‌‌های 32 نمونه پس انجام فرآیند ‏PCR‏ با‎ ‎دستگاه ‏خوانش شد. از این تعداد، از نه نمونه به‌‌دلیل وجود گپ ‏زیاد، اختلال یا آمیختگی نوکلئوتیدها و تعداد پایین ‏نوکلئوتیدهای خوانش‌‌شده چشم‌‌پوشی و درنهایت، ‏توالی‌‌های 23 نمونه از قشم و 29 توالی دانلودشده از بانک ‏ژن، مرتب‌‌سازی شد. پس از مرتب‌‌سازی توالی‌‌ها، 1057 ‏جفت نوکلئوتید از ناحیۀ ‏cytb‏ در جایگاه ورودی نهایی ‏به‌‌منظور ترسیم درخت‌‌های تبارشناسی انتخاب شد. در ‏این مطالعه، الگوی شاخه‌‌زایی هر دو نوع درخت ‏تبارشناختی به‌‌طور تقریبی شبیه هم بود؛ به این معنی که ‏زیرگونه‌‌های مختلف را به‌‌شکل مشابهی در کلادهای ‏جداگانه جای دادند. تلفیق دو درخت نام‌‌برده به همراه ‏احتمال پسین‌‌های مربوط به آنها در شکل 3 نمایش داده ‏شده است.‏

شکل 3- درخت نهایی ژن ‏cytb‏ برای سسک گلوسفید کوچک ایران و جهان به ترتیب ‏BI:ML‏. درخت احتمال بیشینه با تکرار 1000 ‏‏(معنی‌‌داری 70‏‎>‎‏) و درخت بیزین با تکرار 100 میلیون (معنی‌‌داری 95/0‏‎>‎‏) محاسبه شده و درج ‏ns‏ نشان‌‌دهندۀ معنی‌‌دارنبودن است.‏

 
جدایی دو کلاد اول در درخت‌‌ بالا ممکن است به‌‌دلیل ‏وجود تفاوت در نوکلئوتیدها و جایگاه آنها باشد (جدول ‏‏2).‏

جدول 2- تفاوت نوکلئوتیدهای موجود در دو کلاد مربوط به نمونه‌‌های قشم
                شمارۀ نوکلئوتید            
‏1000‏    ‏795‏    ‏784‏    ‏633‏    ‏568‏    ‏549‏    ‏438‏    ‏435‏    ‏381‏    ‏349‏    کلادها
A    G    C    G    A    C    A    A    T    A    
A    G    C    G    A    C    A    A    T    A    
A    G    C    G    A    C    A    A    T    A    
A    G    C    G    A    C    A    A    T    A    
A    G    C    G    A    C    A    A    T    A    
G    G    C    A    A    C    A    A    T    A    کلاد1‏
G    G    C    A    A    C    A    A    T    A    
A    G    C    A    A    C    A    A    T    A    
A    G    T    A    A    C    A    A    T    A    
A    G    T    A    A    C    A    A    T    A    
G    G    T    A    A    C    A    A    T    A    
G    G    T    A    A    C    A    A    T    A    
G    G    T    A    A    C    A    A    C    A    
G    G    T    A    A    C    T    G    C    A    
A    G    T    A    A    C    T    G    C    A    
A    G    C    A    A    C    T    G    C    A    
A    G    C    A    G    T    T    G    C    A    
A    A    T    A    A    T    T    G    C    G    کلاد2‏
A    G    T    A    G    T    T    G    C    G    
A    G    C    A    G    T    T    G    C    G    
G    G    C    A    G    T    T    G    C    G    
G    G    C    A    G    T    T    G    C    G    
G    A    T    A    G    T    T    G    C    G    

 
به‌‌منظور مشخص‌‌شدن تفاوت‌‌های ژنتیکی در بین ‏زیرگونه‌‌های مختلف این گونه، فاصلۀ ژنتیکی‎ ‎براساس ‏مدل جایگزینی ‏K2P‏ و همین‌‌طور شبکۀ هاپلوتایپی با ‏استفاده از نرم‌‌افزارهای مربوط با کمک روش اتصال میانه ‏و روش ‏TCS‏ محاسبه و ترسیم و از هر دو روش، نتایج ‏به‌‌طور تقریبی مشابهی حاصل شد (جدول 3، شکل 4).‏
 

جدول 3- ماتریس فاصلۀ بین کلادهای درخت احتمال بیشینه براساس مدل جایگزینی انتخاب‌‌شده
برون‌‌گروه    کلاد 6‏    کلاد 5‏    کلاد 4‏    کلاد 3‏    کلاد 2‏    کلاد 1‏    
                        ‏0‏    کلاد 1‏
                    ‏0‏    ‏007/0‏    کلاد 2‏
                ‏0‏    ‏016/0‏    ‏013/0‏    کلاد3‏
            ‏0‏    ‏003/0‏    ‏017/0‏    ‏015/0‏    کلاد 4‏
        ‏0‏    ‏021/0‏    ‏019/0‏    ‏022/0‏    ‏075/0‏    کلاد 5‏
    ‏0‏    ‏018/0‏    ‏014/0‏    ‏012/0‏    ‏015/0‏    ‏013/0‏    کلاد 6‏
‏0‏    ‏069/0‏    ‏075/0‏    ‏072/0‏    ‏070/0‏    ‏071/0‏    ‏070/0‏    برون گروه

 
شکل 4- شبکۀ هاپلوتایپی ترسیم‌‌شده از توالی‌‌های نهایی‌‌شده براساس دومدل ‏MJ‏ (‏a‏) و ‏TCS‏ (‏b‏). خطوط عرضی معادل تعداد گره‌‌های ‏تکاملی و رنگ‌‌های متفاوت نشان‌‌دهندۀ زیرگونه‌‌های مختلف است. قطر دایره‌‌ها بیانگر درصد فراوانی هاپلوتایپ‌‌ها است. به‌‌طور معمول با ‏افزایش فاصله از قسمت مرکزی به حاشیه، گروههای اجدادی به سمت گروههای جدیدتر کشیده می‌‌شود.‏

 
در این پژوهش، نقاط پراکنش زیرگونۀ سسک ‏گلوسفید کوچک جزیرۀ قشم که به اسم ‏halimodendri‏ قلمداد می‌‌شود، به نقاط پراکنش سایر ‏زیرگونه‌‌های شناخته‌‌شده در ایران افزوده شد (شکل 5). ‏

شکل 5- نقاط پراکنش سسک گلوسفید کوچک جزیرۀ قشم به همراه سایر زیرگونه‌‌ها در ایران (اقتباس ازAbdilzadeh et al., 2019‎‏).‏

 
بحث
در مطالعات مختلف از درخت‌‌های تبارشناسی ‏به‌‌منظور مشخص‌‌کردن جایگاه کلادیستیک گونه‌‌ها ‏استفاده شده است. در مطالعۀ ‏Olsson‏ و همکاران ‏‏(‏‎2013‎‏) براساس درخت‌‌های تبارشناسی شش کلاد ‏مختلف از گروه گونه‌ای سسک گلوسفید کوچک ‏تحت آرایه‌‌های ‏blythi،halimodendri ‎‏ ‏althaea، ‏margelanica، ‏curruca‏ و ‏minula‏ به ثبت رسید. ‏به‌‌طور کلی هر دو درخت بیزین و حداکثر احتمال، تا ‏اندازۀ زیادی یکدیگر را تأیید کرده‌‌اند. براساس درخت ‏بیزین، گروه گونه‌‌ای سسک گلوسفید کوچک در یکی ‏از جنوبی‌‌ترین مناطق ایران به‌‌تنهایی دو کلاد جدا از هم با ‏احتمال پسین یک را به نمایش گذاشته است و همۀ آنها ‏در مجاورت نمونه‌‌هایی از بانک ژن با نام ‏halimodendri‏ قرار گرفته‌‌اند؛ درنتیجه در جزیرۀ قشم ‏در فصل زمستان تا اوایل بهار سسک‌‌های زیرگونۀ ‏halimodendri‏ مربوط به مسیرهای مهاجرتی مختلف، ‏از این زیستگاه برای اقامت بهره می‌‌برند؛ در عین حال با ‏توجه به اینکه نمونه‌‌هایKC512521 ‎‏ و ‏‎ ‎KC512532‎که در کلاد پایینی (کلاد 2) قرار گرفتند، ‏در قزاقستان تا شمال غرب منطقۀ ‏Xinjiang‏ در ‏سرحدات مرزی چین تولید مثل دارند، به‌‌طور احتمالی ‏‏10 نمونه از بین پرندگان مطالعه‌‌شده دارای منطقۀ تولید ‏مثلی اشاره‌‌شده خواهند بود. در کلاد بالایی (کلاد 1) ‏درخت مولکولی نیز 13 نمونه از سسک گلوسفید ‏کوچک قشم به‌‌خوبی توالی‌‌یابی شد که به احتمال زیاد ‏متعلق به گروه زادآور دوم در منطقۀ مغولستان تا چین ‏است. شماری از آرایه‌‌شناسان و پرنده‌‌نگران اعتقاد دارند ‏که زیرگونۀ سسک گلوسفید کوچک در جزیرۀ قشم از ‏نوع ‏minula‏ است؛ اما با تکیه بر نتایج این پژوهش ‏مشخص شد این زیرگونه در جنوبی‌‌ترین نواحی ایران از ‏نوع ‏halimodendri‏ و ازلحاظ ژنتیکی با زیرگونۀ ‏minula‏ متفاوت است؛ همچنین با وجود احتمال پسین ‏یک در بین دو کلاد تشکیل‌‌شده از جزیرۀ قشم ‏‏(کلادهای 1 و 2)، این احتمال وجود دارد که با مطالعات ‏تکمیلی در آینده، سسک‌‌های گلوسفید کوچک منطقۀ ‏قشم تا سطح یک زیرگونۀ جدید جداشده یا آرایۀ ‏درحال تکوین باشند. این یافته‌‌ها براساس یک ژن بوده ‏است؛ پس انجام مطالعات بیشتر همچنان پیشنهاد می‌‌شود.‏
در مطالعۀ ‏Abdilzadeh‏ و همکاران (‏‎2020‎‏) ‏زیستگاه زیرگونۀ ‏halimodendri‏ از سسک گلوسفید ‏کوچک، مناطق پست و جلگه‌‌ای سواحل میناب در نظر ‏گرفته شد؛ اما جای نمونه‌‌‌‌های قشم در پژوهش آنها خالی ‏بود؛ بنابراین با توجه به نتایج به‌‌دست‌‌آمده از درخت‌‌های ‏تبارشناسی، زیرگونۀ ‏halimodendri‏ در سواحل جزیرۀ ‏قشم و میناب زمستان‌‌گذرانی دارد؛ به طوری که در ایران ‏مناطق پست و کم‌‌ارتفاع را ترجیح می‌‌دهد و از مناطق ‏جنگلی مرتفع دوری می‌‌کند؛ چیزی که مطالعۀ حاضر با ‏تعداد مقبولی نمونه و درخت مولکولی با شواهد قوی آن ‏را تأیید کرده است.‏
فاصلۀ ژنتیکی زیرگونه‌‌های مختلف نشان‌‌دهندۀ میزان ‏تفاوت‌‌های ژنتیکی در بین آنها است. هرچه این اعداد به ‏یک نزدیک‌‌تر باشد، نشان‌‌دهندۀ این است که دو آرایه با ‏یکدیگر تفاوت بیشتری دارند؛ به عبارت دیگر از جدایی ‏آنها زمان بیشتری می‌‌گذرد (‏Helbig and Seibold, ‎‎1999‎‏). فاصلۀ ژنتیکی بین زیرگونه‌های گونۀ سسک ‏گلوسفید کوچک کم است (جدول 3)؛ بنابراین نتیجه ‏گرفته می‌‌شود که این زیرگونه‌‌ها در فاصلۀ زمانی به‌‌طور ‏تقریبی کوتاهی از یکدیگر جدا شده‌‌اند. در بین دو کلاد ‏تشکیل‌‌شده از جزیرۀ قشم، میزان فاصلۀ ژنتیکی به‌‌طور ‏تقریبی 007/0 است؛ یعنی اختلاف در بین این دو کلاد ‏به‌‌نسبت کمتر از سایر کلادها است؛ پس سسک‌‌های قشم ‏در مقیاس جهانی، هاپلوتایپی جدا را همراه با زیرگونۀ ‏halimodendri‏ تشکیل می‌‌دهند و اختلاف به‌‌نسبت ‏بیشتری با سایر کلادها دارند. ‏
شبکۀ هاپلوتایپی، ارتباط بین گروههای گونه‌‌ای ‏است. با استفاده از شبکه‌‌های هاپلوتایپی، آرایه‌‌ها براساس ‏شباهت‌‌ها و تفاوت‌‌های ژنتیکی در گروههای متفاوت ‏جای داده می‌‌شود؛ به‌‌علاوه آن دسته از جمعیت‌‌هایی که ‏اخیراً از جمعیت مادری تکامل یافته‌‌اند، مشخص می‌‌شود ‏‏(‏Templeton, 2002‎‏). در این مطالعه، شبکۀ هاپلوتایپی ‏نیز همانند درخت‌‌های تبارشناسی وجود دو تیپ مختلف ‏از زیرگونۀ سسک گلوسفید کوچک را در جزیرۀ قشم ‏تأیید کرد. مطالعۀ ‏Abdilzadeh‏ و همکاران (2020) ‏شبکۀ هاپلوتایپی تشکیل‌‌شده از سه آرایۀ گونۀ سسک ‏گلوسفید کوچک را به نمایش گذاشت که آرایه‌‌های ‏halimodendri‏ و ‏althaea‏ با گره‌‌های تکاملی به‌‌طور ‏تقریبی برابر، از آرایه ‏curruca‏ جدا شدند؛ اما نتایج ‏به‌‌دست‌‌آمده از پژوهش حاضر نشان داد دو کلادی که ‏نمونه‌‌های قشم را دربر می‌‌گیرند (کلاد یک و دو)، با ‏بیشترین گرۀ تکاملی از آرایۀ ‏curruca‏ جدا شدند؛ این ‏بدان معنی است که سسک‌های جزیرۀ قشم که با ‏اطلاعات کنونی از نوع ‏halimodendri‏ قلمداد می‌‌شوند، ‏نسبت به زیرگونه‌‌های دیگر در زمان متفاوتی از جد ‏مشترک خود جدا شده‌‌اند و نسبت به سایر گونه‌‌ها ‏اختلاف بیشتری با آرایۀ ‏curruca‏ دارند. هر دو مدل ‏MJ‏ ‏و ‏TCS‏ یافته‌‌های بالا را تأیید کردند.‏

جمع‌‌بندی
امروزه مطالعات تبارشناسی جایگاه ویژه‌‌ای در علم ‏بیوسیستماتیک دارد. شناخت دقیق گونه‌‌ها که از الزامات ‏حفاظت از تنوع زیستی است، ازطریق مطالعات ‏تبارشناسی میسر خواهد شد. وجود زیرگونه‌‌های مختلف ‏از یک گونه به‌‌خوبی نمایانگر تنوع و پویایی حیات روی ‏کرۀ زمین است. اینکه این زیرگونه‌‌ها تا چه مقدار ممکن ‏است از جمعیت مادری فاصله بگیرند و در زیستگاههای ‏مختلف در جایگاه عنصری در چرخۀ زیستی نقش ایفا ‏کنند، توجه دانشمندان را به خود جلب کرده است. در ‏مطالعۀ حاضر وضعیت کلادیستیک زیرگونۀ سسک ‏گلوسفید کوچک در یکی از جنوبی‌‌ترین مناطق پراکنش ‏آن در ایران با رویکرد سیستماتیک مولکولی با استفاده از ‏ناحیۀ ‏cytb‏ از ‏mtDNA‏ تجزیه و تحلیل و سسک‌‌های ‏این منطقه با نام ‏halimodendri‏ مفروض شد؛ همچنین ‏شواهد نشان داد این سسک‌‌ها زیستگاه مناطق پست ‏ساحلی را انتخاب کرده‌‌اند و به‌‌طور احتمالی از دو منطقۀ ‏متفاوت برای زمستان‌‌گذرانی به جزیرۀ قشم مهاجرت ‏می‌کنند؛ بنابراین به احتمال زیاد چون مسیرهای مهاجرتی ‏متفاوتی دارند و در دو منطقۀ متفاوت تولید مثل می‌‌کنند، ‏این پتانسیل را دارند که در جایگاه دو زیرگونۀ متفاوت از ‏گونۀ سسک گلوسفید کوچک جدا شوند؛ اگرچه برای ‏اثبات قطعی مسیرهای جداگانۀ مهاجرتی نیاز به استفاده از ‏ایزوتوپ‌‌های پایدار و مقایسۀ نتایج دو منطقۀ زادآوری و ‏غیر زادآور خواهد بود. با در دست داشتن این اطلاعات ‏مفید از جزیرۀ قشم، یکی از مناطق زمستان‌‌گذرانی ‏زیرگونۀ سسک گلوسفید کوچک در ایران معرفی ‏می‌‌شود.‏

سپاسگزاری
این مطالعه با حمایت مالی دانشگاه تربیت مدرس در ‏قالب پایان‌‌نامۀ کارشناسی ارشد انجام شده است. ‏نویسندگان از کارکنان دانشگاه تربیت مدرس برای ‏مهیاکردن بستر انجام آزمایش‌‌های پژوهش تشکر و ‏قدردانی می‌‌کنند؛ همچنین از همکاری معاونت فنی ادارۀ ‏کل محیط زیست استان هرمزگان و ادارۀ محیط زیست ‏منطقۀ آزاد قشم، برای تسهیل در اخذ مجوزهای مطالعه و ‏فرآیند نمونه‌گیری تشکر می‌‌شود.‏‎ ‎