شناسایی، همسانه‌سازی و بررسی ویژگی‌های ژن انتقال‌دهنده هگزوز 6 (HXT6) مخمر ساکارومیسس سرویزیه سویه بومی IBRC-M30069

مقدمه.

بحران جهانی انرژی و این واقعیت که روزی سوخت‌های فسیلی تمام خواهد شد، از مهم‌ترین دغدغه‌های امروز بشر است. با توجه به رشد جمعیت جهان، مصرف زیاد انرژی، محدودیت منابع نفتی تأمین‌کننده انرژی و افزایش قیمت سوخت، جایگزینی یک منبع انرژی دیگر امری ضروری به شمار می‌رود. تولید اتانول از منابع ارزان‌قیمت به‌عنوان مکمل و یا حتی جایگزین سوخت‌های فسیلی، ضرورتی انکارناپذیر است. برخلاف سوخت‌های فسیلی، اتانول سوختی پاک و تجدیدپذیر است و به آن به‌عنوان یک سوخت سالم، ایمن و جایگزین توجه شده است (1 و 2).

بررسی‌ها نشان می‌دهد فراورده نهایی متابولیسم هگزوزها از جمله گلوکز، فروکتوز و مانوز در مخمر ساکارومایسس سرویزیه[1]در شرایط بی‌هوازی اتانول یا اسید لاکتیک است و اولین مرحله تنظیمی متابولیسم هگزوزها عبور آن‌ها از طریق انتشار تسهیل‌شده و وابسته به پروتئین‌های انتقال‌دهنده غشایی[2]HXT است. طبق اطلاعات موجود، خانواده انتقال‌دهنده هگزوزها در این گونه مخمر شامل پروتئین‌های Hxt1p-Hxt17p،Gal2p ، Snf3p و Rgt2p است. با افزایش فعالیت این انتقال‌دهنده‌ها، تجمع اتانول یا اسید لاکتیک در سلول‌ها بیشتر می‌شود (3). انتقال‌دهنده‌های Hxt1 تا Hxt17 در انتقال گلوکز نقش دارند، Gal2 برای انتقال گالاکتوز، Snf3 و Rgt2 به‌عنوان حسگر گلوکز عمل می‌کنند. این خانواده ژنی الگوی بیان متفاوتی دارند و تنظیم آن‌ها به‌شدت تحت ویژگی کینیتیک انتقال‌دهنده‌ها است و گلوکز اولین فاکتور کنترل‌کننده بیان است (4). HXT1- HXT7 جزو مهم‌ترین ناقلین هستند و از نظر متابولیسمی به هم شباهت دارند و با هم در ارتباط هستند (5). اثر بیان بیشینه این ژن‌ها در مخمرها مطالعه شده است و تولید اتانول را در سویه وحشی مخمر با سویه مهندسی‌شده مقایسه کردند. داده‌های به‌دست‌آمده نشان دادند که تظاهر بیش‌ازحد انتقال‌دهنده‌های هگزوز منجر به افزایش دریافت گلوکز شود. پژوهشگران نشان دادند که با تنظیم‌کردن اولین مرحله مسیر بیوسنتز گلوکز می‌توان منجر به تجمع اسیدلاکتیک شد، که افزایشی در حدود 15درصد در تولید اتانول در مقایسه با سویه وحشی مشاهده کردند (6 و 7).

Hxt6p و Hxt7p یک جفت انتقال‌دهنده هگزوز هستند. شباهت این دو پروتئین به هم خیلی زیاد است و هر دوی آن‌ها شامل 570 اسیدآمینه هستند این دو ژن پشت سر هم روی بازوی راست کروموزوم IV پایین دست HXT3 قرار دارند. شباهت بین آن‌ها 96 جفت باز قبل از کدون آغاز شروع می‌شود و حضور آن‌ها بدین صورت در اکثر استرین‌های آزمایشگاهی گزارش شده است. Hxt6p میل ترکیبی زیادی با گلوکز دارد و دارای میل ترکیبی زیاد Km=1 Mm برای گلوکز است (8- 10). بیان Hxt6p را همانند Hxt2p و Hxt4p غلظت زیاد گلوکز سرکوب می‌کند و تنها ژنی است که از بین این خانواده ژنی تنظیمات بیان آن را Snf3pکنترل می‌کند (8).

هدف این پژوهش، کلون ژن HXT6 با توالی صحیح در داخل وکتورpGEM-T و بررسی آن از نظر ترادف ژنی و آمینواسیدی است؛ همچنین ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی توالی پروتئینی به‌دست‌آمده با استفاده از بررسی‌های اختصاصی موجود در پایگاه Swiss-Prot پیش‌بینی شد و بررسی‌های فیلوژنتیکی با سایر ژن‌های این خانواده انجام شد.

‏‏مواد و روش ‏ها.

مخمر ساکارومیسس سرویزیه سویه بومی IBRC-M30069 از مرکز ملی ذخایر ژنتیکی و تنوع زیستی ایران تهیه شده است. نژاد Top10 باکتری اشرشیا کلای[3]، مارکر VC 1kb DNA Ladder و آنزیم و بافر T4 DNA لیگاز شرکت ویوانتس[4]، PCR Master Mix شرکت سیناژن[5]، سیستمpGEM-T وکتور شرکت پرومگا[6]، آنتی بیوتیک آمپی‌سیلین و آغازگرهای

F:5ˊATGTCACAAGACGCTGCTAT3ˊ R:5´CAACTTTCCAGCGTTCTTGA -3'

 استفاده شد. محیط کشت اختصاصی[7]YPDحاوی دکستروز، پپتون و عصاره مخمر از شرکت مرک[8] تهیه شده بود.

 pGEM-T یک پلاسمید خطی با Tی منفرد آویزان انتهایی در انتهاهای 3 است که به این شکل از حلقوی‌شدن پلاسمید جلوگیری می‌کند و کارایی واکنش لیگاسیون را با فراورده تکثیری PCR تولیدشده باDNA پلیمرازهای معین مقاوم به حرارت که یک A به انتهاهای 5 آن‌ها اضافه می‌کنند افزایش می‌دهد. این وکتور، یک وکتور high-copy-number است و شامل پروموتورهای T7 و SP6RNA پلیمراز است که در طرفین ناحیه سایت‌های برشی[9] آن قرار دارند. ناحیه سایت‌های برشی آن هم در داخل ناحیه کدکننده –αپپتید آنزیم β- گالاکتوزیداز واقع شده است.

کشت مخمر ساکارومایسیس سرویزیه:پس از کشت مخمر در محیط اختصاصی YPD حاوی 10 گرم دکستروز، 20 گرم پپتون، 10 گرم عصاره مخمر و 15 گرم آگار و رشد کلونی‌ها، تک کلونی‌ها با استفاده از لوپ به محیط کشت مایع منتقل شد. سپس به‌مدت 1 شبانه‌روز در شیکر انکوباتور در دمای 30 درجه سانتی‏گراد قرار داده شد و از آن جهت استخراج DNA ژنومی استفاده شد.

جداسازی DNA: سوسپانسیون حاصل از کشت مخمرها در محیط کشت مایع YPD ابتدا توسط سانتریفیوژ rpm14000 رسوب داده شد و بر روی رسوب حاصل بافر هارجو[10] که حاوی 2% Triton X-100، 1%SDS، 100 mM NaCl، 10 mM Tris-Hcl(pH 8.0) ، 1 mM EDTA است اضافه شد (11)، تیوب‌ها دو دقیقه در داخل اتانول مطلق سرد (یا منفی 80 درجه سانتی‏گراد) و سپس در دمای 95 درجه سانتی‏گراد یک دقیقه قرار گرفتند، این مرحله تکرار و ورتکس شد. در ادامه با افزودن کلروفرم، ورتکس و سانتریفیوژ، فاز بالایی به تیوب جدید منتقل شد و بر روی آن اتانول مطلق اضافه شد و در دمای منفی 20 درجه سانتی‏گراد قرار گرفت. در نهایت، DNA مخمر با استفاده از روش‌های رسوب و خالص‌سازی اسیدنوکلئیک خالص شد و در 50-25 میکرولیتر آب مقطر استریل حل شد.

.واکنش زنجیره‌ای پلیمراز و خالص‌سازی فراورده تکثیری: ابتدا آغازگرهای مناسب به‌منظور جداسازی ژن HXT6 با استفاده از توالی موجود در NCBI با کد دسترسی (NM: 001180651.1) طراحی شد. واکنش زنجیره‌ای پلیمراز برای تکثیر ژن مورد نظر از روی DNA و اثبات حضور فیزیکی ژن در وکتور کلونینگ استفاده شد. برای تهیه 20 میکرولیتر واکنش زنجیره‌ای پلیمراز، 4 میکرولیترMaster mix ، ۲/۰ میکرولیتر آغازگر رفت، ۲/۰ میکرولیتر آغازگر برگشت و 50 نانوگرم DNA به 6/14 میکرولیتر آب مقطر استریل اضافه شد. برنامه استاندارد واکنش زنجیره‌ای پلیمراز شامل مرحله واسرشته‌سازی اولیه به‌مدت 4 دقیقه در94 درجه سانتی‏گراد و در ادامه مرحله تکثیر که شامل 35 چرخه و هر چرخه شامل 60 ثانیه دمای 94 درجه سانتی‏گراد، 50 ثانیه دمای 48 درجه سانتی‏گراد و 80 ثانیه دمای 72 درجه سانتی‏گراد و درنهایت یک مرحله پایانی شامل 10 دقیقه در دمای 72 درجه سانتی‏گراد بود. نیمی از فراورده تکثیری واکنش زنجیره‌ای پلیمراز روی ژل آگارز ۱درصد بارگذاری شدند، تا باندهای تکثیرشده، جدا و تجزیه شوند. پس از آنکه باند مورد نظر مشاهده شد، باقی‌مانده فراورده تکثیری واکنش زنجیره‌ای پلیمراز تاییدشده، خالص‌سازی و رسوب داده شد.

همسانه‌سازی در پلاسمید pGEM-T: برای اتصال دو قطعه DNA، مواد لازم برای 10 میکرولیتر واکنش لیگاسیون شامل 300-100 نانوگرم (۵/۰ میکرولیتر) پلاسمید pGEM -T، ژن HXT6 (فراورده تکثیری واکنش زنجیره‌ای پلیمراز خالص‌سازی‌شده) به نسبت 3 برابر پلاسمید (900 نانوگرم یا 5/1 میکرولیتر)، بافر×T4-DNA 2 لیگاز (5 میکرولیتر) ، 5 واحد آنزیم T4-DNA لیگاز (۵/۰ میکرولیتر) و 5/2 میکرولیتر آب مقطر استریل در تیوب استریل ۵/۰میلی‌لیتری ریخته شد و به‌مدت یک ساعت در دمای اتاق و سپس به‌مدت یک شب در دمای 4 درجه سانتی‏گراد قرار داده شدند.

.استحالهسلول‌های باکتریایی به‌روش شوک حرارتی: برای استحاله به‌روش شوک حرارتی، ابتدا سلول‌های مستعد باکتری از فریزر 70- درجه سانتی‏گراد و محصول واکنش لیگاسیون از فریزر 20- درجه سانتی‏گراد خارج شدند و به‌مدت 15 دقیقه روی یخ قرار گرفتند، سپس نصف محصول واکنش لیگاسیون (5 میکرولیتر) به 50 میکرولیتر سلول مستعد اشرشیا کلای اضافه شد و به‌آرامی مخلوط شدند و به‌مدت 45 دقیقه روی یخ قرار داده شدند. سپس نمونه‌ها 42 ثانیه در دمای 42 درجه سانتی‏گراد قرارگرفتند و به‌سرعت 2 دقیقه به روی یخ منتقل شدند. در ادامه 850 میکرولیتر محیط کشت LBی مایع بدون آنتی‌بیوتیک به نمونه‌ها اضافه شد و به‌مدت یک ساعت با سرعتrpm 180در دمای 37 درجه سانتی‏گراد در انکوباتور شیکردار قرارگرفتند. درنهایت حدود 20-200 میکرولیتر از سلول‌های باکتریایی ترانسفورم شد و روی محیط LBی جامد حاوی آنتی‌بیوتیک مناسب وX-Gal (5برمو-4کلرو-3ایندول-β-D–گالاکتوپیرانوزید) [11] و IPTG (ایزوپروپیلβ-1-D-تیوگالاکتوپیرانوز) [12] کشت شدند و به‌مدت یک شب در انکوباتور با دمای 37 درجه سانتی‏گراد قرار داده شدند. سپس کلونی‌های سفیدرنگ با انجام واکنش زنجیره‌ای پلیمراز روی آن‌ها تایید شدند و با استفاده از روش استخراج پلاسمید که بیرنبویم و دالی[13] پیشنهاد کردند، استخراج پلاسمید شدند (12). با انجام واکنش زنجیره‌ای پلیمراز دیگری روی پلاسمیدهای استخراج‌شده و تایید آن‌ها، برای توالی‌یابی به مرکز توالی‌یابی کره‌جنوبی (شرکت ماکروژن) [14] ارسال شدند.

بررسی توالی: ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی پروتئین به‌دست‌آمده با استفاده از برنامه‌هایProtParam و ProtScale و ساختار دوم پروتئین به‌وسیله برنامه PSIpred تعیین شد. توالی اسیدآمینه‌ای به‌دست‌آمده به‌منظور یافتن پروتئین‌های مشابه در بانک‌های اطلاعاتی با استفاده از برنامه بلاست[15] مرکز ملی اطلاعات بیوتکنولوژی آمریکا (NCBI) جستجو شد و تعدادی توالی پروتئینی از سویه‌های دیگر مخمر ساکارومایسس سرویزیه که بیشترین شباهت را با توالی مد نظر داشتند، انتخاب شدند و برای هم‌ردیف‌سازی چندگانه استفاده شدند. همچنین بررسی فیلوژنتیکی با استفاده از انواع مختلف Hxt6p و انواع ژن‌های HXT با استفاده از نرم‌افزار مگا4 [16] انجام شد. توالی‏های پروتئینی از سویه‌های دیگر مخمر ساکارومایسس سرویزیه که برای تهیه هم‌ردیف‌سازی چندگانه استفاده شدند به‌همراه شماره دستیابی در جدول 1 ذکر شده‌اند.

نتایج.

تکثیر DNA ژن HXT6: پس از استخراج DNA ژنومی، ژن HXT6 با استفاده از آغازگرهای طراحی‌شده در دستگاهPCR تکثیر شد. محصول PCR یک باند 1713 جفت بازی روی ژل آگارز بود که با ژن HXT6 موجود در بانک اطلاعاتی NCBI مطابقت داشت (شکل 1).

شکل 1- الکتروفورز محصول PCR حاصل از تکثیر DNAی ژن HXT6با آغازگرهای اختصاصی طراحی‌شده، باند 1713 جفت بازی که با اندازه مورد انتظار مطابقت داشت. 1 ، 2، 3 و 4 چهار تکرار مستقل هستند.:M(Kb) مارکر kb1.

جدول 1- میزان یکسانی و شباهت توالی اسیدآمینه‌ای Hxt6p با سایر توالی‌های اسیدآمینه‌ای سویه‌های دیگر مخمر ساکارومیسس سرویزیه استفاده‌شده در تهیه هم‌ردیف‌سازی مقایسه‌ای و ساخت درخت فیلوژنتیکی.

.همسانه‌سازی DNA تکثیرشده در پلاسمید pGEM-T: DNA تکثیرشده از واکنش PCR برای ژن HXT6پس از خالص‌سازی از روی باقی‌مانده محصول PCR در وکتور pGEM-T کلون شد. در این وکتور غیرفعال‌شدن –αپپتید با واردشدن DNA الحاقی، اجازه شناسایی نوترکیب‌ها (کلونی‌های سفید) را از طریق غربا لگری سفید-آبی می‌دهد با استناد به این ویژگی پلاسمید، تعدادی از کلونی‌های نوترکیب (سفید) انتخاب شد و درستی واکنش لیگاسیون با PCR روی آن کلونی‏ها تایید شد (شکل 2).

.مراحل تایید کلونی‌ها برای حضور ژن پس از استحالهاشرشیا کلای با پلاسمید pGEM-T+ HXT6: با توجه به اینکه توالی‌یابی قطعه DNA کلون‌شده برای ژن HXT6 هنوز مشخص نشده بود، بنابراین تعدادی از کلونی‌های رشدکرده پس از واکنش استحاله با پلاسمید pGEM-T+ HXT6 برای تایید وجود قطعه کلون‌شده در سه مرحله آزمایش شدند. بدین ترتیب که ابتدا کلونی‌های انتخاب‌شده به‌روش PCR و با استفاده از جفت آغازگر اختصاصی استفاده‌شده در کلونینگ، ارزیابی شدند (شکل 2). در مرحله دوم، تعدادی از کلونی‌هایی که در PCR مثبت بودند) باند مورد نظر را نشان دادند) برای استخراج پلاسمید انتخاب شدند. پس از استخراج پلاسمید PCR دیگری روی DNA پلاسمید استخراج‌شده با استفاده از جفت آغازگر اختصاصی استفاده‌شده در کلونینگ انجام شد (شکل 3).

شکل 2- تصویر الکتروفورز محصول PCR حاصل از بررسی تعدادی از کلونی‌های نوترکیب رشدکرده روی محیط انتخابی پس از استحاله با محصول لیگاسیون با استفاده از جفت آغازگر اختصاصی ژن HXT6، مشاهده باند bp1713 حضور فیزیکی قطعه کلون‌شده در برخی کلونی‌ها را تایید می‌کند. 1، 2، 3 و4 چهار تکرار مستقل هستند. :M(Kb) مارکر. C+: کنترل مثبت. C-: کنترل منفی.

شکل 3- تصویر الکتروفورز محصول PCR حاصل از بررسی تعدادی از پلاسمیدهای نوترکیب استخراج‌شده، با استفاده از جفت آغازگر اختصاصی ژن HXT6، مشاهده باند bp1713 حضور فیزیکی قطعه کلون‌شده در کلونی‌ها را تایید می‌کند. 1، 2، 3 و4 چهار تکرار مستقل هستند. M(Kb) مارکر. C-: کنترل منفی.

نتایج توالی‌یابی با دو پرایمر T7 و SP6 برای ژن HXT6بر روی وکتورpGEM-T نشان‌دهنده این بود که موقعیت قرارگیری آن روی سایت برشی اختصاصی وکتور در جهت معمولی است و کدون آغاز ATG در سمت T7 قرار دارد و یک پروتئین با 570 اسیدآمینه را رمز می‏کند. بررسی ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی پروتئین به‌دست‌آمده براساس تجزیه و تحلیل‌های نرم‌افزارهای بیوانفورماتیکی و با استفاده از برنامه ProtParam نشان داد که وزن مولکولی محاسبه‌شده و نقطه ایزوالکتریک پش‏بینی‌شده پروتئین Hxt6p با فرمول مولکولی C₂₈₈₀H₄₄₃₀N₇₁₂O₇₉₁S₃₁، به‌ترتیب برابر 68/62 کیلودالتون و 89/7 است و شاخص ناپایداری آن در لوله آزمایش در حدود 04/37 است که در رسته پروتئین‌های پایدار تقسیم‌بندی می‌شود. همچنین شاخص Aliphatic (به‌عنوان یک عامل مهم به‌منظور برآورد مقاومت پروتئین‌ها در برابر حرارت) و نیمه‌عمر این پروتئین در محیط درون‌شیشه‌ای به‌وسیله برنامه ProtParam محاسبه شد که به‌ترتیب 93/95 و در حدود 20 ساعت بود؛ این مقدار بیانگر پایداری و مقاوم‌بودن پروتئین در برابر حرارت است (13) و از کل اسیدهای آمینه،44 اسیدآمینه با بار منفی (Asp+Glu) دارد، درحالی‌که تعداد کل اسیدهای آمینه با بار مثبت آن (Arg+Lys) برابر 46 است.

بررسی ساختار دوم پروتئین Hxt6p با استفاده از PSIpred نشان داد که این پروتئین حاوی 8 رشته بتا و 24 مارپیچ آلفا است (شکل 4).

شکل 4- ساختار دوبعدی Hxt6p با استفاده از برنامه .PSIpred

 توالی پروتئینی به‌دست‌آمده از Hxt6p با سایر Hxt6p از سویه‌های دیگر مخمر ساکارومیسس سرویزیه که بیشترین شباهت را داشتند انتخاب شدند و با استفاده از برنامه Multialinge مقایسه شدند (جدول 1) و مشاهده شد که پروتئین به‌دست‌آمده با سویه‌های ROO8 S. c و P301 S. c هیچ تفاوتی از نظر توالی اسیدآمینه‌ای ندارد و با سویه‌هایS. c P283 و S. c S288c در اسیدآمینه 448(Ala/Pro) متفاوت است. همچنین با سویه‌های S. c EC1118 وS. c R103 در 2 اسیدآمینه تفاوت دارد و با Hxt7p از مخمر ساکارومیسس سرویزیه سویه S. c S288c و سویه S. c EC1118 به‌ترتیب در دو و سه اسیدآمینه تفاوت دارد (شکل 5). درخت فیلوژنتیکی نیز که با استفاده از نرم‌افزار مگا4 رسم شده است نشان می‌دهد پروتئین بررسی‌شده ارتباط بسیار نزدیکی با سایر پروتئین‌های همتای خود در سویه‌های دیگر مخمر ساکارومیسس سرویزیه موجود در NCBI دارد (شکل 6).

شکل 5- هم‌ردیفی مقایسه‌ای توالی اسیدآمینه‌ای HXT6 کلون‌شده در وکتور pGEM-T با توالی اسیدآمینه‌ای سایر HXTهای سویه‌های دیگر مخمر ساکارومیسس سرویزیه موجود در NCBI با استفاده از برنامه Multialign. ردیف آخر توالی‌های توافق‌شده را پس از مقایسه نشان می‌دهد.

شکل 6- درخت فیلوژنتیکی به‌روش Neighbor joining، توالی اسیدآمینه‌ای Hxt6p مخمر ساکارومیسس سرویزیه سویه IBRC-M30069 با سایر ژن‌های همتای خود در سویه‌های دیگر ساکارومیسس سرویزیه موجود در بانک اطلاعاتی NCBI با استفاده از نرم‌افزار مگا4 رسم شد کد دسترسی هر پروتئین در داخل پرانتز آورده شده است.

شکل 7- درخت فیلوژنتیکی به‌روش Neighbor joining، توالی نوکلئوتیدی ژن HXT6 مخمر ساکارومیسس سرویزیه سویه IBRC-M30069 با سایر ژن‌های انتقال‌دهنده هگزوز مخمر ساکارومیسس سرویزیه موجود در بانک اطلاعاتی NCBI با استفاده از نرم‌افزار مگا4 رسم شد. کد دسترسی هر ژن داخل پرانتز آورده شده است.