بررسی اثر سورفکتانت توئین 80 بر رشد و مصرف دی‌بنزو‌تیوفن توسط قارچ اگزوفیالا اسپینیفرا جداسازی شده از خاک آلوده به نفت

مقدمه.

پس از غذا، سوخت مهم‏ترین منبع انرژی بشر است به‏طوری که 85 درصد انرژی از سوخت‌های فسیلی، 8 درصد از انرژی هسته‌ای و 7 درصد از منابع دیگر که به‏طور کلی برق آبی و چوب است، تأمین می‌‏شود. زغال‌سنگ، نفت و گاز طبیعی سه سوخت اصلی هستند که نفت40 درصد، زغال سنگ حدود 24 درصد و گاز طبیعی هم 12 درصد از مصرف کل جهان را در بر می‌گیرند (1). بر این اساس، نفت مهم‏ترین این سوخت‌هاست که به‏طور کلی از هیدروکربن تشکیل شده است که پس از کربن و هیدروژن، گوگرد سومین عنصر فراوان در آن است (2).

استفاده از سوخت‌های فسیلی به عنوان منبع انرژی موجب آلودگی محیطی با ترکیباتی با منشا غیر زیستی شده است زیرا این سوخت‌های فسیلی محتوی گوگرد هستند که سوختن مستقیم آن‌ها موجب آزادسازی مقدار فراوانی از اکسید گوگرد به اتمسفر می‌‏شود (3). اکسید گوگرد تولیدی مسؤول کیفیت بد هوا، باران اسیدی و کاهش لایه‌ اوزون است (4). علاوه بر این، اکسید گوگرد موجب به خطر افتادن سلامتی انسان می‌شود به گونه‌ای که مشکلاتی از قبیل: سرطان دستگاه تنفسی، بیماری‌های قلبی و تنفسی را به همراه خود دارد (5).

روش رایج برای حذف گوگرد نفت در پالایشگاه‌ها در حال حاضر به شکل فیزیکی- شیمیایی[i] (HDS) است که در این روش اتم گوگرد در حضور گاز هیدروژن و کاتالیزور به سولفید هیدروژن احیا می‌شود و بسته به میزان گوگردزدایی و نوع هیدروکربن HDS در درجه حرارت 200 تا 425 درجه سانتی‏گراد و فشار 150 تا250 پوند بر اینچ مربع گاز هیدروژن انجام می‌شود (6 و 7)، اگرچه در فرآیند HDS ترکیبات گوگردی از قبیل: تیول، سولفید و دی‌سولفید به‏طور مؤثری حذف می‌شوند اما بسیاری از ترکیبات آروماتیک گوگرددار از قبیل: دی‌بنزو‌تیوفن[ii] (DBT) به این فرآیند مقاوم هستند و پس از گوگردزدایی در نفت باقی می‌مانند (8). بنابراین، به علت مقاومت بالای ترکیبات تیوفنی و ترکیبات هتروسیکلیک آروماتیک گوگرددار به HDS و همچنین، هزینه بالای آن برای ایجاد فشار و دمای زیاد، گوگرددزایی زیستی[iii] (BDS) به عنوان یک روش مکمل و یا جایگزین فرآیند گوگردزدایی هیدروژنی استفاده شده است (9).

امروزه پژوهش‏های بسیاری برای توسعه گوگردزدایی زیستی انجام شده است که در تمامی این پژوهش‏ها از DBT به عنوان ترکیب مدل استفاده شده است (10).

تا به امروز چندین جنس که دارای فعالیت گوگردزدایی هستند گزارش شده است که بیشتر آن‌ها به جنس رودوکوکوس متعلق هستند که شاخص‌ترین آن‌ها رودوکوکوس اریتروپولیس سویه IGTS8 است (11). از میان یوکاریوت‌ها هم قارچ Cunninghamella elegans قادر به گوگردزدایی DBT است. این قارچ DBT را به DBT-5-oxide و DBT-5-dioxide بدون تولید بی‌فنیل تبدیل می‌کند. علاوه بر این، قارچ Paecylomyces موجب اکسیداسیون اختصاصی DBT می‌شود و در نهایت، دی‌هیدروکسی‌بی‌فنیل تولید می‌‏شود (12).

سورفکتانت‌ها ترکیباتی آمفی فیلیک (دارای هر دو ویژگی هیدروفوبیک و هیدروفیلیک) هستند که به علت داشتن ویژگی‏های برجسته و مطلوبی از قبیل: افزایش حلالیت، کاهش کشش سطحی و...... در صنعت استفاده می‏شوند. گزارش‌های محدودی در مورد کاربرد سورفکتانت در گوگردزدایی توسط میکروارگانیسم‌ها وجود دارد (13). مارزونا[iv] و همکارانش در سال 1997 دریافتند که اتصال DBT و بنزو‌تیوفن به سورفکتانت سیکلودکسترین حلالیت این ترکیبات را در آب افزایش می‌دهد (14).

هدف از پژوهش حاضر، بررسی توانایی مصرف DBT در قارچ اگزوفیالا اسپینیفرای جداسازی شده از خاک آلوده به نفت مناطق حفاری چاه در خوزستان و مطالعه اثر سورفکتانت توئین 80 بر رشد و فعالیت مصرف DBT این قارچ است.

‏‏مواد و روش ‏ها.

مواد شیمیایی: تمامی مواد شیمیایی مورد استفاده در این پژوهش ساخت کارخانجات سیگما و مرک برای کاربرد آزمایشگاهی است.

محیط کشت پایه معدنی[v] BSM: این محیط کشت حاوی 4 گرم Na₂HPO_4، 4 گرم KH₂PO_4، 2 گرمNH₄Cl، 2/0 گرم MgCl₂.6H₂O، 001/0 گرم CaCl₂.2H₂O، و 001/0 گرم FeCl₃.6H₂O، در یک لیتر آب دو بار تقطیر بوده است. گلوکز به میزان 1 گرم در لیتر به آن اضافه و اسیدیته محیط با استفاده از HCl 6 نرمال بین 6 تا 7/6 تنظیم شد (15).

بررسی مصرف DBT: در این قسمت ابتدا قارچ اگزوفیالا اسپینیفرا (با شماره‌‌ دسترسی KC952672) در محیط BSM حاوی 1 درصد گلوکز به عنوان منبع کربن و 3/0 میلی‏مولار از DBT حل شده در اتانول به عنوان منبع گوگرد کشت و در یک انکوباتور شیکردار با 180 دور در دقیقه و دمای 30 درجه سانتی‏گراد قرار داده شد تا زمانی که یک سوسپانسیون کنیدی با کدورت معادل 5/0 به‏دست آمد و سپس، 1 میلی‏لیتر از این سوسپانسیون به 50 میلی‏لیتر از محیط کشت BSM حاوی 1 درصد گلوکز و 3/0 میلی‏مولار DBT در ارلن 250 میلی‏لیتری اضافه شد و انکوباسیون به مدت 14 روز در دمای 30 درجه سانتی‏گراد روی شیکر180 دور در دقیقه انجام شد. در زمان‌های صفر، 3، 5، 7، 10 و 14 روز برای بررسی مصرف و کاهش غلظت DBT از محیط کشت یاد شده نمونه‏برداری شد. به این شکل که 3 میلی‏لیتر از محیط کشت به لوله آزمایش منتقل و اسیدیته آن با استفاده از اسید کلریدریک 6 نرمال اسیدی شد و سپس، به میزان حجم مساوی به آن اتیل استات اضافه شد. در نهایت، جذب UV نمونه‌های استخراج شده در طول موج 200 تا 600 نانومتر به‏دست آمده، ماکزیمم جذب اختصاصی DBT در طول موج 323 نانومتر تعیین شد و با استفاده از نمودار استاندارد غلظت DBT باقیمانده در محیط به‏دست آمد (15 و 16).

.بررسی اثر سورفکتانت Tween80 بر رشد قارچ:غلظت‌های مختلف از سورفکتانت Tween80 به محیط BSM حاوی 3/0 میلی‏مولار DBT و 1 درصد گلوکز افزوده و سپس، محیط در دمای 121 درجه سانتی‏گراد به مدت 15 دقیقه اتوکلاو شد. پس از سرد شدن محیط از سوسپانسیون کنیدی با کدورت معادل 5/0 به میزان 1 میلی‌لیتر به تمامی ارلن‌ها اضافه شد. ارلن‌ها در دمای 30 درجه سانتی‏گراد با 180 دور در دقیقه انکوبه و بررسی رشد پس از 96 ساعت انجام شد. به این شکل که 1 میلی‏لیتر از تمامی ارلن‌ها در زمان 96 ساعت سانتریفیوژ، رسوب حاصل به مدت 24 ساعت در داخل آون با دمای 60 درجه سانتی‏گراد انکوبه و در نهایت، وزن توده‌های سلولی محاسبه شد (17 و 27).

.بررسی اثر سورفکتانت Tween80 بر مصرف DBT:برای انجام این بخش، از ارلن‌های حاوی غلظت‌های مختلف سورفکتانت پس از 96 ساعت انکوباسیون، به میزان سه میلی‏لیتر برداشت و به حجم مساوی به آن اتیل استات اضافه شد. سپس، به منظور جدا کردن فاز آلی سانتریفیوژ به مدت 5 دقیقه در 3000 دور در دقیقه انجام، پس از آن فاز آلی جدا و کاهش میزان DBT با دستگاه اسپکتروفتومتر UV در طول موج 200 تا 600 نانومتر بررسی شد (17 و 27). نمونه‌های شاهد شامل BSM حاوی DBT بدون قارچ و محیط BSM حاوی قارچ بدون سورفکتانت در کنار نمونه‌های آزمون‏ استفاده شد.

تحلیل آماری نتایج:تمام آزمایش‌ها به شکل دو بار تکرار انجام شده و نتایج، میانگین تکرار‌هاست. معنا‌دار بودن و نبودن تغییرات عامل‏‏های یاد شده بر رشد و فعالیت گوگردزدایی قارچ اگزوفیالا اسپینیفرا با استفاده از نرم‏افزار16.0 SPSS، روش One Way Anova و آزمون دانکن بررسی شد.

نتایج.

بررسی مصرف DBT: قارچ اگزوفیالا اسپینیفرای جداسازی شده از خاک آلوده به نفت (17) قادر به رشد بر DBT به عنوان منبع گوگرد و حذف آن بود، به‏طور‏‏ی ‏که با بررسی جذب UV مربوط به DBT در طول موج 323 نانومتر در زمان‌های مختلف مشاهده شد که پس از 168 ساعت، جذب اختصاصی مربوط به DBT در طول موج 323 نانومتر از بین رفته است. این امر بیانگر مصرف کامل این ترکیب سمی توسط قارچ یاد شده است. در شکل 1 نتیجه بررسی حذف DBT توسط قارچ اگزوفیالا اسپینیفرا نشان داده شده است.

A

B

C

شکل 1- طیف جذبی قارچ اگزوفیالا اسپینیفرا در محیط BSM حاوی 1درصد گلوکز و 3/0 میلی‏مولار DBT طی زمان‌های مختلف انکوباسیون با شیکر rpm 180 و دمای 30 درجه سانتی‏گراد.

A: لحظه صفر، B: 96 ساعت، C: 168 ساعت.

همان‏طور که در شکل 1 مشاهده می‏شود قارچ اگزوفیالا اسپینیفرای جداسازی شده، قادر به مصرف کامل DBT موجود در محیط کشت به عنوان تنها منبع گوگرد است، به‏طور‏‏ی ‏که با مقایسه شکل‌های A 1 و
B 1 و C 1 مشاهده می‌شود که قارچ یاد شده پس از 96 ساعت انکوباسیون در دمای 30 درجه سانتی‏گراد و دور rpm 180 قادر به مصرف 67 درصد از DBT موجود در محیط کشت و پس از گذشت 7 روز از انکوباسیون در شرایط یاد شده، موجب حذف کامل DBT در محیط کشت شد. به‏طور‏‏ی ‏که پیک مربوط به DBT در شکل C1 مشاهده نمی‌شود و این امر بیانگر مصرف کامل آن توسط قارچ جداسازی شده است.

اثر سورفکتانتTween80 بر رشد و گوگردزدایی: اثر سورفکتانت بر رشد قارچ اگزوفیالا اسپینیفرا در شکل 2 آورده شده است. همان‏طور که در شکل مشاهده می‌شود میزان رشد قارچ بر حسب میلی‏گرم بر میلی‏لیتر وزن خشک سلول (18) (DCW mg/ml) طی 4 روز انکوباسیون در حضور غلظت‌های مختلف سورفکتانت نسبت به شاهد که فاقد سورفکتانت می‏باشد، افزایش یافته است. به‏طور‏‏ی ‏که بیش‏ترین میزان رشد در حضور 4/0درصد سورفکتانت توئین 80 است. اما میزان رشد در غلظت 1 درصد از سورفکتانت نسبت به شاهد کمتر شده است. بنابراین، می‌توان استنباط کرد که افزایش بیش از حد سورفکتانت موجب کاهش رشد قارچ یاد شده می‌‏شود.

 میزان رشد در حضور غلظت‌های مختلف سورفکتانت Tween80 نسبت به شاهد با تحلیل دانکن دارای تفاوت معنا‌داری است (در سطح معنا‌دار 05/0).

شکل 2- اثر غلظت‌های مختلف سورفکتانت Tween80 بر رشد قارچ اگزوفیالا اسپینیفرا در محیط BSM حاوی 1درصد گلوکز و 3/0 میلی‏مولار DBT طی 4 روز انکوباسیون با شیکر rpm  180 و دمای 30 درجه سانتی‏گراد. (مقادیر با حروف متفاوت نسبت به هم اختلاف معنادار ندارند ولی مقادیر با حروف متفاوت دارای اختلاف معناداری هستند به گونه‏ای که غلظت 2/0 و 4/0 دارای اختلاف معناداری نیستند. به این معنا که افزایش غلظت بیش از این بازه افزایش چشمگیری را در فعالیت قارچ یاد شده به همراه نخواهد داشت)

 اثر سورفکتانت توئین 80 بر مصرف DBT توسط قارچ جداسازی شده در شکل 3 نشان داده شده است. نتایج نشان می‏دهد که میزان کاهش غلظت DBT و مصرف آن توسط قارچ اگزوفیالا اسپینیفرا در حضور سورفکتانت Tween80 نسبت به شاهد فاقد سورفکتانت بیشتر است. با به‏کارگیری تحلیل دانکن مشاهده شد که درصد حذف DBT در حضور غلظت‌های 1/0، 2/0 و 4/0 درصد از سورفکتانت نسبت به شاهد دارای سطح معنا‌داری هستند. اما غلظت‌ 1 درصد سورفکتانت توئین 80 نسبت به شاهد فاقد سورفکتانت، معنا‌دار نیست. بنابراین، می‌توان گفت وجود سورفکتانت در محیط موجب افزایش مصرف DBT می‏شود. اما غلظت‌های بالای آن کاهش فعالیت قارچ را سبب می‌شود به‏طور‏‏ی ‏که میزان مصرف این ترکیب سمی در نبود سورفکتانت نسبت به غلظت‌های بسیار بالای آن بیشتر است.

‏‏

شکل 3- اثر غلظت‌های مختلف سورفکتانت Tween80 بر میزان مصرف DBT توسط قارچ اگزوفیالا اسپینیفرا در محیط BSM حاوی 1درصد گلوکز و 3/0 میلی‏مولار DBT طی 4 روز انکوباسیون با شیکر rpm  180و دمای 30 درجه سانتی‏گراد

بحث و نتیجه ‏‏گیری.

پس از کربن و هیدروژن، گوگرد سومین عنصر فراوان در نفت است و بسته به منبع از 05/0 تا 5 درصد نفت خام را شامل می‌شود. وجود ترکیبات گوگردی در نفت از نگرانی‌های بشر در دهه‌های اخیر بشمار می‌رود (19)، زیرا احتراق ترکیبات گوگرددار در سوخت‌های فسیلی همراه با تولید اکسید گوگرد بوده که نقش مهمی در ریزش باران‌های اسیدی و آلودگی هوا دارد. اما حذف گوگرد نیاز به زمان زیاد و فرآیند‌های طولانی دارد. این مسائل باعث جلب توجه به ترانسفورماسیون میکروبی ترکیبات گوگردی شده و گوگردزدایی میکروبی برای حذف گوگرد و دست‌یابی به سوخت‌هایی با مقدار پایین گوگرد استفاده شد (20 و 21). اما تاکنون بیش‏ترین مطالعات در این زمینه بر روی باکتری‌ها انجام شده است و پژوهش‏های کمتری در مورد قارچ‌ها یافت می‌‏شود، در حالی‏که قارچ‌ها از طریق سیتوکروم P-450 و آنزیم‌های خارج سلولی خود قادر به متابولیزه کردن طیف وسیعی از مواد شیمیایی و هیدروکربن‌ها هستند. از این آنزیم‌های خارج سلولی تولید شده توسط قارچ‌ها به علت دارا بودن ویژگی‌های گسترده‌ای از قبیل: توانایی اتصال به سوبستراهایی با وزن مولکولی بالا و امکان ایجاد تغییرات شیمیایی درآن‌ها‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌ برای افزایش تحمل و پایداری، می‌توان به عنوان کاتالیزورهای زیستی استفاده کرد (22). علاوه بر این، قارچ‌ها به علت دارا بودن مزیت‌هایی از قبیل: قابلیت رشد در اسیدیته پایین و شرایط فقرغذایی (در صورتی که رشد باکتری دراین شرایط محدود می‌شود)، حمل ونقل آسان، دست‏کاری ژنتیکی راحت و تولید در مقیاس وسیع، می‌توانند کاندیدای مناسبی برای گوگردزدایی از نفت باشند (23). همچنین، نتایج این پژوهش نشان می‌دهد که قارچ‌ اگزوفیالا اسپینیفرا هم قادر به مصرف DBT به عنوان منبع گوگرد به شکل کومتابولیسم با سایر منابع کربنی همانند گلوکز است. این نخستین گزارش از توانایی گوگردزدایی DBT در قارچ اگزوفیالا است. فاسیون[vi] و همکارانش در سال 1991 به این نتیجه رسیدند که قارچ Paecylomyces بر روی DBT رشد کرده و طی مسیر اکسیداسیون اختصاصی گوگرد، DBT را به دی‌ هیدروکسی بی فنیل تبدیل می‌کند (24). بنابراین، از آنجا که ایران از جمله کشور‌هایی است که دارای بالاترین مقدار ترکیبات آلی گوگرددار در ذخایر نفتی خود است، استفاده از قارچ اگزوفیالا اسپینیفرا با توانایی مصرف DBT می‌تواند در پاکسازی زیستی این آلاینده بسیار راهگشا باشد.

 حلالیت هیدروکربن‌های آروماتیک پلی‌سیکلیک همانند DBT در محلول‌های آبی بسیار کم بوده و دسترسی زیستی این ترکیبات یک عامل محدود کننده برای حمله قارچی و میکروبی به آنهاست و به همین منظور اضافه کردن سورفکتانت‌هایی از قبیل: توئین 80 موجب افزایش حلالیت و دسترسی زیستی این ترکیبات می‌‏شود (13). به‏طور‏‏ی ‏که مشاهده شده است سرعت اکسیداسیون این ترکیبات توسط قارچ Bjerkandera sp. BOS55 در حضور سورفکتانت‌های مختلف 2 تا 5 برابر افزایش می‌یابد (25). همچنین، فاسیون و همکاران در پژوهش خود بر روی گوگردزدایی توسط قارچ Paecilomyces sp. TLI برای پراکندگی یکنواخت DBT در فاز آبی و افزایش گوگردزدایی آن، سورفکتانت توئین 80 را به‏کار بردند (24).

در مطالعات انجام شده بر گوگردزدایی باکتریایی DBT، نتایج مشابهی مرتبط با به‏کارگیری سورفکتانت‌ها در افزایش دسترسی زیستی DBT و گوگردزدایی آن به‏دست آمده است که به مواردی از آن در ادامه مطالب اشاره می‌‏شود.

هو[vii] و همکاران اثر سورفکتانت‌ها را در افزایش گوگردزدایی بررسی کردند. آن‌ها توانستند 72 درصد از گوگرد آلی نفت خام را طی 72 ساعت با استفاده از توئین 80 توسط سودوموناس دلافیلدی سویه R-8 حذف کنند (26).

وانگ[viii] و همکاران از میان سورفکتانت‌های مورد بررسی خود شامل توئین 80، سیکلودکسترین، تریتون X100 و بریج، بیش‏ترین توانایی حل کردن DBT را در توئین 80 تشخیص داده و آن را به عنوان سورفکتانت مناسب انتخاب کردند. این سورفکتانت، رشد کورینه باکتریوم سویه ZD-1 را به علت افزایش جذب و تجزیه DBT توسط باکتری و تامین منبع گوگرد کافی برای رشد افزایش داده است (27). اعتمادی‏فر[ix] و همکاران تاثیر توئین 80 را بر افزایش 27 درصدی گوگردزدایی از دی‏بنزوتیوفن توسط رودوکوکوس اریتروپولیس سویه R1 در غلظت 1 گرم بر لیتر از سورفکتانت با افزایش قابلیت زیستی آن نشان دادند (28).

در پژوهش حاضر نیز نتایج مشابهی با مطالعات قبلی به‏دست آمد به‏طور‏‏ی ‏که قارچ اگزوفیالا اسپینیفرای جداسازی شده در حضور غلظت‌های مختلف توئین 80 کشت داده شد و طبق نتایج به‏دست آمده مشاهده شد که رشد و گوگردزدایی قارچ یاد شده در حضور این سورفکتانت‌ افزایش یافته است. همان‏طور که قبلا اشاره شد، سورفکتانت‌ها با افزایش حلالیت DBT در آب، انتقال DBT را بین دو فاز آلی و آبی تقویت، و قابلیت دسترسی آن‏را افزایش می‌دهند، اما به علت اثر متفاوتشان بر سویه‌های مختلف، به‏طور متفاوتی بر گوگردزدایی اثر می‌گذارند.

در پژوهش حاضر نشان داده شده که DBT به عنوان یکی از آلودگی‌های مقاوم در سوخت‌های فسیلی توسط قارچ اگزوفیالا اسپینیفرا جداسازی شده از خاک آلوده به نفت به شکل کومتابولیسم با سایر منابع کربنی قابل مصرف است و با به‏کارگیری سورفکتانت توئین 80 می‏توان میزان فعالیت این قارچ را تا 30 درصد افزایش داد. این نخستین گزارش از توانایی مصرف DBT در قارچ اگزوفیالا است. بنابراین، این قارچ می‌تواند کاندیدای مناسبی در گوگردزدایی از سوخت‌های فسیلی باشد.