A study on isolated endophytic bacteria from Glycine sp. and their role on control of some plant pathogenic fungi

مقدمه

قارچ‏های فوزاریوم سولانی[i] و آلترناریا الترناتا[ii] از جمله قارچ‏های موثر درایجاد بیماری در گیا‏هان هستند‏ این قارچ‏‏ها از معمول‏‏ترین قارچ‏های جداسازی شده در آرژانتین و سایر مناطق جهان هستند‏ (1 و 4). آلترناریا الترناتا در همه مکان‏ها دیده شده و تقریبا از تمامی زیستگاه‏ها ایزوله شده است (5 و 10). بیماری‏های ایجاد شده توسط این قارچ خیلی رایج هستند. گیا‏هان میزبان مهمی برای این ارگانیسم به شمار می‏آیند به‏طوری‏که‏ می‏تواند از گیا‏هانی مانند سیب، بروکلی، هویج، انواع سیب زمینی، گوجه فرنگی، لیمو، گل کلم و حتی گیا‏هان علفی جدا شود. این قارچ به طور معمول قسمت‏های هوایی گیا‏هان را مورد تهاجم قرار می‏دهد (11) و می‏تواند علائم مختلفی را شامل: لکه‏ها و زخم‏ها را برروی برگ‏ها ایجاد کند (12). در واقع این قارچ موجب بیماری‏های نکروتیک در گیا‏هان مختلف (13 و 14) و در نهایت به مرگ کامل گیاه منجر می‏شود. از طرف دیگر این پاتوژن سبب بیماری بادزدگی در گیا‏هانی از جمله پنبه می‏شود (15).

قارچ فوزاریوم سولانی یکی دیگر از فراوان‏ترین قارچ‏های جداسازی شده از خاک و گیا‏هان از بین رفته است (16 و 17). این قارچ در بسیاری از محصولات زراعی سبب پژمردگی و به میزان در خور توجهی سبب از بین رفتن محصول می‏شود (18). همچنین می‏تواند سبب قهوه ای شدن درونی ساقه‏ها و ریشه نیز شود (19). سویه‏های فوزاریوم سولانی به‏قدری فراوانی‏شان در خاک و مواد گیاهی فاسد زیاد است که به‏عنوان تجزیه کنندگان محسوب می‏شوند. همچنین آن‏‏ها پاتوژن‏هایی با اختصاصیت میزبانی در شمار زیادی از گیا‏هان با اهمیت در کشاورزی از جمله لوبیا، خیار و سیب زمینی شیرین محسوب می‏شوند. علاوه بر این آن‏‏ها در رابطه با عفونت‏های فرصت طلب در انسان و حیوان نیز موثر هستند‏ و سبب عفونت سیستمیک با میزان مرگ و میر بالا می‏شوند (20). با توجه به این‏که این دو قارچ از قارچ‏های مهم در ایجاد بیماری در گیا‏هان به شمار می‏آیند، هدف از تحقیق حاضر، جداسازی باکتری‏های اندوفیتیک از گیاه سویا و تاثیر متابولیت‏‏های ضد میکروبی تولید شده توسط این ارگانیسم‏‏ها بر پاتوژن‏های قارچی فوزاریوم سولانی و آلترناریا الترناتا است‏.

مواد و روش‏ها

قارچ‏‏های تهیه شده

در تحقیق حاضر، برای ارزیابی ترکیبات ضد قارچی تولید شده توسط باکتری‏‏های اندوفیتیک جداسازی شده از گیاه سویا از نمونه‏های قارچی معتبر
(Alternaria alternatePTCC 5224; Fusarium solani complex PTCC5284) به شکل آمپول‏های لیوفلیزه از مرکزکلکسیون قارچ‏ها و باکتری‏های ایران استفاده شد‏ و طبق دستورالعمل مرکز احیا شد‏ند.

شرایط کشت گیاه سویا

بذر‏های گیاه سویا به نام D. P. X کتول از سازمان دانه‏های روغنی گرگان خریداری شدند و در گلدان‏‏های به اندازه 120 در 84  با عمق 80 سانتی‏متر‏ی کاشته شدند. سه روز پس از کاشت، جوانه‏ها بیرون زدند. به علت سردی هوا گلدان‏‏ها در دمای اتاق (27 تا 30) درجه سانتی‏گراد نگهداری شدند. برای رشد گیا‏هان، آبیاری گلدان‏‏ها به شکل سه روز یک‏بار به مقدار لازم انجام می‏شد و به مدت 50 تا 70 روز در مجاورت نور خورشید به شکل دائمی ‏قرار داده شدند.

جداسازی باکتری‏های اندوفیتیک از گیاه سویا

باکتری‏های اندوفیتیک بر اساس روش ارائه شده توسط هونگ و آناپورنا جداسازی شد‏ند (21). به این ترتیب که ابتدا چند گیاه سالم را که قبلاً در گلدان‏‏ها کاشته شده بودند با ریشه از خاک در آورده و به آزمایشگاه منتقل شد‏ند. گیا‏هان به آرامی در زیر آب قرار گرفتند تا گل و لایشان زدوده شود. در مرحله بعد چند برگ تازه وبه ظاهر سالم نیز از قسمت‏های نزدیک جوانه‏ها و قسمت‏های بالایی و میانی انتخاب کرده و در یک پلیت بزرگ گذاشته شدند. علاوه بر این ساقه‏های گیاه را از 10 سانتی‏متر بالاتر از سطح زمین و قسمت‏های بین برگ‏ها جدا نموده و با یک تیغه استریل به قطعات 3 تا 4 سانتی‏متر‏ی بریده شدند ودر یک پلیت بزرگ جداگانه قرار داده شدند. سپس بخش‏‏های جداسازی شده با آب مقطر در پلیت شسته، به‏وسیله‏‏ یک پنس استریل به پلیت دیگر منتقل و به مدت یک دقیقه در الکل اتیلیک70 درصد قرار داده شدند. سپس دوباره با پنس استریل به پلیت دیگر منتقل و به مدت 5 دقیقه در‏هایپرکلریت سدیم 2 درصد غوطه ور شدند. در مرحله بعد با پنس استریل به پلیت استریل دیگر منتقل و 5 بار با آب مقطر استریل شسته شدند تا به طور کامل سطح آن‏‏ها عاری از مواد ضد عفونی کننده شود. سپس دو‏ هاون و دسته تمیز برداشته، درون آن‏‏ها الکل ریخته و شعله ور شده تا بدین ترتیب استریل و عاری از میکروب شوند. سپس دو سی سی آب مقطر استریل داخل ‏هاون ریخته شده و بخوبی با دسته ‏هاون ساقه‏ها و برگ‏‏ها کوبیده شدند تا به طور کامل عصاره شان بیرون آمده و به ‏شکل یک سوسپانسیون همگن شوند.

شایان ذکر است که برای جداسازی باکتری‏‏های اندوفیتیک از سوسپانسیون‏‏های تهیه شده از برگ و ساقه به میزان یک میلی‏‏لیتر و به طور جداگانه به 9 میلی‏‏لیتر محیط کشت نوترینت براث استریل افزوده شد. پس از 24 ساعت انکوباسیون در دمای 30 درجه سانتی‏گراد ‏از محیط‏‏های کشت کدر شده به کمک آب مقطر استریل رقت متوالی (^8-10-^1-10) تهیه شد. از سه رقت نهایی به میزان یک دهم میلی‏‏لیتر برداشته و به شکل سفره‏ایی به کمک میله شیشه ای استریل در سطح پلیت حاوی محیط کشت برین‏هارت اینفیوژن آگار تلقیح شد‏. پلیت‏‏ها در دمای 30 درجه سانتی‏گراد‏ و به مدت 24 تا 72 ساعت انکوبه شدند. پس از گذشت زمان ذکر شده کلونی باکتری‏های ظاهر شده بر روی پلیت‏ها که از نظر شکل و قوام متفاوت بودند، بر اساس باکتری‏های اندوفیتیک ایجاد شده از ساقه و برگ به‏طور جداگانه شماره گذاری شدند‏. شایان ذکر است که خالص‏سازی در طی چند مرحله و در زمان‏های مختلف پس از کشت انجام شد (21).

ارزیابی اثر مهاری باکتری‏های اندوفیتیک بر قارچ‏های بیماری‏زای گیاهی

انتشار در چاهک

در این مرحله ابتدا محیط کشت سابورود دکستروز براث[iii] برای رشد قارچ‏‏های تهیه شده از مرکز ذخایر ژنتیکی تهیه نموده، نمونه‏های مذکور در محیط‏‏های اشاره شده تلقیح‏ و به مدت 24 ساعت در انکوباتور در دمای 35 درجه سانتی‏گراد نگهداری شدند. همچنین، باکتری‏های اندوفیتیک جداسازی شده به مدت 24 ساعت در دمای 30 درجه سانتی‏گراد در گرم‏خانه انکوبه شد‏ند. سپس سوسپانسیون باکتریایی (اندوفیتیک) در 8000 دور در دقیقه به مدت 15 دقیقه قرار داده و سانتریفوژ شدند. پس از آن به میزان یک میلی‏‏لیتر از سوسپانسیون‏‏ها برداشته و بر روی محیط کشت مولر هینتون آگار به شکل سفره ایی به طور کامل به کمک میله شیشه ای استریل کشت داده شدند. سپس به کمک بورل استریل چهار چاهک به‏طور منظم درپلیت‏ها ایجاد شدند‏. به کمک سمپلر از سوپرناتانت اندفیتیک‏‏ها به میزان 50 لاندا برداشته و به آرامی چاهک‏ها پر شد‏ند. پلیت‏‏ها به مدت 24 ساعت در دمای آزمایشگاه قرار داده شدند. پس از گذشت زمان یاد شده قطر ‏هاله‏ها ارزیابی و نتایج ثبت شد‏ (22).

روش خطی موازی

در این روش هر کدام از پاتوژن‏ها برروی پلیت مولر هینتون آگار[iv] به شکل خطی کشت داده شدند و باکتری‏های اندوفیتیک به ‏شکل عمود با قارچ‏‏های پاتوژن کشت داده شدند. پلیت‏‏ها در دمای اتاق به مدت 24 ساعت قرار داده، نتایج ارزیابی و ثبت شدند‏ (23).

شناسایی باکتری‏‏های تولید کننده ترکیبات ضد قارچی با استفاده از کیتAPi(بیومریکس[v] فرانسه)

نمونه‏هایی که تاثیر ضد قارچی را از خود نشان دادند انتخاب شده و پس از انجام آزمون‏های اولیه مانند رنگ آمیزی گرم، آزمایش‏‏های اکسیداز، کاتالاز و اکسیداتیو/فرمنتاتیو توسط کیت‏های 20 NE شناسایی شدند. به این ترتیب که نمونه های خالص شده اندوفیتیکی، به مدت 24 ساعت در محیط کشت نوترینت براث تلقیح شدند. سپس، تحت شرایط استریل نمونه ها به هریک از لوله های کیت‏ها اضافه و به مدت 24 ساعت انکوبه شدند. در نهایت، پس از افزودن برخی از معرف‏ها بر اساس دفترچه شناسایی کیت و تغییر رنگ ایجاد شده از طریق سایت بیومریکس شناسایی شدند.

منحنی رشد باکتری‏‏های تولید کننده ترکیبات ضد میکروبی

در این مرحله 3 باکتریی که اثر ممانعتی از خود نشان داده بودند در محیط کشت نوترینت براث کشت داده شدند. پس از گذشت زمان‏‏های متوالی (12، 24، 36، 48 و 72 ساعت) جذب نوری میکروارگانیسم‏‏های تولید کننده ترکیبات ضد میکروبی در طول موج 620 نانومتر ارزیابی و منحنی رشد آن‏‏ها رسم شد‏.

نتایج

جداسازی باکتری‏های اندوفیتیک از گیاه سویا

در آزمایش یاد شده 39 باکتری جداسازی شد‏ که 20 باکتری از ساقه و 19 باکتری از برگ‏های گیاه سویا بودند. پس از انجام آزمایش‏های اولیه برای شناسایی مشخص شد که 10 باکتری جداشده از ساقه و 7 باکتری جداشده از برگ گرم منفی و 10 باکتری جدا شده از ساقه و 12 باکتری جداشده از برگ گرم مثبت بودند. این باکتری‏ها به شکل‏های کوکسی، میله ای، فیلامنتوس و باسیلوس مشاهده شد‏ند.

ارزیابی اثر ‏مهاری باکتری‏های اندوفیتیک بر قارچ‏های بیماری زای گیاهی

از بین ارگانیسم‏های جداسازی شده 3 باکتری تأثیر ضد میکروبی علیه پاتوژن‏های خریداری شده را نشان دادند که تمامی آن‏ها گرم منفی بودند. از این تعداد دو ارگانیسم به ساقه و یک ایزوله دیگر به برگ گیاه سویا مربوط بودند. نتایج اثر آنتاگونیستی ایزوله‏هایی که ‏هاله عدم رشد را نشان داده اند به‏ شکل مجزا علیه پاتوژن‏ها در جداول1 و2 آمده است. همچنین شکل‏های 1 و 2 عدم رشد را به شکل خطی موازی و انتشار در چاهک نشان داده است.

جدول 1- قطر‏هاله‏های ایجاد شده علیه آلترناریا الترناتا به روش انتشار در چاهک

Cl:کلونی جداشده از برگ

Cs: کلونی جداشده از ساقه

جدول 2- قطر‏هاله‏های ایجاد شده علیه فوزاریوم سولانی به روش انتشار در چاهک

Cl:کلونی جداشده از برگ

Cs: کلونی جداشده از ساقه

شکل 1- نمونه ایی از تأثیر باکتری‏های جداسازی شده بر قارچ آلترناریا آلترناتا به روش خطی موازی

شکل 2- تأثیر آنتاگونیستی برخی از سویه‏ها علیه فوزاریوم سولانی به روش انتشار در چاهک

شناسایی باکتری‏های تولید کننده ترکیبات ضد میکروبی با استفاده از کیت APi

شناسایی میکروارگانیسم‏ها با استفاده از کیت‏های Api انجام شد‏. بر اساس نتایج به‏دست آمده از شبکه Api، هر سه ارگانیسم مورد نظر سودموناس آئروجینوزا بوده اند. ویژگی تأثیر دو تای آن‏ها که از برگ (Cl9,Cl17) به‏دست آمده است مشابه بود؛ به‏طوری‏که‏ شماره پروفیل به‏دست آمده از طریق شبکه برای هر دونمونه یکسان (0154574) و با 9/98 درصد نزدیکی سودوموناس آئروجینوزا گزارش شده است. نمونه دیگر (Cs9) که از ساقه به‏دست آمده است با نزدیکی 8/98 درصد وشماره پروفیل (154474) نیز سودموناس آئروجینوزا گزارش شده است. شایان ذکر است که در برخی ازآزمایش‏ها تفاوت‏هایی مشاهده شده است که می‏توان آن را مربوط به استرین‏های متفاوت از جنس سودموناس نسبت داد.

منحنی رشد باکتری‏های تولید کننده ترکیبات ضد میکروبی

شکل‏های3 تا 5 بیانگر رشد میکروارگانیسم در فاز‏های مختلف زمانی است‏. از طرف دیگر در این فاز‏های زمانی، تولید متابولیت توسط ارگانیسم نیز ارزیابی شد که در جداول بالا به آن‏ها اشاره شده است. به طور کلی ارگانیسم‏های جداسازی شده از زمان صفر تا 48 ساعت رو به رشد بوده و پس از آن رشد باکتری رو به کاهش رفته است. نتایج به‏دست آمده از منحنی رشد باکتری‏ها بیانگر آن است که بیشتر ترکیبات ضد قارچی در طول دوران رشد تولید شده است زیرا به‏طور هم‏زمان در همان بازه زمانی تاثیر ترکیبات تولیدی نیز ارزیابی ‏شده است.

بحث و نتیجه گیری

باکتری‏های اندوفیتیک تقریباً در بیشتر گیا‏هان مطالعه شده یافت شده اند (24). گزارشات زیادی در رابطه با باکتری‏های اندوفیتیک و گیا‏هانی که در آن‏ها ساکن اند شامل: برنج، موز، گندم، چغندر قند، هویج، سویا، سیب زمینی، لیمو، گوجه فرنگی و غیره داده شده است (25 و 26). گاهی این میکروارگانیسم‏ها می‏توانند به‏عنوان عوامل بیوکنترل دربرابر پاتوژن‏ها و بهبود باروری و توسعه گیا‏هان بدون هیچ آسیب محیطی عمل کنند. اندوفیت‏ها می‏توانند متابولیت‏های ثانویه، آنزیم‏های خارج سلولی، هورمون‏های گیاهی مشابه و موادی که اجزای بیوشیمیایی را در تعامل مثبت با گیا‏هان فعال می‏کند را تولید کنند (27). همچنین، اندوفیت‏ها نقش مهمی در حمایت از میزبان‏شان در برابر پاتوژن‏ها نیز دارا هستند.‏ این میکروارگانیسم‏ها منبع جدیدی از ترکیبات فعال زیستی وشیمیایی با پتانسیلی بالقوه برای بهره‏برداری در پزشکی، کشاورزی و عرصه‏های صنعتی هستند‏ که مطالعاتی روی آن‏ها انجام شده است (28). بر همین اساس در تحقیق حاضر به تنوع باکتری‏های اندوفیتیک و بررسی اثر آنتاگونیستی آن‏ها بر روی پاتوژن‏های قارچی پرداخته شده است.

سویا یک گیاه لگومینوز آسیایی است که در بیشتر کشور‏ها مانند چین، هندوستان،  برزیل و امریکا برای تولید روغن و پروتئین آن کشت می‏شود و به‏طور وسیع در تولید مواد غذایی حیوانات و انسان استفاده می‏شود (29). این گیاه به‏طور متوسط دارای 40 درصد پروتئین است که وزن خشک آن دارای 20 درصد روغن و 85 درصد آن بدون کلسترول و غیر اشباع است‏. تمام طول چرخه رشد سویا به حمله حشرات حساس است (30) و بیشتر مورد حمله عفونت‏های قارچی در طی کاشت یا پس از آن در هنگام حمل و نقل یا ذخیره‏سازی قرار می‏گیرد که به میزان در خور توجهی روی تولید محصول اثر می‏گذارد (31). بنابراین، در پروژه حاضر ضمن جداسازی و شناسایی اولیه باکتری‏های اندوفیتیک گیاه سویا به تولید متابولیت‏های ضد میکروبی اندوفیت‏ها و تأثیر آن بر پاتوژن‏های قارچی منتخب مانند: فوزاریوم و آلترناریا پرداخته شده است.

فوزاریوم و آلترناریا از جمله بیش‏ترین پاتوژن‏های قارچی جدا شده از سویا در آرژانتین و سایر مناطق جهان به شمار می‏آیند (1 و 4). معمول‏ترین گونه آلترناریای جدا شده از دانه‏های سویا، آلترناریا الترناتا است. چنان‏که حدود 80 درصد از نمونه‏ها، آلودگی با سویه‏های آلترناریا را در حدود 2 تا 84 درصد نشان دادند (32). زینیل و همکارانش[vi] در پژوهشی توانستند853 سویه باکتری اندوفیتیک از اندام‏های هوایی 4 گونه گیاه زراعی و 27 گونه گیاه علفی جداسازی کنند که 17 ایزوله به گیاه سویا مربوط بوده است. این بررسی تفاوت مهمی را در باکتری‏های جدا شده از گونه‏های مختلف گیاه میزبان نشان داده و نیز حضور مساوی از باکتری‏های گرم مثبت و منفی را در گیا‏هان مختلف گزارش کرده است (33).

در تحقیق حاضر، 39 ارگانیسم از ساقه و برگ جداسازی شد که 20 باکتری از ساقه و 19 باکتری از برگ گیاه بود. به‏دنبال آن ارزیابی تولید ترکیبات ضد میکروبی با استفاده ازروش‏های خطی موازی و انتشار در چاهک ارزیابی شد.

حسنین و همکارانش در سال 2009، 60 باکتری اندوفیتیک از ریزوسفر گندم جداسازی نمودند و اثر آن‏ها را بر روی 13 پاتوژن قارچی گیاه با استفاده از 3 تکنیک مختلف استفاده از فیلتر‏های کاغذی، روش دیسک آگار و روش انتشار در چاهک نشان دادند. از بین باکتری‏های جداسازی شده 23 باکتری اثر ممانعتی نشان دادند. دو باکتری بیش‏ترین اثر ممانعتی را د نشان دادند که به‏ شکل مولکولی نیز شناسایی شدند و به جنس سودوموناس آئروژینوزا و باسیلوس فیرموس متعلق هستند‏.

بیشتر مشاهدات بیانگر آن است که درصد بالایی از باکتری‏های اندوفیتیک به گاماپروتئوباکتریا متعلق بوده است. این باکتری‏ها جزو باکتری‏‏های هستند‏ که در پزشکی و از نظر اکولوژیکی بسیار با اهمیت اند و گروه‏های مانند خانواده انتروباکتریاسه، سودوموناسه و ویبریوناسه در این گروه قرار دارند (34). باکتری‏های جداسازی شده با نتایج به‏دست آمده از این پژوهش، همگام است و نشان دهنده این است که بیشتر باکتری‏های اندوفیتیک به این گروه تعلق دارند و سودوموناس از جمله بارز‏ترین اندوفیتیکی است که از گیا‏هان جداسازی شده است (35- 37). علاوه بر مطالب ارائه شده، نوع سوش گیاهی کار شده نیز بسیار با اهمیت است (21). در بررسی حاضر، مطالعات روی گونه Glycine maxانجام شده است. بیشتر باکتری‏ها به گرم مثبت‏ها متعلق بوده ولی در بیشتر مقالات باکتری‏های گرم منفی در بافت‏های گیا‏هان مختلف گزارش شده است (38 و 39).

مقایسه بین تحقیقات گذشته و اکنون بیانگر این است که باکتری‏های اندوفیتیک جداسازی شده از گیا‏هان و بافت‏های مختلف‏شان از نظر تنوع و پراکندگی متفاوت هستند.‏ همچنین، شرایط آب و هوایی، نوع محیط کشت انتخابی، نوع پاتوژن گیاهی مورد آزمایش و ماده تولید شده توسط باکتری‏های اندوفیتیک می‏تواند با یکدیگر فرق داشته باشد.

براساس نتایج حاصل از پژوهش حاضر باکتری‏های گرم مثبت نسبت به گرم منفی بیشتر جداسازی شده اند که در تحقیقات انجام شده توسط سایر محققین نیز این امر تأیید شده است (21) در حالی‏که نمونه‏های گرم منفی توانایی بیشتری در تولید ترکیبات ضد میکروبی داشته اند. از طرف دیگر با توجه به منحنی رشد ارگانیسم‏هایی که متابولیت ضد میکروبی تولید کرده‏اند بیشتر این ترکیبات پس از گذشت زمان 24 ساعت تولید شده که گاهی تا 72 ساعت نیز ادامه داشته اند که با رشد باکتری در همان محدوده زمانی مرتبط است‏. به‏طوری‏که‏ می‏تواند احتمال وجود باکتریوسین را برای باکتری‏های اندوفیتیک مطرح نماید. از طرف دیگر حضور آنزیم‏های پکتینولیتیک توسط برخی از گونه‏های سودموناس می‏تواند علتی بر تاثیر آن برروی قارچ‏ها به حساب آید (40)؛ و یا تولید ترکیباتی حاوی گوگرد توسط باکتری‏های اندوفیتیک می‏تواند علتی بر کاهش اثر آن بر روی قارچ‏های مذکور باشد. از آنجایی که قارچ‏ها باعث مشکلات گیاهی می‏شوند، استفاده از این ترکیبات می‏تواند برای کنترل بیماری‏های گیاهی کاربرد داشته باشد. از طرف دیگر، استفاده از بذر‏های مناسب سبب شده که سویای منطقه گرگان به علت وجود اندوفیتیک‏ها با کم‏ترین آسیب مواجه شوند.

(10) EL-MorsyEM, Serag MS, ZahranJAT,RashedIG. The occurrence ofmicrofungi in the ectorhizosphere-rhizoplane zone of some selected macrophytes from theNile Delta of Egypt. Bulletin of the Faculty of Science, Assiut University 2000; 2 (2-D): 15- 26.

(11) Laemmlen F. Alternaria diseases. ANR Publication 8040. California Univ. Okland, CA: Agriculture and natural resources; 2001.

(12) El-Morsy EM,Dohloband SM, Hyde KD. Diversity of Alternariaalternateacommon destructive pathogen of Eichhorniacrassipesin Egypt and its potential use inbiological control Fungal Diversity 2006; 23 (21): 139-58.

(13) Kohmoto K, Otani H, Tsuge T. Alternriaalternate pathogenesis. In:kohmoto K, singh US, singhRP,editor. Pathogenesis and host specificity in plant diseases: histopathological biochemical, genetic and molecular bases, Eukaryotes. vol 2. Pergamon, Oxford, United Kingdom; 1995 (2): 51- 63.

(14) Thomma BPHJ. Alternariaspp. from general saprophyte to specific parasite. Mol. PlantPathol2003; 4 (4): 225-36.

(15) Hadas S,Jakoby T. The Alternariadisease of cotton. Phytoparasitica 1981; 9(11) : 252.

(16) Booth C. The Genus Fusarium. Common wealth Mycological Institute. England: KEW, Surrey; 1977: 237

(17) Summerbell RC. Aspergillus, Fusarium, Sporothrix, Piedraia, and their relatives. In: Howard DH (ed.). Pathogenic fungi in humans and animals. New York: Marcel Dekker Inc; 2003.

(18) Joseph B, DarandMA,KumarVBioefficacy of Plant Extracts to Control FusariumsolaniF. Sp. MelongenaeIncitant of BrinjalWiltGlobal Journal of Biotechnology & Biochemistry2008; 3 (2): 56- 59.

(19) Rajput NA,PathanMA,Jiskani MM, Rajput AQ,Arani RR. Pathogenisity and host range of Fusariumsolani (MART) sacc. Causing dieback of shisham (Dalbergiasissooroxb). Pak Bot 2008;40 (6): 2639-31.

(20)KrcmeryV,KrcmeryJr,JesenskaZ,SpanikS,GyarfasJ, NogovaJ, et al. Fungaemia due to Fusariumspp. in cancer patientsHospInfect 1997; 36 (3):223-8.

(21) Hung PQ, Annapurna K. Isolation and Characterization of Endophytic Bacteria in Soybean (Glycine sp.) Omonrice 2004; 12 (4): 92-101.

(22) HassaneinWA, AwnyNM, El-MougithAA, Salah El-DienS. H. Characterization and Antagonistic Activities of Metabolite Produced by Pseudomonasaeruginosa. Journal of Applied Sciences Research 2009; 5 (4): 392-403.

(23) Erden KA, Yurudu SNOThe Evaluation of Antibacterial Activity of Fabrics Impregnated with Dimethyltetradecyl (3- (Trimethoxysilyl) Propyl) Ammonium Chloride. Journal of Biology Research Article 2008; 67 (2):115-122.

(24) Ryan RP,Germaine K, Franksand A, RyanDJ. Bacterial endophytes: recent developments and applicationsFEMS Microbiol. Lett 2008; 278 (1) :1-9.

(25) Sturz AV, Christie BR,Nowak J. Bacterial endophytes: Potential role in developing sustainable systems of crop productionCrit. Rev. Plant. Sci 2000; 19 (24): 1-30.

(26) Rosenblueth M, Martinez-Romero E. Bacterial endophytes and their interactions with hosts. The American phytopathological society2006; 19 (8): 827-837.

(27) Cherry AJ. Development of biopesticide registration and risk assessment guidelines for GhanaNatural Resources Institute. University of Greenwich. ,GRZYWACZ 2005: (2) ;1-5.

(28) Haggag WM. Role of Entophytic Microorganisms in Biocontrol of Plant DiseasesLife science journal 2010; 7 (2) : 57- 62.

(29) Robbs CF, BittencourtAM. Controlebiológico de insetos. O controlebiológico de insetosnocivosaagricultura com o emprego de fungosimperfeitosouhifomicetos. Biotecnologia, CiênciaeDesenvolvimento 1998; 2 (1): 10-12.

(30) Smith TM, Stratton GW. Effects ofsyntheticpyrethroid insecticides on nontargetorganisms. Residue Reviews 1986; 97(41): 93- 120.

(31) BraseS, EncinasA, KeckJ,NisingCFChemistry and biology of mycotoxins and realted fungal metabolitesChemical Reviews 2009; 109 (9) : 3903- 90.

(32) Barros GG, Oviedo MS, Ramirez ML, Chulze SN. Safety Aspects in Soybean Food and Feed Chains: Fungal and Mycotoxins Contamination. In: Tzi-Bun Ng, editor. Soybean - Biochemistry, Chemistry and Physiology. [S. l. ]: Agricultural and Biological Sciences. ; 2011. 1-2.

(33) Zinnel DK, Lambrecht P, Harris NB, Feng Z,Kuczmarski D, Higley P, et al. Isolation and Characterization of endiphytic colonizing bacteria from Agronomic Crops and Prairie Plants. Applied and Environmental Microbioligy2002; 68 (5): 2198- 208.

(34) CheliusMK, TriplettEW. The diversity of archaea and bacteria in association with the roots of Zea mays L. Microb. Ecol 2001; 41 (3): 252- 63.

(35) KaisarO, PuhlerA,SelbitschkaWP. hylogenetic analysis of microbial diversity in the rhizoplane of oilseed Rape (Brassica napuscv. Westar) employing cultivation-dependent and cultivation-independent approaches. Microb. Ecol 2001; 42 (2) : 136-49.

(36) SunL,Qiu F, Zhangand X, Dai X. Endophytic bacterial diversity in rice (Oryza sativa L.) roots estimated by 16S rDNA sequence analysis. Microb. Ecol 2008;  55(3): 415- 24.

(37) Stoltzfus JR, SoR, MalarvithiPP,LadhaandJK, de BruijnFJIsolation of endophytic bacteria from rice and assessment of their potential for supplying rice with biologically fixed nitrogenplant soil 1997; 194 (12): 25- 36.

(38) ElbeltagyA,NishiokaK,Suzuki H, Sato T, SatoYI,Morisaki H, et al. Isolation andcharacterization of endophytic bacteria from wild and traditionally cultivated ricevarieties. Soil Sci. Plant Nutr 2000; 46 (7): 617- 9.

(39) Schell MA, Denny TP, Huang J. Extracellular Virulence Factors of Pseudomonas Solanacearum: Role in Disease and their Regulation. In:Kado CL, Crosa JH, editors. Molecular Mechanisms of Bacterial Virulence, Kluwer Academic Press, The Netherlands; 1994 (2): 311-4.

(40) Hallmann  J , Quadt-Hallmann A ,    Mahaffee WF, Kloepper  J W. Bacterial endophytes in agricultural crops. Can. J. Microbiol. 1997. 43: 895-914.