مقدمه.

سیب‌زمینی[1]، یکی از محصولات مهم و استرات‍‍ژیک جهان محسوب می‌شود که در تغذیه انسان از اهمیت زیادی برخوردار است؛ به‌طوری‌که پس از گندم، ذرت و برنج در رژیم غذایی انسان جای دارد (1). براساس آمارهایی که سازمان خواروبار کشاورزی ملل متحد ارائه کرده، میزان تولید سیب‌زمینی در جهان حدود 310 میلیون تن با سطح زیر کشت حدود 19 میلیون هکتار در 125 کشور دنیا است. در حال حاضر، متوسط عملکرد سیب‌زمینی آبی در ایران حدود 26 تن در هکتار است و 164 هزار هکتار از زمین‌های زراعی ایران زیر کشت سیب‌زمینی قرار دارد. میزان تولید سیب‌زمینی در ایران حدود 4 میلیون و 200 هزار تن است که استان همدان با 83/20درصد از تولید سیب‌زمینی کشور در رتبه نخست قرار می‌گیرد و استان اردبیل با 23/16درصد در رتبه دوم قرار دارد (2).

پوسیدگی خشک[2] یکی از بیماری‌های مهم و محدودکننده سیب‌زمینی جهت نگهداری در انبار و در زمان حمل‌ونقل آن محسوب می‌شود. در این بیماری غده‌های آلوده معمولاً خشک می‌شوند؛ اما ممکن است گاهی پوسیدگی مرطوب نیز رخ دهد. پوسیدگی خشک را معمولاً گونه‌های مختلف فوزاریوم[3] ایجاد می‏کنند. در صورتی ‌که در آلودگی‌های ناشی از باکتری‏ها، سطح غده‌های آلوده، چروکیده یا دچار پوسیدگی مرطوب با بافت قهوه‌ای‌رنگ مایل به خاکستری یا سیاه می‌شود و گاهی غده‌های آلوده به‌رنگ صورتی نیز دیده می‌شوند (3).

قارچ فوزاریوم از شاخه آسکومایکوتا[4] و متعلق به راسته هیپوکرالس[5] و خانوادهنکتریاسه[6]است که در بسیاری از گیاهان زراعی باعث ایجاد بیماری می‌شود. کنیدیوفورهای این قارچ، ساده یا به‌صورت مجتمع با انشعاب انتهایی هستند که به سلول اسپورزا ختم می‌شوند. سلول‌های اسپورزا در این قارچ از نوع فیالیدی هستند. این قارچ دارای چند نوع کنیدیوم به نام‌های میکروکنیدیوم، ماکروکنیدیوم و کلامیدوسپور است. میکروکنیدیوم‌ها یک یا دوسلولی‌ و استوانه‌ای‌شکل‌اند و ماکروکنیدی‌ها چندسلولی و هلالی‌شکل هستند. کلامیدوسپورها با دیواره ضخیم در وسط ریسه‌ها و حتی در میان سلول‌های ماکروکنیدی و یا در انتهای ریسه‌ها به‌صورت انفرادی، خوشه‌ای یا زنجیری تشکیل می‌شوند (4). این قارچ مایکوتوکسین‌هایی تولید می‌کند که علاوه بر گیاهان بر روی حیوانات نیز ایجاد بیماری می‌کنند و بسیار خطرناک هستند. گونه فوزاریوم اکسیسپوروم[7] می‌تواند در انسان‌ها بیماری آلرژیک تنفسی ایجاد کند (5).

تاکنون 13 گونه فوزاریوم به‌عنوان عوامل مهم پوسیدگی خشک سیب‌زمینی معرفی شده‌اند؛ اما در هر کشور تنها یک الی دو گونه از نظر فراوانی و شدت بیماری‌زایی در اولویت قرار دارند (6). در سال 1989 ترون و هولز[8]عامل پوسیدگی خشک سیب‌زمینی در مزارع آفریقای جنوبی را هشت گونه از قارچ فوزاریوم معرفی کردند. همچنین گونه فوزاریوم سمبوسینوم[9] در آمریکا، بریتانیا و ساحل عاج، گونه فوزاریوم سولانی[10] در اروپا و آمریکای شمالی، گونه فوزاریوم اوناسئوم[11] در فنلاند، گونه فوزاریوم اکوایستی[12] در هند، گونه‌های فوزاریوم اکسیسپوروم و فوزاریوم اسپوروتریکیویدس[13] در کشورهای مصر، آفریقای جنوبی و ایرلند شمالی به‌عنوان گونه‌های غالب شناسایی شده‌اند. گونه‌های فوزاریوم کولموروم[14]، فوزاریوم اوناسئوم و فوزاریوم اکسیسپوروم از سایر نقاط جهان به‌عنوان عوامل بیماری پوسیدگی خشک گزارش شده‌اند (7).

خسارت ناشی از پوسیدگی خشک در آمریکا سالیانه مبلغی بالغ بر یکصد میلیون دلار برآورد شده است که علاوه بر خسارت مالی به‌علت توکسین‌زا‌بودن اغلب گونه‌های فوزاریوم، خطر جدی برای سلامت انسان و دام به شمار می‌رود (8). بیماری پوسیدگی خشک در غده‌هایی که در زمان برداشت، درجه‌بندی و حمل‌ونقل زخمی شدند و فرصت لازم برای تکمیل دوره ترمیم و چوب‌پنبه‌ای‌شدن به بافت زخمی داده نشده است، به وجود می‌آید (9). حساسیت غده‌ها نسبت به عامل بیماری پس از دو ماه انبارداری افزایش می‌یابد و گسترش بیماری سه ماه پس از شروع زمان انبارداری اتفاق می‌افتد (10). کشت غده‌های بذری آلوده موجب پوسیدگی غده‌ها و اندام‌های بذری جدید می‌شود و کاهش تعداد بوته در واحد سطح و در نتیجه کاهش عملکرد را به دنبال خواهد داشت (7). این بیماری بیش از 60 درصد محصول انبارشده را در معرض خطر پوسیدگی قرار می‌دهد (11).

در گزارشی در مجله بیماری‌های گیاهی میشیگان که فیلیپ[15] و همکاران از دانشگاه ایالتی میشیگان ایالات متحده منتشر کرده‌اند، گونه‌های فوزاریوم سمبوسینوم، فوزاریم اوناسئوم و فوزاریوم سولانی به‌عنوان عوامل اصلی ایجادکننده بیماری پوسیدگی خشک معرفی شدند (12). عوامل بیماری پوسیدگی خشک در کشور لهستان طی پژوهشی در سال 2008 به کمک روش‌های مورفولوژیکی و مولکولی شناسایی شدند و در نتیجه گونه‌های فوزاریوم سمبوسینوم و فوزاریوم سولانی به‌عنوان عوامل اصلی پوسیدگی خشک و گونه‌های فوزاریوم سولفوروم[16]، فوزاریوم اکسیسپوروم، فوزاریوم کوئرولئوم[17]، فوزاریوم اوناسئوم و فوزاریوم کولموروم و فوزاریوم اکوایستینیز به‌عنوان عواملی با اهمیت کمتر تعیین شدند (13). در مطالعات مشترک بین دانشگاه ایالتی اورگون و انجمن کشاورزان تولیدکننده محصولات ارگانیک در اورگون و واشنگتن به‌منظور شناسایی عامل بیماری در غده‌های سیب‌زمینی، گونه‌های فوزاریوم سمبوسینوم، فوزاریوم سولانی و فوزاریوم اوناسئوم به‌عنوان عوامل اصلی پوسیدگی خشک سیب‌زمینی در انبارهای این ایالت‌ها معرفی شدند (14).

همچنین طی پژوهشی مقاومت 13 رقم و 247 کلون مختلف سیب‌زمینی به پوسیدگی خشک در سانجرویل آمریکا بررسی شد. پس از جداسازی و شناسایی گونه‌های قارچ فوزاریوم عامل پوسیدگی خشک که شامل فوزاریوم روزئوم[18]، فوزاریوم اوناسئوم، فوزاریوم سمبوسینوم و فوزاریوم کورئولئوم بودند، تفاوت‌هایی در مقاومت به یک یا چند گونه فوزاریوم مشاهده شد. کلون 7200-33ب بیشترین مقاومت را به هر چهار گونه فوزاریوم عامل بیماری از خود نشان داد (15).

پوسیدگی خشک سیب‌زمینی را نخستین بار در ایران شریف و ارشاد[19] گزارش کردند و عامل آن فوزاریوم سولانی معرفی شد (16). کریمی[20] (17) گونه فوزاریوم اکسیسپوروم را مهم‌ترین عامل پوسیدگی خشک سیب‌زمینی در انبارهای استان فارس اعلام کرد.در منطقه فریدن اصفهان با بررسی انبارهای سیب‌زمینی مشخص شد که گونه‌های مختلف قارچ فوزاریوم عامل پوسیدگی خشک، مهمترین عامل ایجاد خسارت هستند (18). همچنین گونه‌های فوزاریوم سولانی، فوزاریوم اکسیپوروم، فوزاریوم سولفوروم و فوزاریوم کلامیدوسپوروم[21] به‌عنوان عوامل ایجاد پوسیدگی خشک غده‌های سیب‌زمینی در فریدن اصفهان معرفی شدند (19). مستوفی زاده قلمفرسا و بنی هاشمی[22] دوازده گونه فوزاریوم از جمله فوزاریوم کولموروم، فوزاریوم سمی تکتوم[23]، فوزاریوم گرامینئاروم[24]، فوزاریوم اکوایستی، فوزاریوم سولانی و فوزاریوم اکسیسپوروم را به‌عنوان عوامل ایجاد پوسیدگی غده‌های سیب‌زمینی در استان فارس گزارش کردند (20). فلاحتی رستگار[25] و همکاران ده گونه از جمله فوزاریوم سولانی، فوزاریوم اکوایستی و فوزاریوم اکسیسپوروم را از غده‌های پوسیده سیب‌زمینی در استان خراسان جداسازی کردند (21).

طی شناسایی عوامل ایجاد پوسیدگی غده‌های بذری سیب‌زمینی در منطقه جیرفت در سال‌های 1380 تا 1382، گونه‌های قارچی سیلیندروکارپون دیدیمیوم[26]، فوزاریوم اکوایستی، فوزاریوم کولموروم، فوزاریوم سولانی و باکتری رالستونیا سولاناسئاروم[27] به‌ترتیب با فراوانی 3/47، 8/15، 2/13، 9/7 و 8/15درصد به‌عنوان عوامل بیماری‌زای غده‌های بذری سیب‌زمینی معرفی شدند (22).

در کشور ایران گونه‌های مختلف فوزاریوم به‌عنوان عوامل پوسیدگی خشک از انبارها و مزارع و حتی خاک‌های مختلف جداسازی شدند و محققان آن‌ها را شناسایی کردند، ولی تاکنون این امر در استان اردبیل به‌صورت یک پژوهش میدانی در ارقام مختلف سیب‌زمینی صورت نگرفته است. این پژوهش به‌منظور ارزیابی شدت بیماری پوسیدگی خشک در انبارهای شهرستان اردبیل، شناسایی قارچ‌های مسبب بیماری و ارزیابی مقاومت چهار رقم سیب‌زمینی به این بیماری انجام شده است.

‏‏مواد و روش‏ها.

تعیین شدت آلودگی انبارها و جمع‌آوری نمونه: طی بازدید از انبارهای مناطق مختلف شهرستان اردبیل، نمونه‌های دارای علائم پوسیدگی خشک جمع‌آوری و به آزمایشگاه منتقل شدند. هم‌زمان میزان آلودگی هر انبار محاسبه شد. برای این منظور در شهرستان اردبیل 39 انبار انتخاب و از هر انبار 3 گونی 50کیلویی سیب‌زمینی از قسمت‌های مختلف انتخاب شدند. با ایجاد برش در غده‌ها و شمارش تعداد غده‌های پوسیده در هر گونی، درصد فراوانی غده‌های پوسیده تعیین شد. همچنین شدت پوسیدگی غده‌ها برای هر انبار بر اساس روشی که نصر اصفهانی[28] (23) معرفی کرد تعیین شد. درجه‌بندی آلودگی غده‌ها بدین صورت بود: صفر: بدون آلودگی؛ یک‌شانزدهم: اگر از 16 قسمت غده، یک قسمت آلودگی داشته باشد؛ یک‌هشتم: اگر از 8 قسمت غده، یک قسمت آلودگی داشته باشد؛ یک‌چهارم: اگر از 4 قسمت غده، یک قسمت آلودگی داشته باشد؛ یک‌دوم: نصف غده سیب‌زمینی آلودگی داشته باشد و بزرگ‌تر از یک‌دوم: بیش از نصف غده آلودگی داشته باشد.

تعداد غده‌های هر تیپ آلودگی به‌ترتیب در اعداد صفر، 1، 3، 6، 12 و 24 ضرب شدند و اعداد حاصل با هم جمع شدند و بر مجموع تعداد غده‌ها تقسیم شدند. عدد حاصل، شدت آلودگی هر انبار تعیین شد. برای اینکه تفاوت بین انبارها از نظر شدت آلودگی بررسی و آزمون آماری بین آن‌ها انجام شود، انبارها به‌عنوان تیمار در نظر گرفته شدند و تفاوت آماری آن‌ها در قالب طرح کاملاً تصادفی در 3 تکرار بررسی شد. از آزمون اختلاف معنی‌دار قابل‌اعتماد توکی[29] برای مقایسه میانگین انبارها از نظر صفت بررسی‌شده، استفاده شد.

کشت نمونه‌ها، جداسازی و خالص سازی قارچ‌ها: برای کشت و جداسازی اولیه قارچ‌ها، از هر پاکت حاوی نمونه، تعداد 2 غده انتخاب و با آب مقطر سترون شست‌وشو شدند. سپس، از محل بین بافت آلوده و سالم، قطعاتی به ابعاد 5/1 × 5/1 میلی‌متر مربع بریده و با الکل 70 درصد به‌مدت یک دقیقه و سپس با هیپوکلریت سدیم 1 درصد به‌مدت سه دقیقه ضدعفونی سطحی شدند. به‌منظور حذف هیپوکلریت سدیم، غده‌ها سه مرتبه با آب مقطر سترون شست‌وشو و برای آبگیری روی کاغذ صافی استریل قرار داده شدند. سپس 5-3 قطعه از هر نمونه روی محیط کشت سیب‌زمینی- دکستروز- آگار[30] داخل تشتک‌های پتری قرار داده شدند. تشتک‌های پتری در دمای 25 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 7-3 روز داخل انکوباتور نگهداری شدند و پس از تشکیل پرگنه قارچ، از حاشیه پرگنه قطعات کوچکی به محیط سیب‌زمینی- دکستروز- آگار جدید انتقال داده شد. ظروف پتری به‌مدت 5-3 روز در دمای 25 درجه سانتی‌گراد نگهداری و کلنی‌های به‌دست‌آمده به محیط برگ میخک- آگار[31] منتقل شدند. از کلنی‌های رشدکرده در این محیط با استفاده از روش تک اسپور و نوک ریسه کشت جدید و خالص تهیه شد.

برای تهیه محیط کشت برگ میخک- آگار، محیط کشت آب- آگار[32] 2درصد در تشتک پتری ریخته شد و قبل از منعقدشدن محیط کشت، 4-3 قطعه برگ میخک خشک و استریل به آن اضافه شد. یکی از مزایای این محیط، تسریع در کنیدی‌زایی است و معمولاً کنیدیوم‌های دوکی‌شکل تیپیک (یکی از ویژگی‌های لازم برای تشخیص گونه) روی آن تشکیل می‌شوند و شرایط طبیعی را برای رشد قارچ فراهم می‌کند. این محیط کشت از نظر میزان کربوهیدرات‌ها فقیر است، بنابراین قارچ روی آن به‌صورت پراکنده رشد می‌کند. در نتیجه، مشاهده برخی از ویژگی‌های تاکسونومیکی مانند زنجیره میکروکنیدیوم، سرهای دروغین[33]، منوفیالید[34] و اسپورودوکیوم[35] را امکان‌پذیر می‌کند.

نگهداری نمونه‌ها: برای نگهداری جدایه‌های خالص شده و به منظور عدم تغییر در بیماری‌زایی آن‌ها و محافظت در مقابل آلودگی‌ها، جدایه‌های خالص شده به لوله آزمایش حاوی محیط کشت سیب‌زمینی- دکستروز- آگار منتقل و در دمای 4 درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند.

اثبات بیماری‌زایی جدایه‌ها: برای اثبات بیماری‌زایی جدایه‌ها، از غده‌های سیب زمینی رقم آگریا تهیه‌شده از مؤسسه تحقیقات اصلاح و تهیه نهال و بذر[36] کرج استفاده شد. برای هر جدایه از سه غده سیب‌زمینی هم‌شکل استفاده شد. به‌منظور حذف خاک و ذرات گرد و غبار، غده‌ها ابتدا شسته شدند. برای ضدعفونی سطحی، ابتدا غده‌ها به‌مدت 10 دقیقه درون هیپوکلریت سدیم 5درصد غوطه‌ور و سپس جهت حذف محلول هیپوکلریت سدیم، سه بار با آب مقطر سترون شست‌وشو شدند. همچنین به‌منظور ضدعفونی مجدد، یک بار دیگر غده‌ها با پنبه آغشته به اتانول 95درصد ضدعفونی سطحی و در معرض هوا خشک شدند. سپس با استفاده از چوب‌پنبه سوراخ‌کن، حفره‌هایی به عمق و پهنای 6 میلی‌متر در غده‌های سیب‌زمینی ایجاد شد (24 و 25).

سپس برش‌هایی به قطر 5/0 سانتی‌متر مربع از پرگنه‌های جوان جدایه‌های قارچی روی سطح محیط سیب‌زمینی- دکستروز- آگار، جدا و در داخل حفره‌های ایجادشده در غده‌های سیب‌زمینی قرار داده شدند. سطح حفره‌ها با استفاده از پارافیلم پوشانده شد و غده‌ها در داخل انکوباتور با دمای 20 درجه سانتی‌گراد به‌مدت سه هفته در وضعیت تاریکی نگهداری شدند. در نمونه‌های شاهد از قطعات محیط کشت سترون سیب‌زمینی- دکستروز- آگار استفاده شد. بعد از سه هفته، غده‌های سیب‌زمینی بررسی شدند و با استفاده از یک چاقوی سترون از وسط حفره‌ها برش تهیه شد و در صورت ایجاد و پیشرفت بیماری، از محل بین بافت سالم و آلوده برش‌هایی به‌قطر یک سانتی‌متر مربع جدا و به محیط کشت سیب‌زمینی- دکستروز- آگار انتقال داده شد و کشت‌ها در انکوباتور در دمای 24 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 4 روز نگهداری شدند (22).

تشخیص گونه‌ها: به‌منظور شناسایی گونه‌های مختلف فوزاریوم از منابع معتبر و محیط‌های غذایی و شرایط دمایی و نوری مختلفی به شرح زیر استفاده شد:

کشت جدایه‌ها روی محیط‌های غذایی: برای شناسایی گونه‌های فوزاریوم از محیط‌های کشت برگ میخک- آگار و سیب‌زمینی- دکستروز- آگار استفاده شد (26). برای کشت جدایه‌ها روی محیط غذایی، از جدایه‌های تک‌اسپور‌شده استفاده شد. به‌منظور دستیابی به اندام‌هایی مانند اسپوردوکیوم، سرهای دروغین و میکروکنیدی و ماکروکنیدی، جدایه‌ها روی محیط برگ میخک- آگار و در نزدیکی برگ‌های میخک کشت شدند. وجود برگ‌های میخک در محیط موجب می‌شود قارچ روی برگ‌ها، اسپوردوکیوم حاوی ماکروکنیدیوم و در سطح آگار، کنیدیوفورهای حامل میکروکنیدی تولید کند. تشکیل کلامیدوسپور در محیط برگ میخک- آگار، دو هفته به طول می‌انجامد که یک معیار مهم در شناسایی بعضی گونه‌های فوزاریوم است.

فوزاریوم‌ها برای اسپورزایی و تشکیل رنگدانه به نور ماوراء بنفش و درجه حرارت متناوب (20 درجه سانتی‌گراد در شب و 25 درجه سانتی‌گراد در روز) احتیاج دارند. برای تشخیص و شناسایی گونه‌های فوزاریوم در آزمایشگاه، کشت‌ها در شرایطی نگهداری شدند که حرارت روزانه 25 درجه سانتی‌گراد و حرارت شبانه 20 درجه سانتی‌گراد و نیز 12 ساعت نور و 12 ساعت تاریکی فراهم باشد (4، 27 و 28). بنابراین تشتک‌های حاوی کشت قارچ در داخل انکوباتور با شرایط دمایی و نوری یادشده به‌مدت دو هفته قرار داده شدند.

تشخیص گونه‌ها: پرگنه‌ها پس از رشد و تشکیل کنیدیوم روی برگ میخک بعد از 14روز، برپایه ویژگی‌های ظاهری از قبیل نوع فیالید (مونوفیالید یا پلی فیالید)، وجود یا نبود کلامیدوسپور، شکل ماکروکنیدیوم، وجود یا نبود میکروکنیدیوم، نحوه قرارگرفتن میکروکنیدیوم (در سرهای دروغین، به‌صورت زنجیره یا به هر دو صورت) تشخیص داده شدند. از محیط سیب‌زمینی– دکستروز – آگار تنها برای تعیین رنگ، نرخ رشد، نحوه رشد پرگنه و همچنین برای نگهداری میان‌مدت جدایه‌ها استفاده شد (26). برای شناسایی گونه‌های فوزاریوم از کلیدهای معتبر موجود (27 و 28) استفاده شد. در این پژوهش شناسایی گونه‌های فوزاریوم تنها براساس مشخصات فرم غیرجنسی انجام شد.

بررسی مقاومت ارقام: ارقام استفاده‌شده در این بخش شامل سبلان[37]، آگریا[38]، بورن[39]، خاوران[40] و لاین 3970093 بودند که غده‌های بذری آن‌ها از مؤسسه تحقیقات اصلاح و تهیه نهال و بذر کرج تهیه شدند. جهت تهیه مایه تلقیح، جدایه‌های خالص‌شده 4 گونه شناسایی شده فوزاریوم به محیط سیب‌زمینی– دکستروز – آگار منتقل شدند و در دمای 25 درجه سانتی‌گراد در داخل انکوباتور قرار گرفتند. بعد از گذشت 7 روز، از پرگنه‌های حاوی اسپور کشت‌های موردِنظر، سوسپانسیون اسپور با غلظت10⁴×1 اسپور در هر میلی‌لیتر تهیه شد.

در این بررسی از غده‌های سیب‌زمینی هم‌اندازه استفاده شد. به‌منظور حذف خاک و ذرات گرد و غبار، ابتدا غده‌ها با جریان آب شسته شدند. سپس غده‌ها به‌مدت 24 ساعت در دمای اتاق قرار گرفتند تا خشک شوند. غده‌های سیب‌زمینی پس از ضدعفونی سطحی با هیپوکلریت سدیم 5درصد به‌مدت 10 تا 15 دقیقه با آب سترون شست‌وشو شدند. آنگاه با چاقوی سترون برش‌هایی عرضی به‌ضخامت 10 میلی‌متر از غده‌های سیب‌زمینی تهیه شد و قطعات با آب مقطر سترون شست‌وشو داده شدند. قطعات روی کاغذ صافی سترون در داخل تشتک‌های پتری 10سانتی‌متری قرار داده شدند و به‌مدت 2 ساعت قبل از تلقیح به همان حالت قرار گرفتند.

قطعات سیب‌زمینی توسط سوسپانسیون اسپور جدایه‌های موردِنظر تلقیح شدند. مقدار مناسب از سوسپانسیون اسپور با غلظت مذکور بر روی هر برش سیب‌زمینی قرار داده شد و بعد از مسدودکردن درب تشتک‌های پتری با پارافیلم، تشتک‌ها به‌مدت 4 روز در تاریکی و در دمای 1± 25 درجه سانتی‌گراد قرار داده شدند. آزمایش در قالب طرح فاکتوریل با دو عامل ارقام سیب‌زمینی و گونه‌های فوزاریوم و به‌صورت کاملاً تصادفی با چهار تکرار طراحی شد که ارقام سیب‌زمینی دارای 5 سطح و گونه‌های فوزاریوم دارای چهار سطح بودند.

برای ارزیابی شدت بیماری حاصل از 4 گونه فوزاریوم روی 5 رقم مختلف سیب‌زمینی، از مقیاس ارائه‌شده در جدول 1 استفاده شد (29).

نتایج.

تعیین شدت آلودگی انبارها و جمع‌آوری نمونه‌ها: طی سال 1391- 1390 پس از بازدید از انبارهای شهرستان اردبیل، در مجموع 150 نمونه سیب‌زمینی آلوده به پوسیدگی خشک جمع‌آوری شد. همچنین شدت پوسیدگی غده‌ها برای هر انبار تعیین شد. نتایج حاصل از تجزیه واریانس شدت آلودگی انبارها در شهرستان اردبیل نشان داد، به‌لحاظ آماری اختلاف معنی‌داری بین انبارهای بررسی‌شده از نظر شدت آلودگی در سطح احتمال 1درصد وجود داشت (جدول 2).

جدول 1- شاخص ارزیابی شدت بیماری پوسیدگی خشک سیب‌زمینی حاصل از گونه‌های مختلف فوزاریوم

جدول 2- تجزیه واریانس شدت آلودگی انبارهای مختلف سیب‌زمینی شهرستان اردبیل به بیماری پوسیدگی خشک

** معنی‌دار در سطح احتمال ۱ درصد

شکل 1- مقایسه میانگین شدت آلودگی انبارهای مختلف سیب‌زمینی شهرستان اردبیل به بیماری پوسیدگی خشک

مقایسه میانگین شدت آلودگی انبارهای شهرستان اردبیل نشان داد، انبار منطقه حکیم قشلاقی دارای بالاترین شدت آلودگی یعنی 304/0درصد بود و با انبارهای مناطق باروق، تورپاقلو، محمودآباد، جوراب، گیلانده و بابولان در یگ گروه آماری قرار گرفت و با سایر انبارها اختلاف معنی‌دار داشت (شکل 1).

جداسازی و خالص‌سازی قارچ‌ها: در بخش جداسازی عوامل ایجادکننده پوسیدگی خشک، در مجموع 84 جدایه به دست آمد که 23 جدایه به گونه فوزاریوم سولانی، 21 جدایه به گونه فوزاریوم اکسیسپوروم، 18 جدایه به گونه فوزازیوم اسپوروتریکیویدس و 14 جدایه به گونه فوزاریوم پوآ[41] تعلق داشتند. همچنین 2 جدایه به آلترناریا[42]، 3 جدایه به آسپرژیلوس[43] و 3 جدایه به کلوتوتریکوم[44] تعلق داشتند. گونه فوزاریوم سولانی که 18/27 درصد از کل جدایه‌ها را شامل شد از انبارهای گرجان، باروق، شهریور، جبه دار، صومعه، تورپاقلو، یونجالو، خرابه کهل، قاسم قشلاقی، زرناس، آق بولاق، الماس، خشکرود، نیار و نیارق به دست آمد. گونه فوزاریوم اکسیسپوروم با فراوانی 25 درصد از کل جدایه‌ها از انبارهای باروق، گرجان، آقا باقر، سلطان آباد، بابولان، کرکرق، الماس، خشکرود، نیار، تورپاقلو، خرابه کهل و دیجوجین به دست آمد. گونه فوزاریوم اسپوروتریکیویدس که 21 درصد از کل جدایه‌ها را شامل شد از انبارهای باروق، گرجان، شهریور، محمود آباد، یونجالو، کرکرق و نیار جداسازی شد. همچنین گونه فوزاریوم پوآ که 16درصد گونه فوزاریوم پوآ که 16 درصد از کل جدایه­ها را شامل شد از انبارهای جوراب، ارجستان، گیلانده، بابولان، سلطان آباد و آقا باقر شهرستان اردبیل به دست آمد. براساس نتایج به‌دست‌آمده گونه فوزاریوم سولانی از پراکنش گسترده‌ای در انبارهای شهرستان اردبیل برخوردار بوده و تقریباً در تمامی انبارهای شهرستان وجود داشت.

اثبات بیماری‌زایی جدایه‌ها: نتیجه آزمون بیماری‌زایی نشان داد از بین جدایه‌های حاصل، 20 جدایه باعث ایجاد پوسیدگی خشک شدند. علائم ظاهری بیماری روی رقم آگریا به‌صورت لکه‌های قهوه‌ای کوچک بود که به‌کندی پیشروی کردند و پوسته روی لکه‌ها فرورفته و چروکیده و مرکز آن‌ها خشک و مرده بود. قسمت‌های داخلی لکه‌ها به‌رنگ قهوه‌ای و حاشیه آن‌ها روشن‌تر بود. علائم آلودگی با توجه به گونه فوزاریوم به‌صورت لکه‌های سیاه، قهوه‌ای آبسوخته و زرد یا صورتی متغیر بود (شکل 2). از لکه‏های فوق مجدداً جداسازی قارچ انجام شد. در جدایه‌های بیماری‌زا قارچ جداشده با جدایه تست‌شده از لحاظ مشخصات ظاهری و رشدی مطابقت داشت.

تشخیص گونه‌ها: شناسایی جدایه‌ها به کمک منابع معتبر علمی (27 و 28) انجام شد. بر این ‌اساس 4 گونه فوزاریوم شناسایی شدند.

گونهفوزاریوم پوآ: میزان رشد کلنی این گونه روی محیط کشت سیب‌زمینی- دکستروز- آگار پس از 4 روز در دمای 25 درجه سانتی‌گراد، 5/5-2/4 سانتی‌متر بود (شکل 3).

شکل 2- الف: آزمون بیماری‌زایی روی رقم آگریا، ب: جداسازی مجدد قارچ عامل بیماری از غده‌های مایه‌زنی‌شده با قارچ، ج: غده‌های مایه‌زنی‌شده درون انکوباتور

این گونه روی محیط سیب‌زمینی- دکستروز- آگار میسیلیوم‌های متراکم کرکدار تولید کرد که در ابتدا سفید بودند و به مرور زمان، رنگ آن‌ها سفید متمایل به صورتی تا قهوه‌ای شد. تولید اسپوردوکیوم در این گونه نادر بود، ولی میکروکنیدی‌ها به‌صورت فراوان تشکیل شدند. رنگ کلنی در آگار به‌شکل خاکستری تا قرمز تیره بود.

قارچ فوق روی محیط برگ میخک- آگار، تعداد کمی ماکروکنیدی تولید کرد که نسبتاً کوتاه، داسی‌شکل و معمولاً دارای سه جداره عرضی بودند و سلول‌های انتهایی آن‌ها کمی انحنا داشتند. سلول پایه به‌شکل پاشنه‌دار و یا دارای کمی فرورفتگی بود. ماکروکنیدی از فیالیدهای منفرد، روی کنیدیوفورهای منشعب و یا مستقیماً روی میسیلیوم تولید شد. میکروکنیدی‌ها فراوان و عمدتاً گرد و گاهی لیمویی‌شکل و گاهی کمی نوک‌تیز بودند. میکروکنیدی‌ها از فیالیدهای منفرد جامی‌شکل در روی کنیدیوفورهای متراکم و خوشه‌ای تشکیل شدند (شکل 4). در این گونه کلامیدوسپور تشکیل نشد.

با توجه به مشخصات یادشده و مقایسه آن با منابع بوس[45] (27) و نلسون[46] و همکاران (28) قارچ فوق به‌عنوان گونه فوزاریوم پوآ تعیین نام شد.

شکل 3- سطح رویی پرگنه فوزاریوم پوآ در محیط سیب‌زمینی- دکستروز- آگار

شکل 4- الف: ماکروکنیدی، ب: میکروکنیدی و ماکروکنیدی و ج: میکروکنیدی قارچ فوزاریوم پوآ در محیط برگ میخک - آگار

(مقیاس20 میکرون)

گونه فوزاریوم اسپوروتریکیویدس: میزان رشد پرگنه‌های قارچ روی محیط کشت سیب‌زمینی- دکستروز- آگار پس از 4 روز در دمای 25 درجه سانتی‌گراد، 1/5- 5/3 سانتی‌متر بود (شکل 5).

این گونه روی محیط یادشده میسیلیوم‌های فراوان پنبه‌ای تولید کرد که در ابتدا سفید و بعد به سفید متمایل به صورتی تا نارنجی متمایل به قهوه‌ای تغییر رنگ دادند. اسپوردوکیوم‌های نارنجی کم‌رنگ گاهی در کشت‌های کهنه مشاهده شدند. رنگ کلنی از پشت تشتک پتری قرمز تیره بود.

روی محیط برگ میخک- آگار، ماکروکنیدی‌ها به‌صورت فراوان در اسپوردوکیوم‌های نارنجی‌رنگ تشکیل شدند. طول آن‌ها متوسط و دارای 3 تا 5 جدار عرضی بودند و شکل ماکروکنیدی‌ها داسی‌شکل و سلول انتهایی آن‌ها کشیده و سلول پایه به‌صورت پاشنه پا یا دارای کمی فرورفتگی بود. ماکروکنیدی‌ها از فیالیدهای منفرد و کنیدیوفورهای منشعب در روی اسپوردوکیوم‌ها تشکیل شدند و به‌ندرت بر روی فیالیدهای منفرد و مستقیماً روی هیف تشکیل شدند. میکروکنیدی‌ها به‌صورت فراوان بر روی فیالیدهای مجتمع تشکیل شدند. میکروکنیدی‌ها به اشکال تخم‌مرغی، گلابی، دوکی و یک تا دوسلولی بودند و غالباً یک برجستگی در انتها داشتند (شکل 6). کلامیدوسپورها به‌وفور در کشت‌های کهنه تشکیل شدند. کلامیدوسپورها منفرد یا زنجیری یا خوشه‌ای بودند و چنانچه رسیده و کامل بودند، به‌صورت قهوه‌ای کم‌رنگ مشاهده شدند.

مشخصات فوق با منابع بوس (27) و نلسون و همکاران (28) مطابقت داشت؛ لذا تحت گونه یادشده نام‌گذاری شد.

شکل 5- قارچ فوزاریوم اسپوروتریکیویدس، الف: تشکیل اسپورودوکیوم کرم‌رنگ بعد از یک هفته روی محیط برگ میخک- آگار، ب: تولید رنگدانه ارغوانی‌رنگ در محیط برگ میخک- آگار، ج: کلامیدوسپورهای منفرد و زنجیری روی محیط برگ میخک- آگار، د: سطح رویی پرگنه قارچ در محیط سیب‌زمینی- دکستروز- آگار

شکل 6- قارچ فوزاریوم اسپوروتریکیویدس، الف: ماکروکنیدی، ب: میکروکنیدی‌های دوکی و ماکروکنیدی، ج: میکروکنیدی‌های گلابی‌شکل (مقیاس 20 میکرون)

گونه فوزاریوم اکسیسپوروم: میزان رشد کلنی روی محیط کشت سیب‌زمینی- دکستروز- آگار پس از 4 روز در دمای 25 درجه سانتی‌گراد، 5/5-7/4 سانتی‌متر بود (شکل 7).

شکل ظاهری کلنی روی محیط مذکور در این گونه بسیار متغیر بود. میسیلیوم‌های پنبه‌ای و پراکنده و گاهی متراکم با رنگ‌های سفید و بنفش کم‌رنگ مشاهده شدند. در بعضی جدایه‌ها، ماکروکنیدی‌های فراوان به‌صورت یک توده در سطح کلنی تشکیل شدند. رگه‌های قهوه‌ای کم‌رنگ، آبی یا بنفش در این گونه تشکیل شدند. گرچه این گونه در داخل آگار رنگدانه‌های کم‌رنگ تا بنفش تیره تولید کرد، بعضی جدایه‌ها اساساً بی‌رنگ بودند. کلنی این گونه گاهی به‌راحتی تغییر ماهیت داد که در این حالت به‌صورت یک لایه آبکی با میسلیوم‌های کم مشاهده شد.

روی محیط برگ میخک- آگار، ماکروکنیدی‌ها در اسپوردوکیوم‌های فراوان و نارنجی کم‌رنگ تولید شدند. طول آن‌ها کم یا متوسط بود. ماکروکنیدی‌ها داسی‌شکل تا قایقی‌شکل تا کمی کشیده و دارای سه جدار عرضی نازک بودند و در دو طرف به یک نقطه منتهی شدند و روی فیالیدهای منفرد و یا کنیدیوفورهای منشعب تولید شدند. میکروکنیدی‌ها عموماً به‌صورت سرهای دروغین روی فیالیدهای منفرد و کوتاه تشکیل شدند. میکروکنیدی‌ها معمولاً تک‌سلولی، تخم‌مرغی، بیضوی و یا قلوه‌ای‌شکل بودند.

کلامیدوسپورها به‌فراوانی و البته به‌کندی تولید شدند و گاهی تولید آن‌ها 3 تا 6 هفته طول کشید، ولی به‌راحتی در سطح کلنی روی ریسه‌ها قابلِ‌مشاهده بودند. مشخصات فوق با منابع بوس (27) و نلسون و همکاران (28) مطابقت داشت و تحت گونه یادشده نام‌گذاری شد.

شکل 7- قارچ فوزاریوم اکسیسپوروم، الف: سطح رویی پرگنه قارچ در محیط سیب‌زمینی- دکستروز- آگار، ب: کلامیدوسپورهای منفرد و زنجیری در محیط برگ میخک- آگار، ج: اسپورودوکیوم در محیط برگ میخک- آگار، د: ماکروکنیدی، ه: میکروکنیدی روی فیالید منفرد به‌صورت سرهای دروغین (مقیاس 20 میکرون)، و: ماکروکنیدی های تشکیل‌شده روی اسپورودوکیوم

گونه فوزاریوم سولانی:میزان رشد کلنی روی محیط کشت سیب‌زمینی- دکستروز- آگار پس از 4 روز در دمای 25 درجه سانتی‌گراد، 7/4-2/3 سانتی‌متر بود (شکل 8). این گونه روی محیط یادشده میسیلیوم‌های سفید تا کرم‌رنگ و به‌صورت پراکنده و پنبه‌ای تولید کرد. تولید انبوه ماکروکنیدی روی اسپوردوکیوم‌های کرم یا سبز متمایل به آبی از مشخصات این گونه بود. بعضی جدایه‌ها رنگی نبودند ولی بعضاً تولید رنگدانه‌های بنفش کم‌رنگ یا قهوه‌ای کم‌رنگ کردند. رگه‌های رنگی گاهی در محیط کشت به وجود آمدند.

روی محیط برگ میخک- آگار، ماکروکنیدی‌ها روی اسپوردوکیوم‌های کرم‌رنگ تولید شدند. ماکروکنیدی‌ها عموماً سوسیسی‌شکل بوده و قطر (پهنای) آن‌ها زیاد بود. ماکروکنیدی‌ها کمی خمیده و دارای 4-3 جدار عرضی بودند و عمدتاً دیواره‌های ضخیم داشتند. ماکروکنیدی‌ها از فیالیدهای منفرد کنیدیوفورهای منشعب روی اسپوردوکیوم تشکیل شدند. میکروکنیدی‌ها به‌صورت فراوان و عمدتاً مجتمع روی فیالیدهای منفرد طویل تشکیل شدند. میکروکنیدی‌ها یک یا دوسلولی، تخم‌مرغی و بیضوی یا قلوه‌ای‌شکل بودند. کلامیدوسپور به‌صورت فراوان در بسیاری از کشت‌ها و در خلال 2 تا 3 هفته تشکیل شد (شکل 8).مشخصات یاد شده با منابع بوس (27) و نلسون و همکاران (28) مطابقت داشت.

شکل 8- قارچ فوزاریوم سولانی، الف: سطح رویی پرگنه قارچ در محیط سیب‌زمینی- دکستروز- آگار، ب: کلامیدوسپور زنجیری‌شکل قارچ در محیط برگ میخک- آگار، ج: ماکروکنیدی، د: میکروکنیدی ه: ریسه (مقیاس 20 میکرون)

بررسی مقاومت ارقام: ارزیابی شدت بیماری حاصل از گونه‌های مختلف فوزاریوم روی ارقام مختلف سیب‌زمینی، با مایه‌کوبی سوسپانسیون اسپور روی سطح غده‌های برش‌خورده سیب‌زمینی و با استفاده از مقیاس الحسن[47] (29) و همکاران انجام شد. نتایج حاصل از تجزیه واریانس نشان داد، بین گونه‌های فوزاریوم بررسی‌شده از نظر قدرت بیماری‌زایی به‌لحاظ آماری اختلاف معنی‌دار وجود نداشت، اما بین ارقام مختلف سیب‌زمینی از نظر حساسیت به قارچ در سطح احتمال ۱درصد اختلاف معنی‌دار وجود داشت. همچنین این نتایج نشان داد بین اثر متقابل گونه‌های قارچ فوزاریوم و ارقام سیب‌زمینی بررسی‌شده در این آزمایش در سطح احتمال ۵درصد تفاوت معنی‌دار وجود داشت.

نتایج مقایسه میانگین حساسیت ارقام مختلف سیب‌زمینی نشان داد رقم بورن با کمترین میزان آلودگی (5/12درصد) با سایر ارقام اختلاف معنی‌داری داشت و به‌تنهایی در یک گروه آماری قرار گرفت و نسبت به سایر ارقام از مقاومت بیشتری نسبت به قارچ فوزاریوم برخوردار بود. از طرف دیگر رقم سبلان با بیشترین میزان آلودگی (875/98درصد) به همراه ارقام خاوران، آگریا و لاین 3970093 بیشترین حساسیت را نسبت به قارچ فوزاریوم داشتند و این ارقام با هم در یک گروه آماری قرار گرفتند (شکل 9).

شکل 9- مقایسه میانگین شدت آلودگی (بر اساس درصد) ارقام سیب‌زمینی نسبت به گونه‌های شناسایی‌شده قارچ فوزاریوم؛Fo، فوزاریوم اکسیسپوروم، Fp، فوزاریوم پوآ، Fs، فوزاریوم سولانی، Fsp، فوزاریوم اسپوروتریکیویدس