افزایش بازدهی روش طبیعی استفاده از محیط اسپیزیزن برای انتقال پلاسمید به درون باکتری باسیلوس سوبتیلیس با استفاده از یک پپتید کاتیونیک تراوا کننده غشا باکتریایی

مقدمه

باسیلوس سوبتیلیس[1] باکتری استوانه‌ای شکل گرم مثبتی است که بیشتر در خاک یافت می شود. این باکتری با داشتن یک سیستم ترشحی فعال و کارامد، قادر است پروتئین‏ها‏ی متنوعی را به محیط پیرامونی خود ترشح نماید. استفاده از این ویژگی در تولید پروتئین‏ها‏ی نوترکیب باعث تسهیل مراحل تولید این پروتئین‌ها می‏شود (1). از دیگر مزایای این میکرو ارگانیسم که آن را به عنوان یک میزبان مناسب در تکثیر و بیان ژن‏های هترولوگ معرفی می‌کند توان رشد سریع، سهولت دستکاری ژنتیکی در ژنوم باکتری، غیر بیماری‏زا بودن، ژنوم مشخص و تعیین ترادف شده و ظرفیت بالا در ترشح پروتئین است (2). با همه این مزایا استفاده از این باکتری به عنوان میزبان دارای معایبی نیز است. تولید پروتئینازهای داخل و خارج سلولی مثل WPRA که باعث تجزیه پروتئین‌های ترشحی می‌شود از مشکلات بزرگ همسانه سازی و بیان در این باکتری است که این مشکل با ساخت سویه‌هایی مثلWB600 و WB700 که ژن‏های پروتئاز آن‏ها غیر فعال شده و قادرند چپرون‏هایی مثل PRSA را در حد وسیعی تولید کنند حل شده است (3، 4 و 5). از دیگر معایب این باکتری به عنوان میزبان که کار با آن را برای محققان دشوار می‏نماید نرخ بسیار پایین انتقال DNA خارجی به درون سلول باکتری یا در اصطلاح ترانسفورماسیون است. علت این محدودیت وجود دیواره ضخیم پپتیدوگلیکان در اطراف غشاء سلولی باسیلوس سوبتیلیس است که مانند یک سد به شدت راه نفوذ ماکرومولکول‏ها‏ی خارجی به درون سلول باکتری را کاهش می‏دهد.

با توجه به این‏که فرآیند کلونینگ و انتقال DNA پلاسمیدی از مهم‏ترین فرآیند‏ها‏ی کاربردی در بیوتکنولوژی و مهندسی ژنیتک است که طی آن ژن هدف در قالب یک ناقل پلاسمیدی وارد باکتری میزبان می‏شود، بهینه‏سازی آن باعث دستیابی به نتایج اولیه و ثانویه بهتر در طی تراریخت نمودن باکتری هدف خواهد شد که این موضوع در مورد باکتری باسیلوس سوبتیلیس که دارای مزیت‏ها‏ی بسیاری در حوزه انتقال ژن‏ها‏ی نوترکیب و بیان آن‏هاست و از طرفی توانایی جذب پایین DNA خارجی را دارد، از اهمیت بسزایی برخوردار است.

در حال حاضر روش‏ها‏ی متعددی برای انتقال DNA خارجی به درون باکتری باسیلوس سوبتیلیس وجود دارد که مقرون به صرفه و پر کاربردترین آن‏ها‏ ‌انتقال DNA به درون سلول صلاحیت دار شده با روش طبیعی است. هرچند این روش بسیار ساده و در دسترس است، اما انتقال DNA خارجی توسط آن با بهره وری بسیار پایینی انجام می‏گیرد. اساس این روش استفاده از یک محیط کشت ترکیبی حداقلی (اسپیزیزن)[2] برای رشد و تکثیر باکتری باسیلوس سوبتیلیس است به نحوی که در این محیط سلول‏ها‏ی باکتریایی به علت نبود برخی از مواد اولیه مورد نیاز برای رشد کامل، توانایی ساخت پپتیدوگلیکان دیواره سلولی خود را به شکل کامل ندارند. بنابراین، سلول رشد یافته به شکل پروتوپلاست است. در این شرایط با توجه به نبود دیواره سلولی کامل در اطراف سلول باکتری، DNA خارجی بیشتری در مجاورت غشاء سلول قرار می‏گیرد و جذب DNA از محیط پیرامونی افزایش می‏یابد (6). بنابراین، به نظر می‏رسد اگر بتوان بدون تهدید حیات باکتری ابتدا بر سد ضخیم پپتیدوگلیکان دیواره سلولی باکتری غلبه نمود و در ادامه تراوایی غشاء سلولی را نیز افزایش داد می‏توان راندمان انتقال DNA خارجی به درون باکتری را به میزان در خور توجهی بهبود بخشید. تاکنون تحقیقات زیادی در مورد پپتید‏ها‏ی کاتیونیک تراوا کننده غشاء[3] به عنوان ابزاری برای انتقال و رها‏سازی داروها و دیگر ترکیبات زیستی در سطح سلول‏ها‏ی هدف انجام شده است. این پپتیدها به طور میانگین از 20 تا 50 اسید آمینه تشکیل شده اند و به علت دارا بودن تعداد در خور توجهی اسید آمینه‏ها‏ی لیزین و آرژینین در ساختار خود دارای بار الکتریکی مثبت هستند. همچنین، این پپتیدها در کنار داشتن بار مثبت به علت داشتن ساختارهای آمفی پاتیک قادرند بدون نیاز به گیرنده غشایی در عرض غشاء نفوذ کرده و با ایجاد ساختارهای حفره مانند[4] غشاء سلول را نسبت به ترکیبات محیط پیرامونی خود بویژه ماکرومولکول‏ها‏یی مانند پروتئین و الیگونوکلئوتیدها نفوذپذیر نمایند. (7). این دسته از پپتید‏ها‏ می‏توانند در باکتری‌های گرم مثبت مانند باسیلوس سوبتیلیس از طریق میانکنش با تیکوئیک اسید موجود در دیواره سلولی باکتری که دارای بار منفی است به غشاء سلول نفوذ کرده و با ایجاد ناپایداری در ساختار آن موجب نفوذپذیر شدن این غشاء نسبت به ترکیبات پیرامونی سلول باکتریایی شوند (8 و 9). (شکل 1)

شکل 1- نحوه میانکنش پپتیدهای کاتیونیک با ساختارهای آنیونیک موجود در دیواره سلولی (A) و ساختار غشایی (B) باکتری‏ها‏ی گرم مثبت

سکروپین[5] و میلیتین[6] پپتیدهایی هستند که توانایی در خور توجهی برای ایجاد تغییرات بر روی ساختار غشاء باکتری‏ها‏ دارند و به ترتیب جزو پپتیدهای سیستم ایمنی در نوعی پروانه[7] و زنبور عسل هستند. پپتید‏ها‏ی سکروپین از 37 تا 39 اسید آمینه تشکیل شده اند که دارای یک انتهای N به شدت آمفی پاتیک با ساختار آلفا هلیکس هستند که توسط یک قسمت ارتجاعی به انتهای C آبگریز متصل شده است. همچنین، پپتید‌ میلیتین نیز از 26 اسید آمینه تشکیل شده است که بر خلاف سکروپین یک انتهای C به شدت آمفی پاتیک با ساختار آلفا هلیکس دارد که به انتهای N آبگریز متصل شده است (10 و 11).

با توجه به نقش و پتانسیل پپتیدهای کاتیونیک در افزایش تراوایی غشاء سلول‏ها‏ی باکتریایی، در این مطالعه، نحوه اثر پپتید CM11 که هیبریدی مشتق شده از پپتیدهای سکروپین و میلیتین است بر میزان انتقال پلاسمید DNA خارجی به درون سلول‏ها‏ی باسیلوس سوبتیلیس بررسی شد. این پپتید (CM11) با توالی WKLFKKILKVL-NH₂ تشکیل یافته از نواحی Cecropin A (1-7 residues) -Mellitin (5-8 residues) است که با تعداد اسیدآمینه کمتر دارای عملکردی مشابه با پپتیدهای سکروپین و ملیتین است (12 و 13). بر این اساس از پپتید CM11 به عنوان یک پپتید تراواکننده غشاء باکتریایی به منظور بررسی و ایجاد تغییر در راندمان انتقال پلاسمید pWB980به درون باکتری باسیلوس سوبتیلیس استفاده شد.

مواد و روش‏ها‏

سنتز پپتید

پپتید هیبرید CM11 بر پایه کربوکسیماید انتهای C متصل شده به رزین اختصاصی[8] در فاز جامد و با استفاده از روش استاندارد سنتز شد (آزمایشگاه سنتز دارو، گروه زیست شناسی دانشگاه امام حسین (ع)). پپتید سنتز شده توسط HPLC فاز معکوس بر روی ستون C18 با استفاده از یک شیب غلظتی از استونیتریل 10 تا 60 درصد در آب با 1/0 درصد ‏تری فلورواستیک اسید با خلوص بالای 90 درصد خالص‏سازی شد. در انتها برای تأیید صحت و همسانی پپتید از آزمون طیف سنجی جرمی[9] استفاده شد (14).

سویه باکتریایی و پلاسمید

سویه باسیلوس سوبتیلیس [10]WB600 (دریافت شده ازگروه تحقیقاتی دکتر یخچالی، پژوهشگاه ملی ژنتیک) به عنوان میزبان استاندارد برای بررسی انتقال پلاسمید استفاده شد. همچنین، از پلاسمید pWB980[11] (3.8 kbp) حاوی نشانگر انتخابی آنتی بیوتیکی کانامایسین به عنوان DNA خارجی استفاده شد. این ناقل مشتقی از پلاسمیدpUB110، دارای پروموتر P43 و همچنین یک توالی دنباله مشتق از پلاسمید pUC18 است که برای کلونینگ در باکتری باسیلوس سوبتیلیس زیاد استفاده می‏شود.

تهیه محلول پپتیدی

پپتید لیوفیلیز شده در بافر فسفات سالین با اسیدیته 2/7 با غلظت یک میلی‌گرم بر میلی‌لیترحل و از آن استوک تهیه شد.

تهیه محیط کشت ترکیبی اسپیزیزن

به منظور تهیه و آماده‏سازی محیط کشت حداقلی اسپیزیزن (6) از ترکیبات زیر استفاده می‏شود(گرم بر لیتر):

25 K₂HPO₄. 3H₂O: ؛ 6 : K₂HPO₄؛
2 : Na₂SO₄ ؛ 0135/0 : FeCl₃ ؛ 00034/0 : MnSO₄؛ 3/0 : MgSO₄. 7H₂O ؛ 1 : Na₃C₆H₅O₇؛
 4 : Glucose ؛ 2 : Glutamate و 04/0 : L-Tryptophane؛

مستعدسازی سلول‏ها‏ی باکتریایی باسیلوس سوبتیلیس WB600

برای بررسی تاثیر پپتید هیبریدی CM11 بر توانایی باکتری باسیلوس سوبتیلیس WB600 در جذب و دریافت DNA خارجی از دو روش مختلف برای تهیه سلول‏های مستعد این باکتری استفاده شد. در روش اول سوش مورد نظر باکتری از طریق انکوباسیون 18 ساعته بر روی محیط کشت آگار لوریا برتانی احیا شد. سپس 5 ویال استریل شامل: یک میلی‏لیتر محیط کشت حداقلی اسپیزیزن تهیه و به هر ویال غلظت مختلفی از پپتید که شامل: 5/0، 1، 2، 3 و 6 میکروگرم در میلی‏لیتر بود، اضافه شد. سپس به هر ویال یک کلونی از باکتری احیا شده تلقیح و در دمای 35 درجه سانتی‏گراد با تکانش 150 دور در دقیقه گرمادهی شد تا در OD₆₀₀ دانسیته سلولی برابر 5/0 شود. در روش دوم، آماده‏سازی اولیه باکتری‌ها در محیط کشت اسپیزیزن و بدون استفاده از پپتید انجام شد و پپتید در مرحله نهایی ترانسفورماسیون به همراه پلاسمید به محیط حاوی باکتری اضافه شد.

ترانسفورماسیون B.subtillis WB600

در روش اول برای انتقال پلاسمید به باکتری، ابتدا 10میکرولیتر از پلاسمید pWB98 با غلظت 100 نانوگرم بر ماکرولیتر به هر یک از 5 ویال حاوی 1 میلی‌لیتر محیط کشت اسپیزیزن حاوی باکتری و مقادیر متفاوت از پپتید (5/0، 1، 2، 3 و6 میکروگرم در میلی‏لیتر) اضافه شد و 14 ساعت در 30 درجه سانتی گراد انکوبه شد. در روش دوم انتقال پلاسمید به شکل هم‏زمان با غلظت‏ها‏ی مورد نظر پپتید تلقیح شد. بنابراین، به هر یک از ویال‏ها‏ی حاوی یک میلی‌لیتر محیط کشت اسپیزیزن و باکتری مستعد شده، 10 ماکرولیتر از پلاسمید pWB980 با غلظت 100 نانوگرم بر میکرولیتر به همراه غلظت‏ها‏ی مورد نظر پپتید (5/0، 1، 2، 3 و6 میکروگرم در میلی‏لیتر) اضافه شد و در 30 درجه سانتی‏گراد برای مدت 14 ساعت گرمادهی شد. به منظور مقایسه میان راندمان انتقال پلاسمید در روش طبیعی و روش استفاده از پپتید از نمونه‏ها‏ی کنترل استفاده شد. برای این منظور در نمونه کنترل همه مراحل از قبیل فرآیند مستعدسازی سلول و ترانسفورماسیون در عدم حضور پپتید انجام شد. آزمایش‏ها‏ برای بررسی قابلیت تکرار پذیری و مطالعه آماری سه بار تکرار شد.

غربال‏گری و محاسبه تعداد باکتری‏های دریافت کننده پلاسمید

پس از اتمام فرآیند ترانسفورماسیون برای مشخص نمودن تعداد باکتری‏های ترانسفورم شده، ویال‌ها به مدت 5 دقیقه و با نیروی 2000 در مقیاس نیروی گرانش[12]سانتریفیوژ شدند. رسوب‌های حاصل در 20 میکرولیتر محیط کشت تازهLB مایع به شکل سوسپانسیون درآمدند و بر روی محیط آگار LB دارای 30 میکرو‌گرم بر میلی‌لیترکانامایسین کشت داده شدند. برای بررسی عملکرد و نحوه تاثیرگذاری غلظت‏ها‏ی متفاوت پپتید بر فرآیند ترانسفورماسیون، شاخص‏ها‏یی طبق جدول 1 بررسی و محاسبه و در ادامه تغییر و کارآمدی انتقال پلاسمید با استفاده از نتایج و فرمول زیر ارزیابی شد. بررسی‏ها‏ سه بار تکرار شده و مقدار میانگین باکتری‏ها‏ی شمارش شده در هر روش به عنوان شاخصه اصلی انتقال پلاسمید در نظر گرفته شد.

محاسبه آماری

آمارهای توصیفی با استفاده از شاخصه پراکندگی انحراف معیار و شاخصه مرکزی میانگین تعداد کلونی‏ها‏ی باسیلوس سوبتیلیس رشد یافته بر روی محیط کشت LB حاوی آنتی بیوتیک کانامایسین گزارش شدند. یک آزمون آماری تی-تست[13] مستقل برای مقایسه دو نوع روش و مقایسه داده‌های کمی میان دو گروه در نظر گرفته شد. مدل آنالیز واریانس[14] برای تحلیل آماری شاخصه‌های دیگر مانند تاثیر دوز‏ها‏ی پپتیدی استفاده شد و احتمال کمتر از 05/0
(P value < 0.05) برای معنادار بودن از نظر آماری در نظر گرفته شد. داده‏ها‏ با استفاده از نرم افزار SPSS نسخه 16 تحلیل شدند.

نتایج

همان‏طور که در شکل 2 نشان داده شده است، کارایی فرآیند انتقال پلاسمید به باکتری در روش اول و با استفاده از غلظت پپتیدی 2 میکروگرم بر میلی‌لیتر به میزان CFU/µg DNA 10⁴X2/4 است که این میزان 5 برابر نمونه کنترل (CFU/µg DNA 10⁴X 7/0) است. همچنین، نتایج نشان دادند که کارآمد‏ترین حالت انتقال پلاسمید به باکتری باسیلوس سوبتیلیس هنگامی رخ می‌دهد که سلول‏های باکتری با استفاده از روش دوم و با غلظت 2 میکروگرم بر میلی‌لیتر پپتید تیمار شوند. به طوری که با استفاده از این روش تعداد CFU/µg DNA 10⁴X1/5 از باکتری‏ها‏ پلاسمید pWB980 را دریافت نمودند که این میزان در حدود 7 برابر گروه کنترل است. طبق نتایج به دست آمده میزان ترانسفورماسیون در حضور غلظت‏ها‏ی 5/0 و 3 میکروگرم در میلی‏لیتر از پپتید در هر دو روش تقریبا مشابه بود. محاسبات آماری نشان دادند که تعداد باکتری‏ها‏ی دریافت کننده پلاسمید در هر دو روش دارای اختلاف آماری معناداری با گروه کنترل هستند (P value <0.001). همچنین، یافته‌ها مشخص نمودند که با افزایش غلظت پپتید در هر دو روش، کاهش معناداری در تعداد باکتری‏ها‏ی دریافت کننده پلاسمید روی می‌دهد (P value <0.001).

شکل 2- نمودار مقایسه میزان نرخ انتقال پلاسمید pWB980 به باکتری باسیلوس سوبتیلیس WB600در حضور پپتید CM11، در روش اول سلول‏ها‏ی باکتریایی در تمامی مراحل رشد و آماده‏سازی در محیط اسپیزیزن و همچنین، مرحله انتقال پلاسمید توسط پپتید تیمار شدند اما در روش دوم فقط در مرحله انتقال پلاسمید این تیمار انجام شد‏.

A: مقایسه تغییر در میزان نرخ انتقال پلاسمید در روش آماده‏سازی نوع اول و روش استاندارد

B: مقایسه تغییر در میزان نرخ انتقال پلاسمید در روش آماده‏سازی نوع دوم و روش استاندارد

C: مقایسه تغییر در میزان نرخ انتقال پلاسمید در روش آماده‏سازی نوع اول و نوع دوم