بهینه‏سازی فعالیت اگزوپکتینازی قارچ Monilia جداسازی شده از نارنگی در تخمیر غوطه‏ور

نقوی, نفیسه سادات; نادری, سعیده; شاهانی پور, کهین; ضیاء, محمد علی; رستگاری اصفهانی, علی اصغر

تعداد نشریات	44
تعداد شماره‌ها	1,877
تعداد مقالات	15,278
تعداد مشاهده مقاله	43,731,475
تعداد دریافت فایل اصل مقاله	17,563,690

بهینه‏سازی فعالیت اگزوپکتینازی قارچ Monilia جداسازی شده از نارنگی در تخمیر غوطه‏ور

زیست شناسی میکروبی

مقاله 4، دوره 1، شماره 1، خرداد 1391، صفحه 23-30 اصل مقاله (447.18 K)

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

نفیسه سادات نقوی^* ¹؛ سعیده نادری²؛ کهین شاهانی پور³؛ محمد علی ضیاء⁴؛ علی اصغر رستگاری اصفهانی⁵

¹استادیار میکروبیولوژی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد فلاورجان، اصفهان، ایران،

²کارشناس ارشد میکروبیولوژی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد فلاورجان، اصفهان، ایران

³استادیار بیوشیمی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد فلاورجان، اصفهان، ایران

⁴استادیار قارچ‏شناسی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد خوراسگان، اصفهان، ایران

⁵استادیار بیوفیزیک مولکولی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد فلاورجان، اصفهان، ایران

چکیده

مقدمه: گروه‏ها‏ی متنوعی از قارچ‏ها‏ی میکروسکوپی قادرند بافت‏ها‏ی پلیمری گیاهی مانند پکتین را تجزیه کنند. بیش‏ترین کاربرد تجزیه این مواد در صنایع تولید مواد غذایی است. مواد و روش‏ها‏: در مطالعه حاضر، قارچ مولد اگزوپکتیناز از نارنگی در حال فساد جداسازی شد و خصوصیت اگزوپکتینازی آن در شرایط تخمیری غوطه‏ور بررسی شد. همچنین، تولید آنزیم قارچ جداسازی شده با قارچ صنعتی PTCC 5013 Aspergillus niger مقایسه شد. تولید و فعالیت اگزوپکتینازی محلول آنزیمی از نظر اسیدیته‏، دما، زمان فعالیت و غلظت سوبسترا بررسی شد. نتایج: قارچ جداسازی شده بر اساس خصوصیات مورفولوژیک ماکروسکوپی و میکروسکوپی در جنس Monilia از خانواده Moniliaceae قرار گرفت. بهترین تولید اگزوپکتیناز در اسیدیته‏ 7 ‏و بیش‏ترین فعالیت آنزیم در دمای50 درجه سانتیگراد، مدت زمان 30 تا 40 دقیقه، 1/5درصد سوبسترا و نسبت یک به یک محلول آنزیمی و محلول سوبسترا به دست آمد. قارچ Monilia جداسازی شده، رشد و تولید محصول سریعی داشت؛ به طوری‏که در بهترین شرایط، فعالیت اگزوپکتینازی آن 20 واحد در دقیقه بیش‏تر از قارچ Aspergillus niger به دست آمد. بحث و نتیجه گیری: اگزوپکتیناز تولید شده در محدوده وسیعی از اسیدیته‏ و دما قادر به فعالیت بود. از آنجایی که قارچ Monilia ترکیبات سمّی نیز تولید نمی‏کند، به عنوان جایگزین برای تولید آنزیم پکتیناز، به‏ویژه در صنایع غذایی پیشنهاد می‏شود.

کلیدواژه‌ها

اگزوپکتیناز؛ بهینه‏سازی؛ قارچ Monilia؛ نارنگی

اصل مقاله

مقدمه

خصوصیت مشخص دیواره گیاهان، سختی و تجزیه‏ناپذیری آن است. این ساختار برای گیاه نقش استحکام و حفاظت دارد. دیواره سلولی گیاهان دارای سه لایه داخلی، دیواره سلولی اولیه و دیواره سلولی ثانویه است. ترکیب اولیه این دیواره شامل سلولز، همی سلولز، پروتئین‏ها‏ی محلول مختلف و پکتین است‏. پکتین خانواده متنوعی از پلی‏ساکارید‏ها‏ست که بخش عمده دیواره سلولی اولیه و لایه داخلی را تشکیل می‏دهد (1 و 2). ساختار مولکولی پکتین‏ها‏ی گیاهی تا حدودی پیچیده است و از مولکول‏ها‏ی D– گالاکتورونیک اسید تشکیل شده است که با پیوند‏ها‏ی α (1→4) گلیکوزیدی به هم متصل شده اند. گروه‏ها‏ی کربوکسیل نسبتا استری هستند و با گروه‏ها‏ی اسیدی می‏توانند تا حدی استیله باشند (3). منابع مختلفی مانند پوست ترنج، پوست لیمو، پوست پرتقال، کدوتنبل، چغندر قند، قسمت گوشتی سیب، پوست نخودفرنگی، گریپ فورت و سبوس گندم سرشار از پکتین هستند (4 و 5).

انواع آنزیم‏ها‏ی تجزیه کننده پکتین شامل: پکتین لیاز، پکتین، متیل استراز، اگزوپلی‏‏‏‏گالاکتوروناز (اگزوپکتیناز)، اندوپلی‏‏‏‏گالاکتوروناز (اندوپکتیناز) و رامنوگالاکتوروناز می‏شوند که هر کدام بر روی قسمت‏ها‏ی مختلف زنجیره در انواع متفاوت پکتین مؤثرند (1). پکتینازها در فرآیند‏‏‏‏های صنعتی، نظیر: نساجی، فرآوری فیبرهای گیاهی، چای، قهوه، استخراج روغن، تیمار پساب‏ها‏ی صنعتی و تولید کاغذ استفاده می‏شوند. گسترده‏ترین کاربرد صنعتی پکتیناز در استخراج و شفاف‏سازی آبمیوه است (6). تولید پکتینازها به‏وسیله میکروارگانیسم‏ها‏ در سیستم‏ها‏ی بستر جامد و غوطه‏ور معمولاً تحت تأثیر ترکیبات محیط کشت، بویژه منابع کربن و نیتروژن و شرایط فیزیکی شیمیایی نظیر اسیدیته‏، دما و هوادهی قرار دارد. اگزوپکتیناز قطعات کوچکی را از زنجیره پکتین آزاد می‏کند. این آنزیم بر خلاف اندوپکتیناز، ویسکوزیته را به طور قابل توجهی کاهش نمی‏دهد، اما در تجزیه نهایی پکتین نقش مهمی دارد (7). هدف از مطالعه حاضر جداسازی قارچ تجزیه‏کننده پکتین از میوه‏ها‏ی درحال فساد در ایران بوده است که فعالیت آن قابل مقایسه با نمونه صنعتی باشد و بتوان آن را برای استفاده در صنایع تولید غذا به طور اولیه پیشنهاد کرد. ‏همچنین، شرایط تولید و فعالیت اگزوپکتینازی قارچ جداسازی شده در شرایط تخمیر غوطه‏ور از نظر اسیدیته‏، دما، زمان فعالیت و غلظت سوبسترا بهینه‏سازی شود.

مواد و روش‏ها‏

میکروارگانیسم‏ها‏

نمونه قارچی از نارنگی در حال فساد بر روی محیط کشت سابرود دکستروز آگار (SDA)جداسازی شد و در دمای 28 درجه سانتیگراد انکوبه ‏شد. قارچ جداسازی شده پس از خالص‏سازی از طریق مقایسه خصوصیات ماکروسکوپی و میکروسکوپی با کلید شناسایی، در حد جنس شناسایی ‏شد (8). نمونه کلکسیونی قارچ PTCC5013 Aspergillus niger نیز از کلکسیون میکروبی سازمان پژوهش‏ها‏ی علمی و صنعتی ایران تهیه و پس از تأیید گونه، برای مقایسه فعالیت اگزوپکتینازی استفاده شد.

کشت و تولید آنزیم

از روش کشت تخمیری غوطه‏ور در محیط کشت حاوی ترکیبات منبع کربن (10 گرم سبوس گندم و 15/0 گرم تفاله پرتقال)، 6 گرم سولفات آمونیوم ، 6 گرم دی هیدروژن پتاسیم فسفات، 6 گرم هیدروژن دی پتاسیم فسفات و 1/0 گرم منیزیم سولفات در لیتر استفاده شد. محیط کشت در دمای 120 درجه سانتیگراد و به مدت 20 دقیقه استریل ‏شد و پس از تلقیح 10⁷×65/1 اسپور قارچ به ازای هر 100 میلی‏لیتر محیط کشت، تخمیر در دمای 30 درجه سانتیگراد با هم زنی 140 دور در دقیقه انجام گرفت (9).

سنجش اگزوپکتیناز

فیلتره محیط کشت به مدت 20 دقیقه در دمای 10 درجه سانتیگراد با دور 10000 در دقیقه سانتریفیوژ شد. سوپرناتانت حاصل به‏عنوان محلول آنزیمی با همان حجم از محلول سوبسترا حاوی 5/0 درصد پکتین در استات سدیم 2 مولار با اسیدیته 6‏ ‏مخلوط شد و در 50 درجه سانتیگراد به مدت 20 دقیقه قرار گرفت. فعالیت آنزیم با استفاده از روش میلر[i] بر اساس سنجش میزان گالاکتورونیک اسید آزاد شده با استفاده از معرف دی نیتروسالیسیلیک‏اسید سنجش شد. جذب نوری رنگ ایجاد شده در طول موج 540 نانومتر خوانده شد و با منحنی استاندارد گالاکتورونیک اسید مقایسه ‏شد. هر میکرومول قند آزاد شده در هر دقیقه فعالیت آنزیم به‏عنوان یک واحد فعالیت در نظر گرفته شد (10). تنها سوبسترای مورد استفاده برای فعالیت آنزیم در شرایط این بررسی، پکتین بوده است و حاصل تجزیه این پلیمر با آنزیم اگزوپکتیناز، قند احیای دی گالاکتورونیک‏اسید است‏، ‏بنابراین، میزان قند احیای آزاد شده به عنوان معیار فعالیت آنزیم در نظر گرفته شد. همه مراحل بالا به طور همزمان بر روی قارچAspergillus nigerنیز انجام شد که فعالیت بالای پکتینازی آن اثبات شده است. شایان ذکر است که پکتین از شرکت سیگما[ii] و سایر مواد مورد استفاده در پژوهش از شرکت مرک[iii] تهیه شد.

بهینه‏سازی تولید و فعالیت آنزیم در قارچ جداسازی شده

به محیط‏ها‏ی کشت با مقادیر مختلف اسیدیته‏، 10⁷×65/1 اسپور قارچ به ازای هر 100 میلی‏لیتر محیط کشت تلقیح شد و میزان تولید آنزیم بررسی شد. برای بهینه‏سازی فعالیت آنزیم دماهای 35 تا 65 درجه سانتیگراد، زمان 10 تا 40 دقیقه، غلظت سوبسترای 2/0 تا 8/1 درصد و نسبت محلول آنزیمی به محلول سوبسترا به میزان 3/0 تا 5/2 بررسی شد. آزمایش‏ها در سه تکرار انجام شد و میانگین نتایج با استفاده از نرم افزارSPSS12به دست آمد.

نتایج

میکروارگانیسم جداسازی شده

قارچ جداسازی شده بر روی محیط کشت سابرود دکستروز آگار کلنی‏ها‏ی زرد رنگ با ظاهر موکوئیدی و پرزدار ایجاد کرد (شکل 1). ‏همچنین، در بررسی میکروسکوپی به صورت میسلیوم‏ها‏ی کوتاه دیوار‏دار و شبه مخمری با سلول‏ها‏ی جوانه‏زن و کلامیدوکنیدی‏ها‏ی بیضوی و کنیدیوفورهای کوتاه مشاهده شد (شکل 2) و بر اساس مقایسه با کلید شناسایی در جنسMoniliaازخانوادهMoniliaceaeقرار گرفت.

شکل 1- مورفولوژی قارچ Monilia بر روی محیط کشت سابرود دکستروز آگار. کلنی‏ها‏یی با ظاهر موکوئیدی و پرزدار از مشخصات این قارچ است‏. شایان ذکر است کلنی به رنگ زرد مشاهده شد.

شکل 2- مورفولوژی میکروسکوپی قارچ Monilia در رنگ‏آمیزی با متیلن بلو، مشاهده شده با بزرگ‏نمایی 400 برابر. میسلیوم‏ها‏ی کوتاه دیواره دار، سلول‏ها‏ی جوانه‏زن مخمری و کلامیدوکنیدی‏ها‏ی بیضوی با کنیدیوفورهای کوتاه از مشخصات این قارچ است‏.

تولید آنزیم

فعالیت اگزوپکتیناز قارچ Monilia در روزهای اول تا ششم پس‏ از تلقیح در مقادیر مختلف اسیدیته‏ رشد اندازه‏گیری شد. بهترین تولید آنزیم در اسیدیته‏ 7 در روز دوم کشت به دست آمد (شکل 3). این فعالیت معادل 55 واحد در دقیقه بود. در همین شرایط بیش‏ترین تولید آنزیم در قارچ Aspergillusniger در اسیدیته‏ 6 ‏در روز دوم کشت و برابر با 35 واحد در دقیقه به دست آمد (شکل 4).

شکل 3- فعالیت روزانه (واحد در دقیقه) اگزوپکتیناز تولید شده به وسیله قارچ Monilia در روزهای مختلف و مقادیر متفاوت اسیدیته‏.

شکل 4- فعالیت روزانه (واحد در دقیقه) اگزوپکتیناز تولید شده به وسیله قارچ Aspergillusniger در روزهای مختلف و مقادیر متفاوت اسیدیته‏.

بهینه‏سازی فعالیت اگزوپکتیناز قارچ Monilia

همان‏طور که در نمودار شکل‏ها‏ی 5 و 6 مشاهده می‏شود، بیش‏ترین فعالیت آنزیم در دمای 50 درجه سانتیگراد و 5/1 درصد پکتین به عنوان سوبسترا به دست آمد. ‏همچنین، بالاترین فعالیت آنزیم بر اساس میزان آزادسازی قند د-گالاکتورونیک اسید در زمان 30 تا 40 دقیقه مشاهده شد (شکل 7).

شکل 5- فعالیت (واحد در دقیقه) اگزوپکتیناز قارچ Monilia در دماهای مختلف.

شکل6- فعالیت (واحد در دقیقه) اگزوپکتیناز قارچ Monilia در غلظت‏ها‏ی مختلف سوبسترای پکتین.

شکل 7- میزان آزادسازی قند د-گالاکتورونیک اسید (میکرومول) در زمان‏ها‏ی مختلف فعالیت اگزوپکتیناز قارچ Monilia بر روی سوبسترای پکتین 5/1 درصد.

در مطالعه نسبت آنزیم به سوبسترا نیز مشخص شد بیش‏ترین فعالیت اگزوپکتینازی در نسبت 1 به 1 آنزیم به سوبسترا وجود دارد (شکل 8).

شکل8- فعالیت (واحد در دقیقه) اگزوپکتیناز قارچ Monilia در نسبت‏ها‏ی مختلف محلول آنزیمی به سوبسترای پکتین.

قارچ Monilia جداسازی شده در روز دوم کشت و در اسیدیته ‏7 ‏فعالیت اگزوپکتینازی بالاتری (به میزان 20 واحد) نسبت به سویه شناخته شده PTCC5013 ‏Aspergillusniger نشان داد (جدول 1).

جدول 1- مقایسه تولید اگزوپکتیناز در مقادیر مختلف اسیدیته‏ در روز دوم به وسیله قارچ‏ها‏ی Monilia و Aspergillusniger.

فعالیت آنزیم تولید شده به وسیله قارچ Aspergillusniger (واحد در دقیقه)	فعالیت آنزیم تولید شده به وسیله قارچ Monilia (واحد در دقیقه)	مقادیر مختلف اسیدیته‏ محیط رشد
5/6	2/3	اسیدیته 5
0/35	1/20	اسیدیته 6
0/32	0/55	اسیدیته 7
0/10	5/48	اسیدیته 8

بحث و نتیجه‏گیری

آنزیم‏ها‏ی تجزیه‏کننده پکتین به وسیله قارچ‏ها‏ی مختلف تولید می‏شوند. در میان این قارچ‏ها‏ توجه خاصی به جنس‏ها‏ی آسپرژیلوس و پنی سیلیوم شده است (11 و 12). اکافور و همکاران[iv] از دو قارچ Aspergillusniger و پنی سیلیوم پکتینازهایی را با منابع مختلف پسماند کشاورزی (پوست آناناس، پوسته پرتقال، خاک اره، پالپ نیشکر و سبوس گندم) تولید کردند. بالاترین فعالیت پکتینازی در هر دو قارچ بر روی سبوس گندم مشاهده شد و کشت غوطه‏ور پس‏ از 48 ساعت بهترین نتیجه را برای هر دو قارچ داشت (9).

قارچ Monilia از نظر خصوصیات میکروسکوپی بسیار مشابه Candida است‏، به طوری که قبلاً در این جنس قرار می‏گرفته است. همچنین، برخی مواقع ممکن است مشابه جنس Cladosporium به نظر برسد، اما با بررسی خصوصیات میکروسکوپی کلامیدوکنیدی‏ها‏ و میسلیوم‏ها‏ی تشکیل شده، می‏توان آن را به وضوح تشخیص داد. قارچ جداسازی شده در این تحقیق از طریق مقایسه با کلیدهای تشخیصی شناسایی شد (8).

گیتا و همکاران[v] در سال 2012 از پسماند پوست میوه‏ها‏ در محیط کشت جامد و غوطه‏ور برای تولید آنزیم‏ها‏ی پکتینولیتیک پکتین استراز و پکتات لیاز از باکتری‏ها‏ و قارچ‏ها‏ استفاده کردند. بهترین تولید، از باکتری جنس Bacillus و قارچ Aspergillus به دست آمد (13). در پژوهشی که در سال 2012 توسط ردی و اسریرامولا[vi] بر روی چندین قارچ صورت گرفت، سه گونه از Aspergillus شامل A.niger، A.flavus و A.japonicus ‏و گونه Chaetomiumglobosum توانایی بالایی در تولید پکتیناز در محیط کشت غوطه‏ور از خود نشان دادند. فعالیت آنزیم بر اساس قطر منطقه تجزیه ترکیبات پکتیکی در محیط کشت جامد اندازه‏گیری و مقایسه شده است. دمای بهینه فعالیت آنزیم 30 درجه سانتیگراد تعیین شده است و آنزیم در 8/6 اسیدیته‏ بیش‏ترین فعالیت را داشته است (14)

در مطالعه حاضر مشخص شد، این قارچ در روز دوم کشت و در اسیدیته‏ 7 ‏فعالیت اگزوپکتینازی بالاتری نسبت به سویه شناخته شده PTCC5013 ‏Aspergillusniger نشان می‏دهد (جدول 1). اختلاف در اسیدیته‏ بهینه فعالیت آنزیم می‏تواند به علت تنوع ایزوآنزیم‏ها‏ی تولید شده به وسیله قارچ‏ها‏ی مختلف باشد. نکته مهم این است که قارچ جداسازی شده در این مطالعه در محدوده اسیدیته‏ 6 تا 8 تولید آنزیم قابل قبولی را دارد و آنزیم تولید شده در دماهای 35 تا 65 درجه سانتیگراد فعالیت می‏کند. ‏بنابراین، می‏توان در شرایط مختلف از نظر اسیدیته‏ و دما از آن استفاده کرد.

قارچ Monilia اخیراً از جنس کاندیدا جدا شده و به عنوان یک قارچ ساپروفیت، فعالیت پکتینازی آن شناسایی و بررسی شد (15). در مطالعه حاضر، پس از جداسازی قارچ Monilia ابتدا تولید آنزیم آن با قارچ صنعتیPTCC5013 ‏Aspergillusniger مقایسه شد. بیش‏ترین فعالیت اگزوپکتینازی قارچ Monilia معادل 55 واحد بر اساس میکرومول قند آزاد شده در دقیقه بود؛ که در اسیدیته‏ 7 ‏به دست آمد. بالاترین فعالیت آنزیم در دمای 50 درجه سانتیگراد، 5/1 درصد پکتین به عنوان سوبسترا ، مدت زمان 30 تا 40 دقیقه و نسبت یک به یک محلول آنزیمی به محلول سوبسترا مشاهده شد، در حالی‏که در قارچ Aspergillusniger بالاترین میزان تولید آنزیم ‏در اسیدیته‏ 6 ‏و معادل ‏35 واحد در دقیقه به دست آمد. ‏بنابراین، فعالیت اگزوپکتینازی قارچ Monilia جداسازی شده از نارنگی نسبت به قارچ شناخته شده Aspergillusniger 20 واحد بالاتر بود. قارچ Monilia در محدوده وسیعی از اسیدیته‏ قادر به تولید اگزوپکتیناز بود و آنزیم تولید شده با سرعت بالا و در محدوده وسیعی از دما فعالیت می‏کرد. این قارچ ترکیبات سمی نیز تولید نمی‏کند (8). ‏بنابراین، به عنوان جایگزین مطلوب برای تولید آنزیم پکتیناز در کشت غوطه‏ور، به ویژه در صنایع غذایی پیشنهاد می‏شود.

[i]. Miller

[ii]. Sigma

[iii]. Merck

[iv]. Okafor et al.

[v]. Geetha et al.

[vi]. Reddy and Sreeramulu

مراجع

References

(1) Aehie W. Enzymes in industry: production and applications, 2nd Ed., Weinheim Britain: WILEY-VCH; 2004.

(2) Sprockett DD. The evolution of fungal pectinases in glycosyl hydrolase family 28 and their association with ecological strategy [Dissertation]. USA: Kent State Univ.; 2009.

(3) Williams PA, Phillips GO. Gums and stabilisers for the food industry. 5th Ed., UK : Royal Society of Chemistry; 1990.

(4) Sharma BR, Naresh L, Dhuldhoya NC, Merchant SU, Merchant UC. An Overview on Pectins. Times Food Processing Journal 2006; 1: 44-51.

(5) Ptichkina NM, Markinaa OA, Rumyantseva GN. Pectin extraction from pumpkin with the aid of microbial enzymes. Food Hydrocolloids 2008; 22(1): 192-95.

(6) Jayani RS, Saxena S, Gupta R. Microbial pectinolytic enzymes: A review. Process Biochemistry 2005; 40(9): 2931-44.

(7) Thakur A, Pahwa R, Singh S, Gupta R. Production, purification, and characterization of polygalacturonase from Mucor circinelloides ITCC 6025. Enzyme Research 2010; 2: 1- 7.

(8) Samson RA, Hoekstra ES, Frisvad JC. Introduction to food- and airborne fungi. 6th Ed., USA: ASM press; 2002.

(9) Okafor UA, Okachi VI, Chinedu SN, Ebuehi OAT, Onygeme-Okerenta BM. Pectinolytic activity of wild-type filamentus fungi fermented on agro-wastes. African Journal of Microbiology Research 2010; 4(24): 2729- 34.

(10) Miller GL. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Analytical Chemistry 1959; 31(3): 426–28.

(11) Rashmi R, Siddalinga MKR, Sneha G, Shabana S, Syama A, Radhika VS. Partial purification and biochemical characterization of extracellular pectinase from Aspergillus niger isolated from groundnut Seeds. J. Appl. Biosci. 2008; 9(1): 378 –84.

(12) Gomes E, Ribreiro RS, Silva RD, Silva D. Purification of an exopolygalacturonase from Penicillium viridicatum RFC3 produced in submerged fermentation. Int J Microbiol 2009; 2: 1-8.

(13) Geetha M, Saranraj P, Mahalakshmi S, Reetha D. Screening of pectinaseproducing bacteria and fungi for its pectinolytic activity using fruit wastes. International Journal of Biochemistry & Biotech Science 2012; 1: 30-42

(14) Reddy LP, Sreeramulu A. Isolation, identification and screening of pectinolytic fungi from different soil samples of chitoor district. Int J Life Sc Bt & Pharm Res 2012; 1: 186-93.

(15) Tsereteli A, Daushvili L, Buachidze T, Kvesitadze E, Butskhrikidze N. Production of pectolytic enzymes by microscopic fungi Mucor sp. 7 and Monilia sp. 10. Bull Georg Natl Acad Sci 2009; 3(2): 126-29.