ارزیابی میزان حساسیت و ویژگی آزمون هوج در تشخیص مقاومت به کارباپنم از نمونه‏ها‏ی کلبسیلا پنومونیه

مقدمه

امروزه عفونت‏ها‏ی ناشی از انتروباکتریاسه‏ها‏ی مقاوم به کارباپنم رو به گسترش بوده و این امر نگرانی‏ها‏یی را در حیطه درمان ایجاد کرده است. ‏انتروباکتریاسه‏ها‏ی مقاوم به کارباپنم به طور معمول نه تنها به آنتی‏بیوتیک‏ها‏ی بتالاکتام بلکه به اکثر کلاس‏های ضدمیکروبی نیز مقاوم هستند. ‏کارباپنم آخرین سد دفاعی در برابر عفونت‏های باکتریایی گرم منفی است که بر آنتی بیوتیک‏ها‏یی با طیف اثر وسیع مقاوم است‏ (1).‏ ‏از جمله کارباپنم‏ها‏ می‏توان‏ ایمی پنم، ‏مروپنم و ارتاپنم را نام برد که طیف اثر گسترده تری نسبت به سایر آنتی بیوتیک‏ها‏ی بتالاکتام دارند. بهترین درمان در عفونت‏ها‏ی ایجاد شده توسط انتروباکتریاسه‏ها‏یی است‏ که تولید کننده بتالاکتامازهای مختلف هستند. ‏با افزایش استفاده از کارباپنم‏ها‏، ‏شمار باکتری‏ها‏ی مقاوم با مکانیزم‏ها‏ی مقاومتی متفاوت رو به افزایش است‏ (2).‏ ‏از مهم‏ترین مکانیزم‏ها‏ی مقاومتی علیه کارباپنم تولید کارباپنماز است‏ که KPC و VIM از شایع‏ترین آن‏ها‏‏ در انتروباکتریاسه‏ها‏ هستند (1).‏ ‏کلونی‏ها‏ی انتروباکتریاسه‏ها‏ی مقاوم به کارباپنم که از بیماران جداسازی و نگه‏داری می‏شود خود می‏توانند منبع انتقال این باکتری‏ها‏ باشند. ‏

کارباپنماز، ‏برای اولین بار در سال 1996 میلادی در ایالات متحده کشف و پس از آن گسترش جهانی یافت (3).‏ ‏از دیگر کشورهای پیشرو پس از ایالات متحده می‏توان‏ اسرائیل، ‏شمال شرقی آمریکا و یونان را نام برده که تولید آن آندمیک شده است. جدا سازی کارباپنماز از کلبسیلا پنومونیه برای اولین بار ‏در سال 2001 میلادی انجام شد‏ (4) و پس از آن برخی کشورهای اروپایی از جمله فنلاند، ‏آلمان، ‏فرانسه، ‏ایتالیا، ‏نروژ و هلند و همچنین انگلستان موفق به این امر شدند (5 و 6). در ادامه نیز برخی کشورهای آسیایی از جمله ایران و ترکیه، ‏عربستان و ‏عراق نیز به مطالعه و جداسازی کارباپنماز پرداختند (7-10).‏ ‏

از روش‏ها‏ی قابل انجام برای شناسایی کارباپنماز، ‏می‏توان‏ آزمون هوچ و بررسی مولکولی ژن‏ها‏ی موثر را نام برد. ‏در کنار روش‏ها‏ی ذکر شده، استفاده از محیط‏ها‏ی میکروبیولوژی اختصاصی کروموژنیک نیز از جمله روش‏ها‏ی مورد اعتماد است‏ (11).‏ ‏

 هدف از انجام این مطالعه، بررسی میزان کارایی تشخیص اختصاصی کلبسیلا پنومونیه کارباپنماز مثبت  با استفاده از روش آزمون هوچ‏ در سویه با مقاومت چندگانه خواهد بود. ‏در این آزمون، ‏رشد باکتری مورد سنجش در برابر باکتری حساس (E.coli) به دیسک آنتی بیوتیک (مروپنم و یا ارتاپنم) کشت داده شده و هاله عدم رشد برگ شبدری باکتری حساس (E.coli) بررسی می‏شود. ‏

مواد و روش‏ها

جمع آوری نمونه‏ها‏

تعداد 36 ایزوله کلبسیلا پنومونیه مولد آنزیم کارباپنماز جمع آوری شده از مراکز درمانی دو استان تهران و استان اصفهان، ‏بر روی محیط بلاد آگار کشت داده شد. ‏معیار انتخاب نمونه‏ها‏، ‏مقاومت‏ها‏ی چندگانه آنتی بیوتیکی و تولید آنزیم کارباپنماز بودند که در تشخیص‏ها‏ی ابتدایی برای آن‏ها‏‏ گزارش شده است. ‏نمونه‏ها‏ شامل: ترشحات‏ها‏ی ریوی، ‏مایع شکمی، ‏مجاری ادراری، ‏مایع مغزی نخاعی، ‏مایع چشمی، ‏بافت و زخم حاصل از سوختگی بودند. ‏

تشخیص کلبسیلا در مراکز جمع آوری نمونه با توجه به ظاهر کلونی به دلیل وجود کپسول، ‏رنگ‏آمیزی گرم و پس از آن استفاده از محیط‏ها‏ی افتراقی شامل: اوره آز، ‏سیمون سیترات، ‏TSI MR-VP, و SIM انجام شد‏. ‏همچنین، ارزیابی تولید آنزیم کارباپنماز توسط محیط کروموژنیک CHROMagarKPC انجام شد. ‏

آزمون تاییدی آنزیم کارباپنماز

ابتدا تمامی نمونه‏ها‏ در محیط CHROMagarKPC کشت و رشد بر روی آن بررسی شد تا از وجود آنزیم کارباپنماز در نمونه‏ها‏ اطمینان حاصل شود‏. ‏برای این منظور ابتدا محیط پایه CHROMagarOrientation  بر طبق شرکت سازنده به غلظت 33 گرم در لیتر آب مقطر تهیه، ‏جوشانده وسپس اتوکلاو شد. ‏سپس محلول مکملی CHROMagarKPCsupplement را با غلظت 40 میلی گرم در میلی لیتر تهیه و به میزان 10 میلی‏لیتر به هر لیتر محیط پایه اضافه شد. ‏تقسیم محیط تهیه شده به پلیت‏ها‏ انجام و پس از سرد شدن آن‏ها‏‏‏، ‏کشت نمونه‏ها‏ بر روی محیط کروم آگار ساخته شده انجام شد. ‏رشد باکتری‏ها - نشان از وجود کارباپنماز و نوع باکتری تولید کننده این آنزیم است -، ‏همراه با رنگ کلونی‏ها‏ی ایجاد شده بررسی شد. ‏در صورتی‏که باکتری ذکر شده اشریاشیاکلیباشد، کلونی‏ها‏ی صورتی پررنگ مایل به قرمز، ‏اگر کلبسیلا، ‏سیتروباکتر و انتروباکترباشد به رنگ آبی متالیک و اگر سودوموناس باشدکلونی‏ها‏ی کرم، ‏مات و شفاف ایجاد می‏کند. ‏

آزمون هوچ‏^[1]

این آزمون‏، ‏طبق دستورکار CLSI[2] انجام شد، ‏شرح وقایع بدین شکل‏ است که:

سوسپانسیون باکتری با رقت نیم مک فارلند از باکتری E.coli ATCC 25922 تهیه شد. ‏تهیه رقت 10/1 با محیط مولر هینتون براث و یا سالین از سوسپانسیون مرحله قبل با رقت نیم مک فارلند تهیه شد‏. ‏

کشت چمنی با سواپ استریل از سوسپانسیون با رقت 10/1 E. ‏coliATCC25922 بر روی محیط مولر هینتون آگار انجام شد‏. ‏برای خشک شدن کشت مذکور، ‏در دمای اتاق به مدت 3 الی 5 دقیقه انکوبه شد‏.

یک دیسک مروپنم 10 میکروگرمی در مرکز پلیت قرار داده شد.

باکتری مورد آزمایش برای بررسی کارباپنماز از لبه دیسک قرار داده شده در مرکز به سمت لبه پلیت، ‏کشت خطی داده شد. ‏با دقت به این موضوع که سواپ با دیسک برخورد نکند. ‏در 2 ± 35 درجه سانتی‏‏گراد به مدت 16 تا 24 ساعت انکوبه شد. ‏پس از گذشت مدت زمان انکوبه، ‏بررسی هاله عدم رشد به شکل برگ شبدری در نمونه‏ها‏ی تولید کننده کارباپنماز انجام شد‏. مقایسه شکل هاله عدم رشد نمونه کنترل مثبت با نمونه‏ها‏ی انجام شده برای تشخیص موارد مثبت در آزمون‏ هوچ انجام شد. ‏

تعداد 15 نمونه از سوش‏ها‏ی کلبسیلا پنومونیه ای که تولید کننده کارباپنماز نبودند برای تعیین اختصاصیت آزمایش شدند. ‏

نتایج

تمامی نمونه‏ها‏ی جامعه آماری با آزمون‏ CHROMagarKPC تایید و مثبت گزارش شدند. ‏ازآنجاکه تمامی نمونه‏ها‏ی جمع آوری شده کلبسیلا پنومونیه بودند، ‏با رنگ آبی بر روی محیط مذکور رشد پیدا کردند. ‏

از 36 ایزوله جمع آوری شده تنها 30 مورد از آن‏ها‏‏ با ایجاد هاله عدم رشد برگ شبدری در آزمون هوج ثبت شدند. ‏تصاویر برخی از نمونه‏ها‏ی انجام شده با آزمون هوچ در شکل 1 قابل مشاهده هستند.

تمامی نمونه‏ها‏ی کنترل، ‏برای تعیین اختصاصیت که تولید کننده کارباپنماز نبودند در آزمون هوج با نتیجه منفی همراه بودند. ‏

باتوجه به میزان فراوانی مثبت‏ها‏ در روش آزمون هوچ‏ و همچنین نتایج ایزوله‏ها‏ی کنترل منفی، ‏میزان حساسیت این روش 3/83 درصد‏، ‏و اختصاصیت یا ویژگی آن 100 درصد ‏محاسبه می‏شود‏. ‏این مقادیر با توجه به نتایج به‏دست‏ آمده از فراوانی نمونه‏ها‏ی مثبت واقعی و نمونه‏ها‏ی منفی واقعی به‏دست‏ آمده است. ‏

در بررسی آنتی بیوگرام گزارش شده از مراکز جمع آوری نمونه‏ها‏، این نتیجه به دست آمد که تمامی آن‏ها‏‏ به آنتی بیوتیک‏ها‏ی آمپی سیلین، ‏آمیکاسین، ‏جنتامایسین، ‏تتراسایکلین، ‏سفتازیدیم، ‏سیپروفلوکساسین و ایمی پنم مقاوم هستند.

 ‏

‏شکل 1- تصاویری از نتایج آزمون هوج، نمونه های شماره241، 242، 243، 244، 134، 220، 221 مثبت و نمونه های شماره 135، 136، 219 منفی هستند.