جداسازی و شناسایی مولکولی باکتری لاکتوباسیلوس برویس از سرکه بومی

مقدمه.

تولید سرکه با روش تخمیر قدمت چندهزارساله دارد. تمدن‌های بزرگ سرکه را می‌شناختند و برای آن ارزش خاصی قائل بودند و در بسیاری از موارد مانند ضدعفونی‌کردن، تسکین درد، درمان و تمییز‌کردن ظروف، از آن استفاده می‌کردند. رومیان و یونانیان از سرکه رقیق‌شده به‌عنوان یک نوشیدنی نشاط‌آور استفاده می‌کردند. پایه اصلی سرکه، اسید استیک است. این اسید به سرکه طعمی ترش می‌دهد و باعث آنتی‌سپتیک‌بودن آن می‌شود (1).

 اولین مرحله تولید سرکه، تخمیر الکلی است که فرایندی هوازی است و طی آن قند یا نشاسته به الکل تبدیل می‌شود. تشکیل الکل از قند با مخمرهای تولیدکننده الکل به‌خصوص ساکارومایسس سرویزیه[1] صورت می‌گیرد. مرحله دوم، مرحله اسیدسازی است. این مرحله عبارت است از اکسیداسیون اتانول به اسید استیک که به‌وسیله باکتری‌های جنس‌های استوباکتر[2]و گلوکونوباکتر[3] صورت می‌گیرد (2).

 سرکه دارای خواص و کاربردهای زیادی است. بسیاری از نسخه‌های طب سنتی از سرکه، عسل و ترکیب آن دو (سرکنگبین یا سکنجبین) استفاده شده است. براساس یافته‌های طب سنتی، استفاده از سرکه در کنار وعده‌های غذایی باعث رقیق‌شدن خون می‌شود، به تجزیه چربی‌ها و دفع سموم کمک می‌کند، سبب کاهش چربی خون می‌شود و هضم و جذب کلسیم را آسان می‌کند. سرکه می‌تواند باکتری‌های مضر دستگاه گوارش را از بین ببرد، ترشح اسید معده را متعادل کند و تولید گاز معده را تعدیل کند. سرکه در رفع جرم دندان و التهاب لثه مؤثر است. سرکه ضدعفونی‌کننده قوی است و می‌تواند به عملکرد سم‌زدایی کبد کمک کند و صفرا را کاهش دهد. سرکه ماده پایداری است، حتی اگر بعد از مدتی کدر شود و رسوب کند، همچنان خاصیت دارد (3).

سرکه طبیعی سیب به‌عنوان یکی از غذاهای طبیعی کامل شناخته شده است که حاوی پتاسیم، سدیم، فسفر، منیزیوم، گوگرد، آهن، مس، فلوئور، سیلیس، ویتامین‌های C، A، E، B1، B2، B6، بتاکاروتن و نوعی فلاونوئید، است. بتاکاروتن یکی از مؤثرترین آنتی‌اکسیدان‌ها است. پتاسیم که عنصر جوانی نیز نامیده می‌شود، باعث نرم‌شدن و انعطاف‌پذیری ماهیچه‌های بدن می‌شود و برای رشد و استحکام استخوان‌ها نیز اهمیت دارد (1). ادعا شده که سرکه سیب برای پاک‌سازی بدن از مواد سمی، درمان سردرد، ازبین‌بردن پینه، خال‌های پوستی و زگیل، درمان آفتاب‌سوختگی، درمان ناراحتی‌های گلو، تقویت قلب و دستگاه گوارش، کاهش ناراحتی‌های کلیه و مثانه، بهبود آرتروز، جلوگیری از خونریزی بینی، رفع یبوست و... مفید است (4).

به عبارتی می‌توان گفت سرکه یک غذای عملگرا و یا فراسودمند[4] است. غذاهای عملکردی، فراسودمند یا عملگرا غذاهایی هستند که علاوه بر خواص تغذیه‌ای پایه، دارای مزایای فیزیولوژیک هستند و در کاهش خطر ابتلا به بیماری‌های سخت و مزمن، و کمک به سلامت انسان مؤثرند (5).

 سرکه حاوی باکتری‌های اسید استیک و مخمر است که در تولید سرکه نقش دارند؛ علاوه‌بر‌این ریزسازواره‌ها، سرکه حاوی باکتری‌های اسید لاکتیک[5] (LAB) نیز هست که باعث بهبود طعم آن می‌شوند (6 و 7).

 باکتری‌های اسید لاکتیک، گروه مهمی از باکتری‌ها هستند که به‌طور وسیعی در محیط پراکنده شده‌اند و در انواع غذاهای تخمیری، سبزیجات، مخاط و روده انسان و حیوانات یافت می‌شوند. این باکتری‌های کوکوباسیل یا میله‌ای‌شکل، بی‌هوازی تا هوازی اختیاری، گرم مثبت، با درصد پایین سیتوزین و گوانین، تحمل‌کننده اسید، معمولاً بدون اسپور، کاتالاز و اکسیداز منفی، هستند که براساس ویژگی‌های متابولیکی و فیزیولوژیکی دسته‌بندی می‌شوند. این باکتری‌ها معمولاً در گیاهان درحالِ‌تجزیه و محصولات وابسته به شیر یافت می‌شوند و محصول نهایی تخمیر آن‌ها اسید لاکتیک است. درباره تعیین حدود این گروه بحث می‌شود. اگرچه لاکتوباسیلوس، لوکونوستوک، پدیوکوکوس و استرپتوکوکوس از گذشته دور هسته اصلی این گروه را تشکیل می‌دادند، براساس طبقه‌بندی یافته‌های جدید امروزه 20 جنس مختلف به این گروه نسبت داده می‌شود. طبقه‌بندی باکتری‌های اسید لاکتیک در جنس‌های مختلف براساس خصوصیات مورفولوژیکی، نحوه تخمیر گلوکز، رشد در غلظت‌های مختلف نمک و تحمل شرایط اسیدی و قلیایی است. از نشان‌های شیمیایی مانند ترکیب اسیدهای چرب و ساختار دیواره سلولی نیز در طبقه‌بندی استفاده می‌شود. این دسته از باکتری‌ها به‌ندرت با عفونت‌های دستگاه گوارش یا سایر دستگاه‌های بدن در ارتباط هستند و سویه‌هایی که از نظر اکولوژیکی استفاده می‌شوند، در دسته باکتری‌های بی‌خطر قرار دارند (8-14). افزودن سویه‌های خاصی از باکتری‌های اسید لاکتیک به مواد غذایی، می‌تواند باعث پیشگیری از ابتلا به برخی بیماری‌ها شود و به‌عنوان یک عامل تحریک‌کننده دستگاه ایمنی عمل کند (15 و 16). مکانیسم‌هایی برای توجیه اثرات پیش‌گیری‌کننده و درمانی آن‌ها در بیماری‌های انسان پیشنهاد شده است که از آن جمله می‌توان به تولید ترکیبات مهارکننده باکتری‌ها، تعدیلpH روده، تقویت دستگاه ایمنی، انسداد جایگاه‌های اتصال باکتری‌ها و رقابت برای جذب مواد غذایی اشاره کرد (17 و 18). تولید اسیدهای آلی مانند اسید استیک، اسید پروپیونیک، فنیل لاکتیک اسید، اسید فرمیک یا اسیدهای چرب آزاد، آمونیاک، دی استیل، پراکسید هیدروژن، اسیدهای آمینه و...کاهش پتانسیل احیا، سنتز آنتی‌بیوتیک‌ها و باکتریوسین‌ها است که همگی به‌عنوان آنتی‌بیوز[6] تعریف می‌شوند در اثر ضدمیکربی آن‌ها مؤثر شمرده شده‌اند (19). علاوه‌بر ‌این‌ها می‌توان اتانل، دی آمین استوئین، استالدئید، بنزوات، لانتی‌بیوتیک‌ها، آنتی‌بیوتیک‌ها، رئوترین، رئوتریساکلین را نام برد (5 و 20). باکتری‌های اسیدلاکتیک به‌عنوان بخش مهمی از صنعت غذاسازی به‌خصوص در تولید غذاهای تخمیری به حساب می‌آیند؛ زیرا سویه‌های مختلف ویژگی‌های تخمیری متعددی مانند توانایی تولید اسید، طعم و مزه مختلف را دارند (6). بدون شک مهم‌ترین کاربرد باکتری‌های اسید لاکتیک، کاربرد آن‌ها به‌عنوان آغازگر در تولید محصولات لبنی تخمیری است. گونه‌های متفاوتی از باکتری‌های اسید لاکتیک به‌عنوان پروبیوتیک شناسایی شده‌اند که دو گروه عمده از ریزسازواره‌های پروبیوتیکی، لاکتوباسیلوس‌ها[7] و بیفیدوباکتریوم‌ها[8] هستند (20) ولی بیشترین گونه‌ها به لاکتوباسیل‌ها مربوط می‌شوند.

 لاکتوباسیلوس‌ها از طرفی آثار مفیدی بر سلامت انسان دارند و از طرف دیگر میزان قابلِ‌توجهی از گاماآمینوبوتریک اسید (گابا) را تولید می‌کنند که خود دارای تأثیرات فیزیولوژیک بسیار مهم است و در درمان اختلالاتی نظیر هیجان و فشار خون مؤثر است ؛ لذا در این تحقیق حضور لاکتوباسیلوس‌ها در سرکه بررسی شد.

‏‏مواد و روش ‏ها.

تهیة سرکه: یک نمونه سرکه سیب و دو نمونه سرکه انگور خانگی، پس از کسب اطلاعات لازم از روند تولید آن‌ها تهیه شد.

 محیط‌های کشت MRS و M17: محیط‌های کشت مایع و جامدMRS (سیگما آلدریچ[9]) برای کشت گونه‌های لاکتوباسیلوس به کار رفت. محیط کشت MRS به دو صورت مایع و جامد مطابق دستورالعمل شرکت سازنده تهیه و استفاده شد. از محیط کشت M17 (سیگما آلدریچ) نیز به‌منظور کشت سویه‌های لاکتوکوکوس[10] استفاده شد. محیط کشت M17 نیز به دو صورت مایع و جامد استفاده شد.

 جداسازی لاکتوباسیلوس ‌ها از سرکه: ابتدا پودر نیستاتین تحت شرایط استریل در 12 میلی‌لیتر آب مقطر تزریقی حل شد. سپس محیط کشت MRS مایع تهیه شد و نیستاتین به‌مقدار 50 تا 150 واحد در میلی‌لیتر به محیط کشت اضافه شد (به‌منظور جلوگیری از رشد مخمر و قارچ)، سپس 1 سی‌سی از سرکه (سانتریفوژشده با دور rpm 4000 به‌مدت 10 دقیقه) به محیط اضافه شد و به‌مدت 24 تا 48 ساعت در انکوباتور 37 سانتی‌گراد قرار داده شد. پس از رشد باکتری‌ها در محیط کشت مایع یک لوپ از هرکدام به محیط کشت MRS جامد دارای نیستاتین[11] انتقال داده شد و به‌همراه گاز پک به‌مدت 24 تا 48 ساعت در انکوباتور 37 سانتی‌گراد قرار داده شد. پس از رشد باکتری‌ها یک کلنی از هر پلیت مجدداً در محیط MRS جامد کشت داده شد و در شرایط مشابه گرماگذاری شد. این مرحله جهت حاصل‌شدن کلنی خالص تکرار شد.

جداسازی لاکتوکوکوس‌ها از سرکه: پس از تهیة محیط کشت M17 مایع، نیستاتین به‌مقدار 50 تا 150 واحد در میلی‌لیتر در مقیاس حجم به محیط کشت اضافه شد، سپس 1 میلی‌لیتر از سرکه مدِنظر به محیط اضافه شد و به‌مدت 24 تا 48 ساعت در انکوباتور 30 سانتی‌گراد قرار داده شد. این مراحل سه بار تکرار شد.

 آزمایش کاتالاز: آزمایش کاتالاز به‌منظور بررسی توانایی باکتری‌ها در تولید آنزیم کاتالاز انجام می‌شود. برای انجام آزمایش با لوپ سترون از نمونه میکروبی کشت‌داده‌شده (کلنی خالص) روی لام تمیز قرار می‌گیرد و سپس چند قطره پراکسید هیدروژن 3درصد (سیگما آلدریچ) روی آن اضافه می‌شود. اگر باکتری آنزیم کاتالاز داشته باشد،H₂O₂ را تجزیه می‌کند و حباب‌های گاز اکسیژن تولیدشده در سطح لام قابل مشاهده می‌شود. درصورت مشاهده‌نشدن حباب، باکتری کاتالاز منفی است.

آزمایش تخمیر کربوهیدرات‌ها: طبق جدول شماره ۱ محیط کشت پایه قندی تهیه شد، سپس محیط کشت در لوله‌های مجزا ریخته شد و 5/1درصد از قندهای مختلف به آن‌ها افزوده شد و در 115 سانتی‌گراد به‌مدت 10 دقیقه استریل شدند.

جدول 1- مواد و مقدار مورد نیاز برای محیط کشت قندی

 پس از تهیه محیط کشت مخصوص کربوهیدرات‌ها، یک کلنی از باکتری‌ها به محیط کشت تلقیح شدند و در انکوباتور 37 سانتی‌گراد به‌مدت 24 تا 48 ساعت قرار داده شدند. اگر قند را باکتری مصرف کند، رنگ محیط کشت به‌دلیل تولید اسید، زرد می‌شود. پس از انجام آزمایش، نتایج تخمیر کربوهیدرات‌ها با جدول استاندارد برگی مقایسه شد. قندهایی که در این آزمایش به کار برده شدند شامل آرابینوز، مالتوز، سلوبیوز، گزیلوز، مانیتول، لاکتوز، فروکتوز، ملزیتوز، سالیسین، رامنوز، گالاکتوز، آدنیتول، مانوز، ساکارز، دول‌سیتول، ترهالوز، رافینوز، گلوکز با لوله دورهام و ملبیوز بودند.

سایر آزمایش‌های بیوشیمیایی: لاکتوباسیلوس‌های جداشده از سرکه‌ها بر روی محیط MRS کشت داده شدند و به‌مدت 72 ساعت تا یک هفته در دماهای 15 و 45 سانتی‌گراد قرار داده شدند. توانایی رشد لاکتوباسیلوس‌های جداشده در محیط کشت MRS مایع دارای غلظت‌های 2، 4 و 5/6درصد )وزنی حجمی) NaCL و همچنین توانایی رشد در محیط کشت مایع با pHهای متفاوت (5/4 و 5/6) بررسی شد.

شناسایی مولکولی باکتری‌ها: برای شناسایی باکتری‌ها به‌روش مولکولی از PCR[12] استفاده شد. استخراج DNA باکتری با روش انجمادـذوب^[13] انجام شد؛ بدین صورت که یک کلنی از سطح محیط کشت جامد باکتری با استفاده از لوپ استریل برداشته شد و در 100 میکرولیتر آب مقطر استریل حل شد، سپس به‌مدت 20 دقیقه در فریزر با دمای منفی20 درجه سانتی‌گراد قرار داده شد. سپس از فریزر خارج شد و در دمای محیط قرار داده شد تا کاملاً ذوب شود. پس از آن مجدداً به‌مدت یک شب در فریزر منفی 20 درجه سانتی‌گراد قرار داده شد. از سوسپانسیون حاصل به‌صورت مستقیم به‌عنوان الگو برای واکنش PCR استفاده شد. با استفاده از سوسپانسیون به‌دست‌آمده و پرایمرهای DG47F، RW01R و 27F، 1492R، تکثیر ژن s rDNA16 انجام شد. توالی آغازگرهای DG47F و RW01R، به‌ترتیب 5´-AGGAGGTGATCCACCCGCA و
 5´-AACTGGAGGAAGGTGGGGAT و توالی آغازگرهای 27F و 1492R، به‌ترتیب
 5´- AGAGTTTGATCCTGGCTCAC و
 5´-CGGTTACCTTGT TACGAC TT است. شرایط دمایی انجام PCR بدین صورت بود: برای پرایمرهای 27F و 1492R: دمای ذوب اولیه 94 سانتی‌گراد (8 دقیقه)، دمای ذوب 94 سانتی‌گراد (30 ثانیه)، دمای اتصال 55 سانتی‌گراد (1 دقیقه) و دمای گسترش نهایی 72 سانتی‌گراد (10 دقیقه) و برای پرایمرهای DG47 و RW01: دمای ذوب اولیه 94 سانتی‌گراد (5 دقیقه)، دمای ذوب 95 سانتی‌گراد (1 دقیقه)، دمای گسترش 72 سانتی‌گراد (2 دقیقه) و دمای گسترش نهایی 72 سانتی‌گراد (10 دقیقه).

 سپس محصول PCR بر روی ژل آگارز برده شد. محصولی که باندی مشخص و بدون اسمیر داشت برای توالی‌یابی به شرکت زیست‌‌فناوران ارسال شد. برای تهیة ژل و انجام الکتروفورز، 2/0گرم از آگارز با ترازو وزن شد و 2 سی‌سی بافر x 1 TAE به آن اضافه شد (برای تهیة بافر X10، 48/4 گرم تریس بازی، 14/1 میلی لیتر اسید استیک گلاسیال و 37/0 گرم Na₂EDTA مخلوط شد سپس حجم محلول با آب مقطر به 100 سی‌سی رسانده شد) سپس حجم کل به 20 سی‌سی رسانده شد و بر روی هیتر قرار داده شد تا آگارز به‌طور کامل حل شود و محلول کاملاً شفاف شود. بعد از اینکه محلول کمی خنک شد، 4 میکرولیتر رنگ ژل، به آن اضافه شد و محتوای ارلن به‌آرامی داخل سینی ریخته شد، به‌طوری‌که حباب تشکیل نشود. سپس سینی ژل حاوی آگارز منعقدشده بعد از درآوردن شانه، در تانک الکتروفورز به‌صورت افقی قرار داده شد. بافر X 1 TAE به‌آرامی در تانک ریخته شد تا حداقل چند میلی‌لیتر روی سطح ژل را بپوشاند. از کلیة نمونه‌هایPCR شده، 3 تا 5 میکرولیتر برداشته شد و با 1 میکرولیتر بافر بارگذاری مخلوط شد و به‌آرامی وارد چاهک‌های ژل شد. تانک الکتروفورز به منبع جریان برق وصل شد، به‌طوری‌که چاهک‌ها به طرف قطب منفی باشد. ولتاژ دستگاه الکتروفورز بر روی 100 به‌مدت حداقل نیم ساعت تنظیم شد.

نتایج.

جداسازی لاکتوباسیلوس‌ها از سرکه: از دو نوع سرکه (یک نمونه سرکه سیب و دو نمونه سرکه انگور)، 12 نوع جدایه باکتری (شش جدایه از سرکه سیب و شش جدایه از سرکه انگور) جداسازی شد. تصاویر کلنی‌های تعدادی از آن‌ها در شکل -A1 نشان داده شده است.

جداسازی لاکتوکوکوس‌ها از سرکه: با توجه به اینکه مراحل جداسازی لاکتوکوکوس‌ها سه بار تکرار شد، بااین‌حال هیچ باکتری در محیط M17 رشد نکرد.

آزمایش کاتالاز و رنگ آمیزی گرم: پس از تهیة کشت خالص، آزمایش‌های کاتالاز و گرم برای باکتری‌های جداشده انجام شد. تمام باکتری‌ها کاتالاز منفی، گرم مثبت و میله‌ای‌شکل بودند. این نتایج با لاکتوباسیل‌ها هم‌خوانی دارد. تصاویر میکروسکپی تعدادی از آن‌ها بعد از رنگ‌آمیزی گرم، در شکل 1-B آمده است.

شکل 1- (A) کلنی‌های لاکتوباسیلوس‌های جداشده از انواع سرکه‌ها، (B) تصویر رنگ‌آمیزی گرم لاکتوباسیل‌های جداسازی‌شده از سرکه‌ها (C) تغییر رنگ محیط قندی با رشد باکتری

آزمایش تخمیر کربوهیدرات‌ها: نتایج مربوط به آزمون تخمیر کربوهیدرات‌ها در جدول 2 و تصویری از تغییر رنگ محیط کشت قندی در شکل 1-C نشان داده شده است.

 سایر آزمایش‌های بیوشیمیایی: باکتری‌های شماره 4، 5، 6، 7، 8، 9، 10، 11 و 12 (جدول 2) در دمای 15 سانتی‌گراد رشد کردند. باکتری شماره 12 نیز در دمای 45 سانتی‌گراد رشد کرد. تمام باکتری‌ها در غلظت‌های مختلف نمک و در pH 5/4 و 5/6 رشد کردند.

جدول 2- نتایج مربوط به آزمون تخمیر کربوهیدرات‌ها

؟: منظور نا مشخص بودن آزمون در این خصوص است.

شکل 2- الکتروفورز محصول PCR باکتری. ستون سمت چپ بیانگر نشانگر با اندازه (1kb)، ستون‌های شماره‌گذاری‌شده از 1 تا 7 به ترتیب نتایج PCR جدایه‌ها را با آغازگرهای 27F و 1492R، ستون‏های شماره‏گذاری‌شده از 8 تا 13 به‌ترتیب نتایج PCR جدایه‏ها را با آغازگرهای DG47F و RW01R، ستون 14 کنترل منفی نشان می‌دهد.