مقدمه

باکتری‏های جنس لاکتوکوکوس[i] را در ابتدا به‏عنوان گونه‏ای از استرپتوکوکوس[ii] می‏دانستند ولی این باکتری در سال 1985 از جنس استرپتوکوکوس تفکیک شد و در سال 1991 پس از جدا شدن از ماهی گیش دم زرد[iii] در ژاپن با نام انتروکوکوس[iv]خوانده شد و در نهایت با نام لاکتوکوکوس گارویه[v] نام‏گذاری شد‏ (1).

لاکتوکوکوس گارویه عامل بیماری لاکتوکوکوزیس، کوکوباسیل گرم مثبت و فاقد تحرک با همولیز آلفا است که از بسیاری از گونه‏های ماهی و به‏ویژه قزل آلای رنگین کمان به‏عنوان عامل بیماری‏زا گزارش شده است (2). دامنه میزبانی این باکتری محدود به ماهیان نیست و از گاو، سگ، گربه و بوفالو (3 و 4) و همچنین، فراورده‏های خام دامی شامل شیر گاو (5) و گوشت ماکیان (6) نیز جدا شده است. این باکتری از عوامل بیماری‏زای مشترک محسوب می‏شود و می‏تواند منجر به بروز اندوکاردیت در انسان شود (1) که اهمیت بیماری را دو چندان می‏کند.

در ماهی، باکتری یاد شده با بروز سپتی سمی در ماهی مبتلا همراه است که معمولاً با علایمی چون شنای غیرعادی، تیرگی بدن، اگزوفتالمی، خونریزی در داخل و یا اطراف کره چشم یا خونریزی های سطحی بدن در نواحی سرپوش آبششی، قاعده باله ها و همچنین، خونریزی های وسیع داخلی ظهور پیدا می‏کند (7 و 8). بیش‏ترین تلفات در ماهی قزل آلای رنگین کمان رخ می‏دهد به طوری که خسارات سالانه ناشی از آن ها به ده‏ها میلیون دلار می‏رسد (9).

نخستین همه‏گیری لاکتوکوکوزیس در مزارع پرورش ماهی کشور اسپانیا و در سال 1988 گزارش شد (10) و پس از آن همه گیری‏های متعددی از کشورهای مختلف گزارش شد‏ (11- 14). بیماری ناشی از لاکتوکوکوس گارویه در ایران نیز نخستین بار در سال 1381 توسط اخلاقی و همکاران[vi] (15) از استان فارس گزارش شد‏. مشاهدات کارگاهی و گزارش‏های مختلف نشان می‏دهد که در حال حاضر بیماری در بیشتر نقاط کشور وجود دارد و عامل مهم مرگ و میر و بروز تلفات در ماهیان پرورشی قزل آلای رنگین کمان به‏ویژه در استان‏های پر تولید کشور است (24). میزان شیوع لاکتوکوکوزیس در مزارع پرورش ماهی قزل آلا در مطالعه سلطانی و همکاران[vii] (16) معادل 6/65 درصد و در مطالعه میرزاخانی[viii] (17) برابر با 55 درصد گزارش شده است که همگی مقادیر زیادی را نشان می‏دهند.

استان چهارمحال و بختیاری با تولیدی بالغ بر 15000 تن ماهی قزل آلا در سال، رتبه اول کشور در تولید ماهی قزل آلای پرورشی را داراست. متاسفانه به نظر می‏رسد که با وجود توسعه کمی مزارع پرورش ماهی، کیفیت تولید از نظر دور بوده است. به‏طوری‏که برخی بیماری‏های با عامل باکتریایی و یا ویروسی در این مزارع به وفور مشاهده می‏شوند. از جمله این بیماری‏ها لاکتوکوکوزیس ‏است که در این منطقه، به‏ویژه در فصل‏های گرم شیوع بالایی دارد و هر ساله منجر به خسارات اقتصادی فراوانی به پرورش دهندگان ماهی می‏شود. بروز بیماری در سال‏های اخیر همراه با مصرف زیاد و بی‏قاعده آنتی‏بیوتیک‏ها در مزارع پرورش ماهی با هدف پیشگیری و درمان بیماری بوده است که از دیدگاه بهداشت عمومی مشکلات زیادی را به‏همراه دارد (18). از طرف دیگر، وجود گزارش‏های متعدد در خصوص بروز بیماری در انسان (19و 14)، اهمیت مطالعه بیماری را بیشتر می‏کند.

بررسی حاضر با هدف تعیین فراوانی بیماری لاکتوکوکوزیس در مزارع پرورش ماهی قزل آلای رنگین کمان استان چهارمحال و بختیاری و همچنین، مطالعه مقاومت‏های دارویی باکتری لاکتوکوکوس گارویه به‏منظور شناخت بیشتر پراکندگی بیماری و مبارزه موثر با آن انجام شد.

مواد و روش‏ها

الف) جداسازی باکتری‏ها

به‏منظور جداسازی و شناسایی باکتری‏ها، نمونه‏گیری از ماهیان 33 مزرعه پرورش ماهی در استان چهارمحال و بختیاری که در تابستان 1392 به‏عنوان موارد مشکوک به بیماری گزارش شده بودند، انجام شد. در مجموع، 100 ماهی دارای علامت یا مشکوک به بیماری (3 تکرار از هر مزرعه و از یک مزرعه 4 نمونه اخذ شد) در مجاورت یخ و در حداقل زمان ممکن به مرکز تحقیقات شیلات دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد منتقل ‏شد. پس از ضدعفونی ناحیه شکمی و باز کردن آن در کنار شعله، نمونه‏گیری از کلیه، طحال، کبد و قلب انجام شد. نمونه‏ها در محیط آگار قلب مغز[ix] و آگار خون دار[x] (مرک[xi]، آلمان) کشت داده شدند و به‏مدت 24 ساعت در دمای 30 درجه سانتی‏گراد گرم‏خانه‏گذاری شد‏ند. تشخیص اولیه گونه‏های باکتری جدا شده، پس از رنگ‏آمیزی گرم، با آزمون‏های بیوشیمیایی از قبیل تحرک، کاتالاز، اکسیداز، اوره آز، سیترات، سوربیتول، اندول، وگس-پرسکاور ([xii]VP)، همولیز، سالیسین، آرژنین و آسکولین بر اساس دستورالعمل‏های موجود (20) و تشخیص قطعی با واکنش زنجیره‏ای پلی مراز انجام شد.

ب) استخراج ژنوم و انجام واکنش زنجیره ای پلیمراز

به‏منظور استخراج ژنوم، باکتری‏های مشکوک در محیط [xiii]TSB به‏مدت 24 ساعت گرم‏خانه‏گذاری شدند. سپس،‏ 5/1 میلی‏لیتر از محیط به‏ مدت 10 دقیقه با دور 12000 در دقیقه سانتریفوژ شده و بخش سلولی در 567 میکرولیتر بافر با اسیدیته 8، یک میلی‏مول EDTA و 10 میلی‏مول تریس[xiv] (مرک، آلمان) حل شد. سپس،‏ 30 میکرولیتر سدیم دودسیل سولفات[xv] 10 درصد (مرک، آلمان) و 3 میکرو‏لیتر پروتئینازK ، 20 میلی‏گرم در لیتر (سیناژن، ایران) به آن اضافه و به‏مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‏گراد قرار داده شد. پس از استفاده از 100 میکرو‏لیتر نمک ( 5 میلی‏مول) و 80 میکرو‏لیتر هگزادسیل تری متیل آمونیوم بروماید[xvi]/نمک (سیگما، آلمان) به مدت 10 دقیقه در دمای 65 درجه سانتی‏گراد قرار داده شد. ژنوم به‏وسیله فنل: کلروفرم: ایزوآمیل الکل (25:24:1v/v) استخراج، با ایزوپروپانول (سیگما، آلمان) رسوب داده و با الکل 70 درصد شسته شد. پس از خشک شدن در دمای محیط به‏مدت 30 دقیقه در محلول TE با اسیدیته 8/7 (100 میلی‏مولEDTA ، 10 میلی‏مول تریس (مرک، آلمان)) قرار داده و در دمای منفی 20 درجه سانتی‏گراد نگهداری شد. غلظت DNA در هر نمونه در طول موج‏های 260 و 280 نانومتر سنجیده شد. تشخیص قطعی جدایه‏ها با استفاده از آغازگرهای اختصاصی میسر شد‏. توالی پرایمر‏ها
F (5'-CATAACAATGAGAATCGC-3')و
R (5'-GCACCCTCGCGGGTTG-3') بر پایه ژن 16S rRNAو اندازه محصول مورد انتظار 1100 جفت باز بود. برنامه دمایی نیز به شکل واسرشته‏سازی اولیه 95 درجه سانتی‏گراد به مدت 4 دقیقه، واسرشته‏سازی 94 درجه سانتی‏گراد به مدت 1 دقیقه، اتصال 57 درجه سانتی‏گراد به مدت 1 دقیقه، گسترش 72 درجه سانتی‏گراد به مدت 1 دقیقه و تکرار مراحل 2 تا 4 به تعداد 30 چرخه و در پایان مرحله طویل شدن نهایی 72 درجه سانتی‏گراد به‏مدت 5 دقیقه انجام شد (10 و 21). جهت کنترل مثبت، از نمونه تعیین توالی شده با کد دستیابی KJ997915 استفاده شد‏.

واکنش زنجیره‏ای پلیمراز در حجم 50 میکرو‏لیتر شامل 2 میکرولیتر از ژنوم باکتری (50 نانوگرم در میلی‏لیتر)، 5 میکرو‏لیتر بافر X 10 (Triton X-100) یک درصد، ژلاتین 1/0 درصد، 60 میلی‏مول کلرید منیزیوم، 500 میلی‏مول کلرید پتاسیم، پی اچ 3/8، 100 میلی‏مول تریس)، 1 میکرولیتر از هر پرایمر (50 پیکو‏مول بر میکرو‏لیتر)، 1 میکرولیتر (10 میلی‏مول) dNTP، 2/0میکرولیتر آنزیم تک پلی مراز 6 (5 واحد در میکرولیتر) و 40 میکرو‏لیتر آب مقطر استریل انجام شد. به‏منظور انجام واکنش زنجیره‏ای پلی مراز از دستگاه ترموسایکلر PTC-100 (اپندورف، آلمان) استفاده شد. در نهایت، ژل آگاروز 5/1 درصد پس از رنگ آمیزی با اتیدیوم بروماید در دستگاه الکتروفورز با ولتاژ 90 ولت به‏مدت 50 دقیقه قرار گرفت و باند ظاهر شده در کنار مارکر 100 جفت بازی (ویوانتیس[xvii]، مالزی) اندازه‏گیری شد. پس از انجام واکنش زنجیره‏ای پلی مراز، باند به دست آمده تعیین توالی شد‏ و در بانک جهانی ژن بلاست شد تا صحت نتایج تایید شود.

مطالعه مقاومت دارویی

مقاومت دارویی جدایه‏های حاصل به آنتی‏بیوتیک‏های رایج به روش دیسک‏گذاری در محیط مولر هینتون آگار (هایمدیا[xviii]، هند) با استفاده از دستورالعمل CLSI سنجیده شد (22). دیسک‏های مورد استفاده (شرکت پادتن طب ایران) شامل:
پنی‏سیلین (10 واحد بین المللی)، جنتامایسین (10 میکروگرم) استرپتومایسین (10 میکروگرم)، کلرامفنیکل (30 میکروگرم)، تتراسیکلین (30 میکروگرم)، آمپی‏سیلین (10 میکروگرم)، آموکسی‏سیلین (25 میکروگرم)، کانامایسین (30 میکروگرم)، اریترومایسین (15 میکروگرم)، فلورفنیکل (30 میکروگرم)، سولفامتوکسازول (7/23 میکروگرم) و انروفلوکساسین (5 میکروگرم) بودند.

نتایج

نتایج تعیین توالی

باند به دست آمده بر روی ژل آگاروز تعیین توالی شد‏ و سپس،‏ در بانک جهانی ژن بلاست شد که صحت آزمون را نشان داد. توالی در بانک جهانی ژن با شماره دسترسی KJ997915 ثبت شد‏.

نتایج بررسی ماهیان

در این بررسی، ماهیان دارای علامت (100 قطعه) جمع آوری شده از 33 مزرعه پرورش قزل آلای رنگین کمان به‏روش کشت و واکنش زنجیره‏ای پلی مراز بررسی شدند. نتایج واکنش زنجیره‏ای پلیمراز و مشاهده باند 1100 جفت بازی نشان داد که ماهیان 23 از 33 مزرعه بررسی شده به بیماری‏ لاکتوکوکوزیس آلوده بودند. همچنین، 49 جدایه لاکتوکوکوس از مجموع 100 نمونه ماهی بررسی شده جداسازی و شناسایی شد. شکل 1 نتیجه الکتروفورز جدایه‏ها را نشان می‏دهد.

مقاومت دارویی 49 جدایه لاکتوکوکوس گارویه به آنتی‏بیوتیک‏های رایج بررسی شد‏. نتایج این بررسی نشان دهنده مقادیر بالای مقاومت دارویی در جدایه‏های لاکتوکوکوس ‏است. بیش‏ترین میزان مقاومت آنتی‏بیوتیکی در مورد انروفلوکسازین و فلورفنیکل به ترتیب معادل 4/65 و 2/55 درصد و کم‏ترین میزان در مورد جنتامایسین و سولفامتوکسازول معادل 7/30 و 9/40 درصد مشاهده شد. میزان مقاومت دارویی در مورد سایر آنتی‏بیوتیک‏ها به شرح زیر بود: استرپتومایسین (9/42 درصد)، کلرامفنیکل (9/40 درصد)، تتراسیکلین (8/38 درصد)، آمپی‏سیلین (9/44 درصد)، آموکسی‏سیلین (9/44 درصد)، پنی‏سیلین (9/46 درصد)، کانامایسین (1/49 درصد) و اریترومایسین (9/48 درصد).

نتایج آنتی‏بیوگرام نشان داد که تمامی 49 جدایه‏ به دست آمده در این بررسی دارای مقاومت دارویی چندگانه بودند به‏طوری‏که 21 جدایه به بیش از نیمی از آنتی‏بیوتیک‏ها و 5 جدایه نیز به 10 آنتی‏بیوتیک از 12 آنتی‏بیوتیک مطالعه شده مقاوم بودند.

شکل1- نتیجه الکتروفورز ژن 16S rRNA باکتری لاکتوکوکوس گارویه بر روی ژل 5/1 درصد آگاروز. A: نشانگر 100bp.
B, C: نمونه‏های مورد مطالعه. D: کنترل منفی بدون DNA.
بحث و نتیجه‏‏گیری

لاکتوکوکوزیس و استرپتوکوکوزیس از جمله بیماری‏های باکتریایی هستند که با تلفات و خسارات فراوانی در ماهیان آب شیرین و شور همراه هستند. باکتری لاکتوکوکوزیس گارویه به همراه برخی باکتری‏های جنس استرپتوکوکوس که از آن جمله می‏توان به استرپتوکوکوس اینیائی اشاره کرد متعلق به خانواده استرپتوکوکاسه می‏باشند و عامل مهم بروز سپتی سمی و تلفات بالا در مزارع پرورش ماهی به‏ویژه در قزل‏آلای رنگین کمان محسوب می‏شوند (20). به دلیل شباهت زیاد علایم ظاهری استرپتوکوکوزیس و لاکتوکوکوزیس تشخیص تفریقی تنها با استفاده از روش‏های آزمایشگاهی و به‏ویژه مولکولی امکان‏پذیر است؛ ولی در هر صورت به دلیل شباهت زیاد در منظره بالینی، معمولا هر دو بیماری استرپتوکوکوزیس و لاکتوکوکوزیس با هم اشاره می‏شوند.

این دو بیماری‏ در کشورهای مختلف گزارش شده است که از آن جمله می‏توان به گزارش بیماری در اسپانیا (10)، ایتالیا (23)، استرالیا و افریقای جنوبی(24)، تایوان و انگلستان (12)، پرتغال (14)، فرانسه و کشورهای منطقه بالکان (13)، ترکیه و کره (11) اشاره کرد. در ایران نیز در سال‏های اخیر هم‏زمان با توسعه مزارع پرورش ماهی قزل آلای رنگین کمان شاهد بروز همه‏گیری با عوامل فوق در مراکز پرورش ماهی هستیم (8). نتایج بررسی حاضر نشان می‏دهد که از 33 مزرعه مورد بررسی، ماهیان 23 مزرعه به لاکتوکوکوزیس آلوده بودند (6/76 درصد) که رقم قابل توجهی است. مطالعه سلطانی نشان داد که 20 درصد از مجموع 600 کوکسی گرم مثبت جدا شده از ماهیان قزل‏آلای‏پرورشی را گونه لاکتوکوکوس گارویه تشکیل می‏دهد و مابقی مربوط به جنس استرپتوکوکوس بوده است (25). مطالعه میرزاخانی8 نشان داد که از مجموع 20 جدایه کوکسی گرم مثبت جدا شده از ماهیان مزارع پرورش ماهی استان چهارمحال و بختیاری، 11 مورد لاکتوکوکوس گارویه بوده است (17). همه مطالعات بالا نشان دهنده گسترش بیماری یاد شده در مزارع پرورش قزل آلاست.

عوامل مختلفی را در گسترش و انتقال بیماری دخیل می‏دانند که از آن جمله می‏توان به انتقال مستقیم از طریق آب، جابجایی و ورود ماهیان آلوده به کارگاه و یا تغذیه اشاره کرد. نتایج این مطالعه نشان می‏دهد که ماهیان تمامی کارگاه‏های پرورش ماهی واقع در بخش‏های پایین دست رودخانه که از پساب سایر مزارع پرورش ماهی استفاده می‏کردند به باکتری آلوده بودند و بر عکس کارگاه‏هایی که به شکل مستقیم از آب سرچشمه استفاده می‏کردند آلودگی بسیار کمتری داشتند که نقش شاخص‏های کیفی آب و همچنین، احتمال انتقال باکتری از مزارع بالادست به کارگاه‏های نواحی پایین تر رودخانه را نشان می‏دهد. تاثیر دما و وضعیت کیفی آب به‏عنوان عوامل مستعد کننده بروز بیماری قبلا توسط اوستین و همکاران[xix] نیز تاکید شده است (20). باکتری هم‏زمان با افزایش دمای آب فعالیت بیشتری می‏کند و بیماری‏زایی خود را به‏ویژه در شرایط بد بهداشتی و مدیریتی نشان می‏دهد. بنظر می‏رسد در حال حاضر انتقال آلودگی در مسیر رودخانه مهم‏ترین راه انتقال بیماری در مزارع پرورش ماهی است. این امر به واسطه ورود باکتری به آب از طریق پساب کارگاه‏های پرورش ماهی و همچنین، تغییراتی که در شاخص‏های کیفی آب اعمال می‏شود نمود پیدا می‏کند. به‏ویژه اینکه در برخی مناطق حداقل فاصله مجاز بین مزارع پرورش ماهی رعایت نشده است که خود باعث مضاعف شدن مشکل می‏شود. در کل بروز همه‏گیری به ویژه در مناطق پر تولید کشور با ضرر و زیان‏های زیادی برای صنعت پرورش ماهیان سردآبی کشور همراه است. همچنین، باید در نظر داشت که بیماری ناشی از لاکتوکوکوس گارویه در گروه بیماری‏های قابل انتقال به انسان قرار دارد (14) که این مسئله خود اهمیت بیماری را دو چندان می‏کند. در چنین شرایطی نیاز به اتخاذ سیاست‏های موثر و عملی در جهت مقابله با بیماری از قبیل واکسیناسیون و برنامه‏ریزی در راستای ریشه کنی بیماری ضروری است.

از طرف دیگر شیوع بیماری در سال‏های اخیر همراه با مصرف زیاد و بی قاعده آنتی‏بیوتیک‏های مختلف در مزارع پرورش ماهی قزل آلا با هدف پیشگیری و یا درمان بیماری بوده است که مشکلات زیادی را به دنبال دارد. نتایج این بررسی نشان دهنده مقاومت بالای دارویی جدایه‏های لاکتوکوکوس ‏است، به‏طوری‏که میزان مقاومت جدایه‏ها نسبت به آنتی‏بیوتیک‏های رایج از 8/33 تا 7/62 تغییر می‏کند، ضمن اینکه تمامی جدایه‏ها دارای مقاومت دارویی چندگانه بودند. میزان مقاومت جدایه‏های لاکتوکوکوس گارویه جدا شده از ماهیان بیمار در استان چهارمحال و بختیاری قبلا در محدوده 25 تا 100 درصد گزارش شده است (8). اگرچه اریترومایسین به‏عنوان داروی انتخابی بیماری و با پاسخ مناسب گزارش شده است (26 و 19) ولی مقاومت نسبی به آن نیز قبلاً گزارش شده است (27). میزان مقاومت نسبت به اریترومایسین در برخی مطالعات قبلی 1/46 درصد بوده است و در این مطالعه 4/47 درصد گزارش می‏شود که تشابه زیادی با نتایج مطالعات قبلی دارد (8). بدیهی است که مصرف زیاد آنتی‏بیوتیک‏ها