پیوندهای مفید
اخبار و اعلانات
آمار
| تعداد نشریات | 44 |
| تعداد شمارهها | 1,877 |
| تعداد مقالات | 15,278 |
| تعداد مشاهده مقاله | 43,731,101 |
| تعداد دریافت فایل اصل مقاله | 17,563,144 |
افزایش تولید آنتیبیوتیک کلاولانیک اسید با ایجاد گونههای استرپتومایسس کلاولیجروس تراریخت واجد ژن claR | |||||||||||||||||||||||||
| زیست شناسی میکروبی | |||||||||||||||||||||||||
| مقاله 5، دوره 3، شماره 10، تیر 1393، صفحه 37-44 اصل مقاله (381.47 K) | |||||||||||||||||||||||||
| نویسندگان | |||||||||||||||||||||||||
| مریم کی1؛ زهره حجتی* 2؛ مجید متولی باشی3 | |||||||||||||||||||||||||
| 1دانشجوی کارشناسی ارشد ژنتیک، دانشگاه اصفهان، ایران | |||||||||||||||||||||||||
| 2استادیار ژنتیک، دانشگاه اصفهان، ایران | |||||||||||||||||||||||||
| 3دانشیار ژنتیک، دانشگاه اصفهان، ایران | |||||||||||||||||||||||||
| چکیده | |||||||||||||||||||||||||
| مقدمه : کلاولانیکاسید از جمله آنتیبیوتیکهای مهار کنندهی β لاکتاماز بوده که توسط استرپتومایسس کلاولیجروس تولید میشود. کلاولانیکاسید در ترکیب با سایر آنتیبیوتیکهای قوی و حساس به β لاکتاماز مورد استفاده بالینی قرار میگیرد. ژن CalR از جمله ژنهایی بوده که نقش مهمی در تنظیم تولید کلاولانیکاسید ایفا نموده و به منظور بیان ژنهای اواخر مسیر بیوسنتز کلاولانیکاسید مورد نیاز است. مواد و روشها: کانسترک نوترکیب pMTclaR حاوی ژن تنظیمی claR از دانشگاه اصفهان تهیه و به منظور استفاده، از سویه استرپتومایسس لیویدنس با استفاده از روش لیز قلیایی استخراج شد. به منظور انجام ترانسفورماسیون پروتوپلاست از باکتری استرپتومایسس کلاولیجروس تهیه و در مرحله بعد با استفاده از پلیاتیلنگلایکول در سویه استرپتومایسس کلاولیجروس ترانسفورم شد. با استفاده از استخراج پلاسمید و انجام PCR ترانسفورماسیون تأیید شد. در نهایت به منظور بررسی نحوه تأثیر ژن claR اضافه شده از روش بایواسی استفاده شد. نتایج: کلونیهای گچی حاصل از رشد استرپتومایسس کلاولیجروس ترانسفورم شده بر روی محیط GYME حاوی آنتیبیوتیک مشاهده شد که تأیید انجام ترانسفورماسیون است. از سویه ترانسفورم شده پلاسمید استخراج و ساختار آن توسط ژل الکتروفورز تأیید شد. با استفاده از پلاسمید استخراج شده و پرایمرهای اختصاصی claR واکنش PCR انجام و باند 1334 جفتبازی مشاهده شد. در نهایت با انجام روش بایواسی و مشاهدهی هاله عدم رشد در نمونه ترانسفورم شده و مقایسه آن با نمونه کنترل مشخص شد که حضور پلاسمید نوترکیب سبب افزایش 3/3 برابری تولید کلاولانیکاسید در سویه استرپتومایسس کلاولیجروس شده است. بحث و نتیجهگیری: در مطالعه حاضر، با انتقال پلاسمید نوترکیب حاوی ژن claR میزان تولید آنتیبیوتیک کلاولانیکاسید تا 5/2 برابر افزایش یافت. با توجه به اهمیت دارویی کلاولانیکاسید ایجاد سویههایی که توانایی تولید بیشتر کلاولانیکاسید را داشته باشند میتوانند به بومیسازی تولید آنتیبیوتیک کلاولانیکاسید با صرفه اقتصادی بیشتر درمقیاس صنعتی کمک شایانی نماید. | |||||||||||||||||||||||||
| کلیدواژهها | |||||||||||||||||||||||||
| استرپتومایسس کلاولیجروس؛ کلاولانیک اسید؛ بایواسی؛ پلاسمید pMTclaR؛ ژن claR | |||||||||||||||||||||||||
| اصل مقاله | |||||||||||||||||||||||||
|
مقدمه اکتینومیستها از باکتریهای رشتهای گرم مثبت بوده که تولید کننده دو سوم متابولیتهای ثانویه با فعالیت زیستی گسترده هستند. در میان اکتینومیستها اعضای جنس استرپتومایسسها بیش از 70 درصد متابولیتهای ثانویه را تولید میکنند(1). این دسته از باکتریها قادرند با تولید آنزیمهای هیدرولیتیک خارج سلولی، بسیاری از ترکیبات از جمله قندها، الکلها، اسیدهای آمینه و ترکیبات آروماتیک را متابولیزه کنند (2). استرپتومایسسها به علت داشتن کروموزوم خطی بزرگ در میان باکتریها ساختار ژنتیکی غیر معمول را نشان میدهند (3). استرپتومایسسها واجد دستهای از ژنهای تنظیم کننده تولید آنتیبیوتیک و اسپورزایی هستند. در این بین استرپتومایسس کلاولیجروس[1] تولیدکننده تعدادی از ترکیبات β لاکتام از قبیل سفامایسین C و کلاولانیکاسید است(4). مهمترین دسته آنتیبیوتیکها، β لاکتام بوده که برای درمان انواع آلودگیهای باکتریایی استفاده میشود. β لاکتام با آنزیمهای دخیل در مراحل نهایی بیوسنتز دیواره سلولی واکنش داده و موجب مهار سنتز پپتیدوگلیکان میشود. با توجه به این موضوع که این واکنش در میان یوکاریوتها جایی ندارد، سمیت این آنتیبیوتیکها برای موجودات عالی مانند انسان به شدت پایین بوده، در نتیجه به طور وسیع استفاده میشوند (5 و 6). کلاولانیکاسید نخستین مهار کننده β لاکتاماز بوده که مورد استفاده بالینی قرار گرفته و مصرف آن از سال 1981 آغاز شده است (4). این آنتیبیوتیک به طور گسترده توسط سویه استرپتومایسس کلاولیجروس تولید میشود. اگرچه کلاولانیکاسید فعالیت ضد باکتریایی ضعیفی داشته ولی مهار کننده قوی طیف وسیعی از آنزیمهای β لاکتاماز است. در نتیجه به همراه سایر آنتیبیوتیکهای قوی و حساس به β لاکتاماز استفاده میشود. محصول تجاری آگمنتین (کوآموکسی کلاو) از تلفیق کلاولانیکاسید با آموکسیسیلین و محصول تجاری تیمنتین از تلفیق کلاولانیکاسید با تیکارسیلین بهدست میآید (4، 6 و 7). حدود 23 ژن در مسیر بیوسنتز کلاولانیکاسید دخالت داشته و مسئول بیوسنتز، انتقال و تنظیم تولید کلاولانیکاسید هستند (8). در این میان، ژن CalR از جمله ژنهایی است که نقش مهمی در تنظیم تولید کلاولانیکاسید ایفا میکند. ژن ClaR با طول 1299 جفت باز غنی از CG بوده و یک فعال کننده رونویسی مسیر بیوسنتز کلاولانیکاسید را تولید میکند. پروتئین تنظیمی ClaR مولکول فعال کننده اختصاصی مسیر بیوسنتز کلاولانیکاسید بوده که به منظور بیان ژنهای اواخر مسیر بیوسنتز کلاولانیکاسید مورد نیاز است(9). سویه وحشی توان تولید انبوه یک محصول که توجیه کننده منافع اقتصادی و تجاری باشد را ندارد. با اصلاح سویه و تولید سویههای بهبود یافته با استفاده از روشهای مهندسی ژنتیک میتوان به هدف تولید اقتصادی یک محصول دست یافت(4). در این راستا در ابتدا سازه نوترکیب ساخته شده حاوی ژن ClaR استفاده شد. به منظور انتقال سازههای نوترکیب میتوان از روشهای مختلفی استفاده کرد. ترانسفورماسیون یکی از روشهای پرکاربرد در انتقال پلاسمید به سویههای باکتریایی است. کارایی ترانسفورماسیون با استفاده از پلیاتیلن گلایکول[2] به میزان چشمگیری افزایش مییابد. این مولکول موجب الحاق غشاهای سلولی برای انتقال DNA به سلول میشود (10). به علت حضور سیستمهای محدود کننده، کارایی ترانسفورماسیون در استرپتومایسس به شدت کاهش مییابد. به این منظور در ابتدا پلاسمیدهای نوترکیب به سویه حد واسط استرپتومایسس لیویدنس[3] منتقل شده تا شرایط به منظور ترانسفورماسیون در سویه اصلی استرپتومایسس کلاولیجروس فراهم شود. در این پژوهش سعی شده است که کانسترکت نوترکیب حاوی ژن ClaR به سویه اصلی استرپتومایسس کلاولیجروس ترانسفورم شده و میزان تأثیر آن در تولید آنتیبیوتیک کلاولانیکاسید با روش بایواسی[4] بررسی شد.
مواد و روشها تهیه سازه نوترکیب: پلاسمید pMT3206 حاوی ژن ClaR کلون شده در دانشگاه اصفهان تهیه شد. این پلاسمید در سویه باکتریای استرپتومایسس لیویدنس ترانسفورم شده تا بتوان برای ترانسفورماسیون در استرپتومایسس کلاولیجروس استفاده کرد. این سازه یک ناقل بیانی ویژه استرپتومایسس است که از یک پروموتر القایی قوی GylP1/P2 و همچنین، رپرسور آن تشکیل شده است. به منظور استفاده، پلاسمید مورد نظر از باکتری استرپتومایسس لیویدنس استخراج و استفاده شد. تهیه پروتوپلاست: به منظور تهیه پروتوپلاست از روشی که توسط اوکانیشی[5] و همکارانش در سال 1974 ارئه شد استفاده شد. به این منظور 1 سیسی از اسپور استرپتومایسس درون محیط YEMEG کشت داده شد. پس از 72 ساعت رشد ساکارز 3/10 به باکتریها اضافه و به مدت 10 دقیقه با دور 3000 سانتریفوژ انجام شد. مرحله شستشوی باکتریها با ساکارز 3/10 درصد دو بار تکرار شد. به رسوب حاصله 4 میلیلیتر محلول لیزوزیم اضافه شده و در حمام بن ماری30 درجه سانتیگرادی به مدت 15 دقیقه انکوبه شد. پس از این مدت، 5 میلیلیتر بافر P به محلول اضافه کرده و برای 15 دقیقه دیگر در شرایط قبل انکوبه شد. پروتوپلاستها با استفاده از فیلتر کتانی، فیلتر و به مدت 7 دقیقه در 3000 دور سانتریفوژ شدند. رسوب حاصله به آرامی در 1 میلیلیتر بافر P حل و مجدد سانتریفوژ شد. در پایان رسوب در 5 میلیلیتر بافر P حل شد.
شکل1- ساختار شماتیک وکتور نوترکیب pMTclaR حاوی ژن claR
ترانسفورماسیون: به منظور تسهیل در انجام ترانسفورماسیون از پلیاتیلنگلایکول استفاده شد. از آنجایی که غلظت، وزن مولکولی و زمان مجاورت پروتوپلاستها با پلیاتیلنگلایکول مهم است، پس از بهینهسازیهای متعدد غلظت 40 درصد از پلیاتیلنگلایکول 1000 به کار رفته و هنگام استفاده 5/2 میلیلیتر بافر P به آن افزوده شد. به منظور انجام ترانسفورماسیون در صورت استفاده از پروتوپلاستهای منجمد، آنها را در بن ماری 37 درجه سانتیگراد قرار داده تا زود ذوب شوند. نمونهها در دور3000 به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق سانتریفوژ شدند و مایع رویی دور ریخته شد. 500 میکرولیتر از پلیاتیلنگلایکول 40 درصد و 20 میکرولیتر از نمونهDNA به شکل همزمان به نمونه پروتوپلاستها اضافه شد. پس از گذشت 1 دقیقه، 5/2 میلیلیتر از بافر Pبه محلول اضافه شد. نمونهها در دور 3000 به مدت 3 دقیقه در دمای اتاق سانتریفوژ و پروتوپلاستها در 1 میلیلیتر از بافر P حل شدند. به منظور بازیابی پروتوپلاستهای استرپتومایسس کلاولیجروس از محیط RSM فاقد آنتیبیوتیک استفاده شد. 200 میکرولیتر از نمونه روی پلیت RSM کشت داده شد. پس از حدود 72 ساعت انکوباسیون در دمای 26 درجه سانتیگراد و بازیابی کامل پروتوپلاستها، پلیتها به وسیله 5/2 میلیلیتر محیط سافت آگار حاوی آنتیبیوتیک تایواسترپتون با غلظت 1 ماکروگرم در هر میلیلیتر پوشانده شدند. انکوباسیون به مدت یک هفته دیگر در شرایط قبلی ادامه یافت. استخراج پلاسمید: به منظور استخراج پلاسمید از روش لیز قلیایی که توسط بیرنبویم[6] و دالی[7] در سال 1979 ارائه شده بود استفاده شد. به این منظور، اسپور باکتری در محیط YEME به مدت سه روز در دمای 28 درجه سانتیگراد کشت داده شد. محیط کشت حاوی باکتری به مدت 5 دقیقه دردمای 4 درجه سانتیگراد و دور 13000 سانتریفوژ شده و به رسوب حاصله 200 میکرولیتر از محلول 1 حاوی گلوکز، TrisHCl، EDTA و لیزوزیم اضافه و در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه انکوبه شد. در ادامه محلول حاوی SDS و NaOH اضافه و به مدت 5 دقیقه بر روی یخ انکوبه شد. 300 میکرولیتر استات پتاسیم به ترکیب موجود اضافه و مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد و دور 13000 سانتریفوژ شد. محلول فنل/ کلروفرم/ ایزوآمیل الکل به محلول رویی اضافه شده و به مدت 5 دقیقه در شرایط مرحله قبل سانتریفوژ شد. فاز آبی رویی برداشته، ایزوپروپانول سرد به آن اضافه و به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق سانتریفوژ شد. به رسوب به دست آمده 1 میلیلیتر اتانول70 درصد اضافه شد. پس از گذشت 5 دقیقه در دور 13000 در دمای اتاق به مدت 5 دقیقه سانتریفوژ و مایع رویی کاملاً تخلیه شد. پس از خشک شدن کامل رسوب، 200 میکرولیتر محلول TE حاویRNase به رسوب اضافه شد. روش بایواسی: به منظور مشاهده تأثیر ClaR در بیان کلاولانیکاسید از روش بایواسی استفاده شد. در این روش نمونههای اسپور وحشی و موتانت حاوی وکتور بر روی محیط GYME حاوی آنتیبیوتیک تایواسترپتون کشت داده میشود. به این منظور، در ابتدا رقت یکسانی از اسپورها تهیه و 30 ماکرولیتر از استوک باکتریایی بر روی محیط GYME کشت داده شد. پس از 72 ساعت باکتری کلبسیلا پنمونیا[8] در محیط TSB کشت داده شد. زمانی که OD600 محیط به 9/0 تا 1 رسید 3/3 میلیلیتر از محیط حاوی باکتری را با 100 میلیلیتر محیط TSA مایع (دمای حدود 47 درجه) و 100 ماکرولیتر پنیسیلین G با غلظت 10 میلیگرم در میلیلیتر کاملاً مخلوط و بلافاصله بر روی پلیتهای حاوی باکتری ریخته شد. هاله عدم رشد باکتریهای کلبسیلا پنمونیاپس از 24 ساعت مشاهده شد.
نتایج سازه نوترکیب pMTClaR حاوی ژن ClaR از دانشگاه اصفهان تهیه و به منظور استفاده از سویه استرپتومایسس لیویدنس استخراج شد. پلاسمیدهای استخراج شده به منظور انجام ترانسفورماسیون به سویه اصلی استرپتومایسس لیویدنس استفاده شد. به منظور تهیه پروتوپلاست، باکتری استرپتومایسس کلاولیجروس در محیط YEMEG که حاوی گلیسین و گلیسرول بوده و شرایط را به منظور رشد مناسب استرپتومایسس کلاولیجروس فراهم آورده، کشت داده شد. پس از 72 ساعت پروتوپلاست تهیه شد. پروتوپلاستهای تهیه شده به منظور انجام ترانسفورماسیون استفاده شدند. ترانسفورماسیون سویه استرپتومایسس کلاولیجروس با استفاده از PEG انجام شد، پس از 72 ساعت آنتیبیوتیک به محیط RSM اضافه و به مدت یک هفته در شرایط مناسب انکوبه شد. کلونیهای گچی استرپتومایسس کلاولیجروس بر روی محیط مشاهده شد و بلافاصله بر روی محیط GYME حاوی آنتیبیوتیک تایواسترپتون کشت داده شد. کلونیها بر روی محیط رشد کرده و پس از یک هفته اسپورهای خاکستری رنگ بر روی آنها تشکیل شد. رشد کلونیهای باکتری در محیط حاوی آنتیبیوتیک خود نشان از تأیید انجام ترانسفورماسیون دارد. اما به منظور تأیید نهایی فرآیند ترانسفورماسیون، استخراج پلاسمید از سویه ترانسفورم شده انجام شد. پلاسمید pMTClaR استخراج شده بر روی ژل 0. 7 درصد آگاروز برده شده و باند پلاسمیدی با طول 8642 مشاهده شد.
شکل2- کلونیهای گچی استرپتومایسس کلاولی جروس تراریخت بر روی محیط GYME حاوی آنتیبیوتیک
شکل3- وکتور pMTclaR استخراج شده از استربتومایسس کلاولیجروس تراریخت 1) نشانگر 1 kb؛ 2: پلاسمید استخراج شده
پلاسمید استخراج شده با استفاده از پرایمرهای اختصاصی ClaR، PCR شد تا حضور ژن ClaR درون پلاسمید تأیید شود (جدول 1). محصول PCR بر روی ژل 1 درصد برده شد. باند 1334 جفتبازی مربوط به ژن ClaRمشاهده شد که تأیید کننده حضور ژن در پلاسمید استخراج شده است.
جدول 1-توالی پرایمرهای مورد استفاده به منظور تکثیر قطعه claR
به منظور مشاهده تأثیر سازه نوترکیب در میزان تولید آنتیبیوتیک کلاولانیکاسید روش بایواسی استفاده شد. در این روش، با توجه به انجام آزمون توانایی و میزان برابر اسپور توانمند در هر دو پلیت استفاده شد. ولی با توجه به برابر نبودن غلظت هر دو استوک باکتریایی، تفاوت در قطر رشد اولیه باکتریها دیده شد. میزان هاله عدم رشد در نمونه کنترل و نمونه ترانسفورم شده بررسی شد. با مشاهده هاله عدم رشد و مقایسه آن با نمونه کنترل، مشخص شد که حضور سازه نوترکیب در سویه استرپتومایسس کلاولیجروس سبب افزایش بیان و تولید آنتیبیوتیک شده است. مطالعات نشان داد که پلاسمید نوترکیب pMTClaR سبب افزایش 3/3 برابری تولید آنتیبیوتیک کلاولانیکاسید در سویه استرپتومایسس کلاولیجروس شده است.
شکل 4- قطعهی تکثیر شده با استفاده از پرایمرهای اختصاصی claR 1: نشانگر 1kb؛ 2: باند ژن claR
شکل 5- نمایش افزایش میزان تولیدکلاولانیکاسید در سویه تراریخت A: نمونه تراریخت؛ B: نمونه وحشی
بحث و نتیجهگیری کلاولانیکاسید نخستین مهارکننده β لاکتاماز بوده که مورد استفاده بالینی قرار گرفته است. کلاولانیکاسید فعالیت ضد باکتریایی ضعیفی داشته اما با توجه به نقش آن در مهار آنزیمهای β لاکتاماز به همراه سایر آنتیبیوتیکهای قوی استفاده میشود. با توجه به اهمیت دارویی کلاولانیکاسید ایجاد سویههایی با قابلیت تولید مقادیر بالای این آنتیبیوتیک بسیار حائز اهمیت است. یکی از راههای افزایش تولید آنتیبیوتیک شناسایی و تکثیر ژنهای تنظیمی این ترکیب و افزایش تعداد کپی آنها بوده که میتواند به افزایش بیان آنتیبیوتیک منجر شود. ژن claRیکی از ژنهای کنترل کننده مسیر بیوسنتز کلاولانیکاسید بوده که تأثیر آن در افزایش بیان کلاولانیکاسید در مطالعات پیشین نشان داده شده است. در سال 2006 هانگ[ix] و همکارانش با ایجاد کتابخانه ژنومی از DNA استرپتومایسس کلاولیجروس، به کلون نمودن ژنهای تنظیمی claR، ccaR و afsR در پلاسمید pIBR25 اقدام و به استرپتومایسس منتقل کردند. به ترتیب میزان تولید کلاولانیکاسید توسط پلاسمیدهای تولید شده 5/2، 5/1 و 6/1 برابر افزایش یافت (11). در این تحقیق، به منظور کلون نمودن ژن claR برای نخستین بار از وکتور pMT3206 استفاده شد. این وکتور یک وکتور بیانی چند کپی ویژه استرپتومایسس است که واجد پروموتر القایی gylP1/p2 تحت تنظیم گلیسرول و ژن مهار کننده GylR است. ژن GylR یک رپرسور را میسازد که در صورت نبودن گلیسرول از بیان پروموتر القایی gylP1/P2 ممانعت میکند. به این ترتیب میتوان با اضافه کردن گلیسرول، میزان بیان ژن claR را افزایش داد. مکنیل[x] و همکارانش در سال 1987 از روش الکتروپوریشن به منظور ترانسفورماسیون استفاده کردند (12). روش الکتروپوریشن گرچه ساده و سریع بوده اما کارایی آن نسبت به استفاده از پلیاتیلنگلایکول کمتر است. بنابراین، در این تحقیق از پلیاتیلنگلایکول استفاده شد. میانکش پلیاتیلنگلایکول با پروتئینها و کربوهیدراتهای سطح غشا سبب تسهیل انتقال پلاسمید نوترکیب به باکتری استرپتومایسس کلاولیجروس میشود. در مطالعه حاضر، با انتقال پلاسمید نوترکیب حاوی ژنclaR میزان تولید آنتیبیوتیک کلاولانیکاسید تا 3/3 برابر افزایش یافت. این نتیجه میتواند به بومیسازی تولید آنتیبیوتیک کلاولانیکاسید با صرفه اقتصادی بیشتر درمقیاس صنعتی کمک شایانی نماید.
تشکر و قدردانی از معاونت پژوهشی دانشگاه اصفهان برای حمایت مالی (طرح 25695/90) تشکر و قدردانی میشود. | |||||||||||||||||||||||||
| مراجع | |||||||||||||||||||||||||
|
References (1) Dyson P. Streptomyces. Encyclopedia of Microbiology. 3rd ed. UK: Swansea University; 2009. (2) Hopwood, DA. Streptomyces in nature and medicine the antibiotic maker. 1rd ed. USA: Oxford University press; 2007. (3) Inoue S, Higashiyama K, Uchida T, Hiratsu K, Kinashi, H. Cromosomal circularization in Streptomyces griseus by nonhomologus recombination of deletion ends. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 2003; 67(5): 1101-08. (4) Saudagar PS, Survase SA, and Singhal RS. Clavulanic acid: A review. Biotechnology Advances 2008; 26(4): 335-51. (5) Baggaley KH, Brown AG, Schofield CJ. Chemistry and biosynthesis of clavulanic acid and other clavams. Natural product reports 1997; 14(4): 309-33. (6) Livermore DM. β-lactamase mediated resistance and opportunities for its control. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 1998; 41 (suppl 4): 25-41. (7) Santos VC, Pereira JB, Haga RB. Stability of clavulanic acid under variable PH, ionic strength and temperature conditions a new kinetic approach. Biochemical Engineering Journal 2004; 45(2): 89-93. (8) Song YJ, Jensen SE, Lee KJ. Clavulanic acid biosynthesis and genetic manipulation for its overproduction. Applied Microbiology and Biotechnology 2010; 88(3): 659-69.
(9) Perez-Redondo R, Rodriguez-Garcia A, Martin JF, Liras P. The claR gene of Streptomyces clavuligerus encoding a lys R-type regulatory protein controlling clavulanic acid biosynthesis, in linked to the clavulanate-9-aldehyde reductase (car) gene. Gene 1998; 12; 211(2): 311-21. (10) Kuwano T, Shirataki C, Itoh Y. Comparison between polyethylene glycol and polyethylenimine mediated transformation of aspergillus nidulans. Current Genetics 2008; 54(2): 95-103. (11) Hung TV, Ishida K, Parajuli N. Enhanced clavulanic acid production in Streptomyces clavuligerus NRRL3585 by overexpression of regulatory genes. Biotechnology and Bioprocess Engineering 2006; 11(2): 116-20. (12) Macneil DJ. Introduction of plasmid DNA into Streptomyces lividans by electroporation. FEMS Microbiology letter 1987; 42(2-3): 239-44.
| |||||||||||||||||||||||||
|
آمار تعداد مشاهده مقاله: 2,477 تعداد دریافت فایل اصل مقاله: 903 |
|||||||||||||||||||||||||