کاهش تحمل به تنش اکسیداسیون نوری با افزایش سن برگ آفتابگردان

پیری آخرین مرحله نموی برگ است که با تغییرات فیزیولوژیک و بیوشیمیایی بسیاری همراه است (Smart, 1994). از جمله آنها می‌توان به کاهش تثبیت دی‌اکسید کربن در چرخه کالوین (Kitijima et al., 2002; Ohe et al., 2005)، کاهش میزان پروتئین‌ها، کاهش فعالیت مکانیسم‌های دفاعی، افزایش میزان نشانگرهای تنش اکسیداتیو مانند پراکسید هیدروژن و مالون‌دی‌آلدئید و افزایش نشت الکترولیتی (اسفندیاری و همکاران، 1389) اشاره نمود. گونه‌های فعال اکسیژن تولید شده طی فرآیندهای حیاتی سلول مانند فتوسنتز، تنفس و تنفس نوری، حتی در شرایط مطلوب محیطی، نقش مهمی در بیان ژن‌ها و اجرای فرآیندهای درگیر در پیری ایفا می‌کنند (Ohe et al., 2005). در همین راستا، Del Rio و همکاران (2006) گونه‌های فعال اکسیژن تولید شده در پراکسیزوم را عامل پیری برگ‌های نخود در شرایط تاریکی می‌دانند. Jimenez و همکاران (1998) نشان دادند که فعالیت همه اجزای درگیر در چرخه گلوتاتیون- آسکوربات میتوکندریایی در این شرایط کاهش می‌یابد؛ به همین علت به نظر می‌رسد میتوکندری پیش از پراکسیزوم تحت تأثیر قرار گرفته، در فرآیند پیری ایفای نقش می‌کند.

در گیاهان، کلروپلاست مهم‌ترین اندامک تولید‌کننده گونه‌های فعال اکسیژن در حضور نور محسوب می‌شود (اسفندیاری و همکاران، 1389). در شرایط مزرعه‌ای، شدت نوری که از روی برگ‌ها دریافت می‌شود با تکان خوردن برگ‌ها در اثر وزش باد و حرکت ابرها مدام در حال تغییر است. اما گیاهان قادر نیستند ظرفیت فتوسنتزی خود را به سرعت با تغییرات شدت نور موجود در محیط تنظیم کنند (Ort, 2001). هرگاه شدت نور دریافتی بیش از ظرفیت فتوسنتزی گیاه باشد، نسبت NADP⁺/NADPH, H⁺ در کلروپلاست کاهش می‌یابد و به علت بسته شدن زنجیره انتقال الکترون، تولید گونه‌های فعال اکسیژن مانند پراکسید هیدروژن افزایش می‌یابد (Esfandiari et al., 2007a). پراکسید هیدروژن در کلروپلاست حتی در مقدار کم (در حدود 10 میکرومولار) باعث کاهش 50 درصدی فعالیت آنزیم‌های فعال در چرخه کالوین شده، تثبیت دی اکسید کربن را کاهش می‌دهد. این عمل، افزایش تولید گونه‌های فعال اکسیژن را به دنبال دارد. به همین علت مشخص شده ‌است که کلروپلاست نخستین تغییرات ناشی از پیری را در حضور نور تحمل می‌کند.

گونه‌های فعال اکسیژن تولید شده در تمامی اندامک‌های سلول باعث اکسیداسیون مولکول‌های مهم زیستی سلول مانند لیپیدها، نوکلئیک اسیدها و پروتئین‌ها می‌شوند، که تجمع آسیب‌های وارده در نهایت، باعث مرگ سلول خواهد شد (اسفندیاری و همکاران، 1389؛ اسفندیاری و همکاران، 1388 الف و 1388 ب؛ Mittler, 2002؛ Mittler et al., 2004؛ Edreva, 2005). برای جلوگیری از تأثیر تخریبی اکسیداسیون نوری، گیاهان دارای مکانیسم‌های بیوشیمیایی متعددی هستند که از جمله آنها می‌توان به چرخه مهلر (Asada, 2000)، چرخه گلوتایتون-آسکوربات (اسفندیاری و همکاران، 1388 الف؛ Edreva, 2005)، چرخه گزانتوفیل (Ort, 2001)، انتقال چرخه‌ای الکترون در فتوسیستم I (Edreva, 2005) و تنفس نوری (Edreva, 2005) اشاره کرد. همچنین، برای مقابله با تأثیر مضر اکسیداسیون نوری، گیاهان از آنتی‌اکسیدان‌های آسکوربات، گلوتاتیون، توکوفرول، کاروتنوئیدها و فلاونوئیدها به منظور کاهش خسارت اکسیداسیون مواد زیستی، حتی در شرایط مطلوب محیطی، بهره می‌برند (اسفندیاری و همکاران، 1388 ب؛ Mittler et al., 2004). آنزیم آسکوربات پراکسیداز از مهم‌ترین آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان است که در کلروپلاست به دو شکل آیزوزیمی، متصل به غشای تیلاکوئید و محلول در استروما، حضور دارد (Edreva, 2005). این آنزیم در چرخه‌های مهلر و گلوتایتون-آسکوربات نقش مؤثری در جمع‌آوری پراکسید هیدروژن ایفا می‌کند (Mittler, 2002). وجود چرخه‌های یاد شده حتی در شرایط مطلوب محیطی نیز برای حفظ ساختار کلروپلاست و دوام فتوسنتز بسیار الزامی است (اسفندیاری و همکاران، 1389). اخیراً مشخص شده ‌است که آسکوربات پراکسیداز متصل به غشای تیلاکوئیدی عامل اصلی تحمل گیاه به تنش اکسیداسیون نوری است (Kitijima et al., 2002). در توتون تراریخته که از ویژگی بیان آنزیم کاتالاز باکتری در کلروپلاست برخوردار بود، مشخص شد که تحمل بالایی نسبت به تنش اکسیداسیون نوری وجود دارد (Ohe et al., 2005).

در حال حاضر، اطلاعات اندکی در خصوص تغییرات مکانیسم‌های دفاعی سلول با افزایش سن برگ و نیز شدت اکسیداسیون مواد زیستی در شدت‌های مختلف نور در سنین مختلف برگی وجود دارد. در حالی که مکانیسم‌های دفاعی سلول نقش مهمی در اجرای مطلوب متابولیسم سلول و جلوگیری از بروز اکسیداسیون مواد زیستی ایفا می‌نمایند. از سوی دیگر، شناخت این فرآیندها و الگوی رفتاری آنها می‌تواند اطلاعات مفیدی در خصوص نقش برگ‌ها با سن مختلف در تولید و فیزیولوژی عملکرد در اختیار فیزیولوژیست‌های گیاهان زراعی قرار دهد. بنابراین، به منظور بررسی شیوه تغییرات مکانیسم‌های دفاعی با افزایش سن برگ و نیز بررسی تأثیر شدت‌های مختلف نور بر اکسیداسیون مواد زیستی، بذرهای آفتابگردان در مزرعه کشت و پس از رسیدن به مرحله گرده‌افشانی برگ‌های موجود روی بوته‌ها به سه گروه جوان، میان‌سال و مسن تقسیم و الگوی رفتاری آنها با اهداف یاد شده، بررسی شد.

مواد و روش‌ها

بذرهای یکنواخت آفتابگردان در مزرعه تحقیقاتی دانشکده کشاورزی دانشگاه مراغه در اردیبهشت‌ماه 1389 کشت شد. بذرها به روش کپه‌ای و در ناحیه داغ آب در عمق 5 تا 7 سانتی‌متری خاک قرار گرفتند. در این آزمایش، فاصله بین ردیف‌ها و فاصله بین بوته‌ها به ترتیب 60 و 20 سانتی‌متر در نظر گرفته شد. بوته‌های حاصل طی دو مرحله تُنُک و علف‌های هرز آنها به روش مکانیکی حذف شد. نیازهای کودی بوته‌ها پس از انجام آزمایش‌های خاک تعیین و در زمان تهیه بستر به خاک اضافه شد. آبیاری کرت‌های آزمایشی به روش غرقابی و یک‌بار در هفته انجام شد. با رسیدن بوته‌های آفتابگردان به مرحله گرده‌افشانی، از میان بوته‌های رقابت کننده برخی انتخاب و برگ‌های موجود روی آنها (میانگین 25 برگ در هر بوته) به سه گروه جوان، میان‌سال و مسن تقسیم شد. شایان ذکر است که از بوته‌های استفاده شده، برگ‌های یکسان و هم سن به عنوان نمونه برداشت و سپس از آنها دیسک‌های برگی (به مساحت 3/2 سانتی‌متر مربع) تهیه و در دو آزمایش جداگانه با اهداف متفاوت ارزیابی شد.

بررسی تأثیر سن برگ بر مکانیسم‌های دفاعی و برخی شاخص‌های فیزیولوژیک

بدین منظور از برگ‌ها با سنین مختلف، نمونه‌هایی تهیه و بلافاصله در نیتروژن مایع غوطه‌ور شدند. دیسک‌های برگی تهیه شده برای اندازه‌گیری فعالیت برخی از آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان (کاتالاز، آسکوربات پراکسیداز و گلوتاتیون S-ترانسفراز) و برخی از شاخص‌های فیزیولوژیک (شاخص پایداری غشا، پراکسید هیدروژن، پروتئین، کلروفیل و مالون‌دی‌آلدئید) استفاده شدند. در این بخش از آزمایش، موقعیت برگ‌ها به‌عنوان تیمار در نظر گرفته شده و تجزیه آماری داده‌ها بر مبنای طرح کاملاً تصادفی با 5 تکرار انجام شد. در ارتباط با صفاتی که تفاوت معنی‌داری در بین تیمارها نشان دادند، مقایسه میانگین به روش LSD در سطح احتمال 5 درصد انجام شد.

مدل‌سازی شدت‌های مختلف نور و بررسی تأثیر آن بر اکسیداسیون نوری مواد زیستی در سنین مختلف برگ

در حال حاضر، فیزیولوژیست‌های گیاهی برای مدل‌سازی شدت‌های نور مختلف از متیل وایلوژن استفاده می‌کنند (Ohe et al., 2005). محل عمل این ماده انتهای زنجیره انتقال الکترون کلروپلاست بوده، با کاهش انرژی لازم برای تبدیل اکسیژن به رادیکال سوپراکسید، تولید رادیکال یاد شده را در حضور نور به طور چشمگیری افزایش می‌دهد (Fujibe et al., 2004). بدین منظور، دیسک‌های برگی تازه به مدت 12 ساعت در تاریکی و غلظت‌های صفر، 5/0، 1 و 2 میلی‌مولار متیل وایلوژن غوطه‌ور شدند. پس از اتمام زمان یاد شده، دیسک‌های برگی به مدت یک ساعت در مقابل نور 300 میکرومولار بر ثانیه در متر مربع قرار گرفته، بلافاصله در نیتروژن مایع غوطه‌ور شدند. نمونه‌‌های برگی تا زمان اندازه‌گیری شاخص‌های بیوشیمیایی (فعالیت آنزیم‌های کاتالاز، آسکوربات پراکسیداز، گلوتاتیون S-ترانسفراز، میزان کلروفیل کل، میزان پراکسیداسیون لیپیدی و پراکسید هیدروژن) در دمای 20- درجه سانتیگراد نگهداری شدند. در این مرحله، تیمارهای آزمایش شامل سن برگ بر اساس محل قرارگیری روی ساقه (برگ‌های پایین، وسط و بالا به ترتیب به عنوان برگ‌های مسن، میان‌سال و جوان) و غلظت‌های مختلف متیل وایلوژن (صفر، 5/0، 1 و 2 میلی‌مولار) بود. داده‌های حاصل بر اساس قالب فاکتوریل در پایه بلوک‌های کامل تصادفی با 5 تکرار تجزیه شد. در ارتباط با صفاتی که تفاوت معنی‌داری در بین تیمارها نشان دادند، مقایسه میانگین به روش LSD در سطح احتمال 5 درصد انجام شد.

اندازه‌گیری شاخص پایداری غشا

شاخص پایداری غشا بر اساس میزان هدایت الکتریکی حاصل از نشت یون‌ها از سلول‌های برگ به درون آب دیونیزه اندازه‌گیری شد. بدین منظور دو عدد دیسک برگی در لوله‌های آزمایش محتوی 20 میلی‌لیتر آب دیونیزه غوطه‌ور شد. سپس مجموعه‌‍‌ای از نمونه‌ها در دمای 40 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه و مجموعه دیگر در دمای 100 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه نگهداری شد. هدایت الکتریکی نمونه‌ها پس از رسیدن به دمای اتاق با استفاده از دستگاه EC متر اندازه‌گیری و ثبت شد. شاخص پایداری غشا بر اساس فرمول 1 محاسبه شد (Azizpour et al., 2010):

در رابطه بالا C1 و C2 به ترتیب نشان‌دهنده میزان هدایت الکتریکی نمونه‌ها در دمای 40 و 100 درجه سانتیگراد هستند.

استخراج آنزیم‌های جمع‌آوری‌ کننده پراکسید هیدروژن

برای استخراج آنزیم‌های جمع‌آوری کننده پراکسید هیدروژن، دو عدد دیسک برگی در 2 میلی‌لیتر بافر فسفات سرد 100 میلی‌مولار با اسیدیته 5/7 حاوی EDTA 4/0 میلی‌مولار، آسکوربات 3 میلی‌مولار، پلی‌وینیل پیرولیدین 5 درصد (وزنی‌-حجمی) همگن شد. نمونه‌های همگن شده در g16000 و دمای 4 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شدند. مایع رویی حاصل برای اندازه‌گیری فعالیت آنزیم‌های جمع‌آوری‌کننده پراکسید هیدروژن استفاده شد (Esfandiari et al., 2007b).

فعالیت کاتالاز

فعالیت این آنزیم طبق روش Aebi (1984) اندازه‌گیری شد. کمپلکس واکنشی حاوی 5/1 میلی‌لیتر بافر فسفات پتاسیم 100 میلی‌مولار با اسیدیته 7، 5/0میلی‌لیتر پراکسید هیدروژن 5/7 میلی‌مولار و 50 میکرولیتر از محلول آنزیمی است که حجم نمونه‌ها با اضافه کردن آب مقطر به 3 میلی‌لیتر رسانده شد. تغییرات در جذب نمونه‌ها در طول موج 240 نانومتر در مدت یک دقیقه ثبت شد. فعالیت آنزیمی با استفاده از ضریب خاموشی cm^-1 mmol^-1 6/36 محاسبه شد.

آسکوربات پراکسیداز

کمپلکس واکنشی حاوی 250 میکرولیتر محلول بافر فسفات 100 میلی‌مولار با اسیدیته 7، 250 میکرولیتر آسکوربات یک میلی‌مولار، 250 میکرولیتر EDTA 4/0 میلی‌مولار، 190 میکرولیتر آب دو بار تقطیر، 10 میکرولیتر پراکسید هیدروژن 10 میلی‌مولار و 50 میکرولیتر محلول آنزیمی استخراج بود. تغییرات جذب نمونه‌ها در طول موج 290 نانومتر در مدت یک دقیقه ثبت و میزان فعالیت آنزیم با استفاده از ضریب خاموشی cm^-1 mmol^-1 8/2 محاسبه شد (Sairam et al., 2002).

استخراج و سنجش فعالیت آنزیم گلوتاتیون
S-ترانسفراز

برای استخراج آنزیم‌ گلوتاتیون S-ترانسفراز، دو عدد دیسک برگی در 2 میلی‌لیتر بافر فسفات سرد 100 میلی‌مولار با اسیدیته 8/6 که حاوی EDTA 4/0 میلی‌مولار، پلی وینیل پیرولیدین 5/0 درصد (وزنی‌-حجمی) و سدیم دی ‌متاسولفیت 1 میلی‌مولار بود، همگن شد. نمونه‌های همگن شده در g21000 و دمای 4 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شدند. مایع رویی حاصل برای اندازه‌گیری فعالیت آنزیم‌ یاد شده استفاده شد (Panda et al., 2003).

کمپلکس واکنشی حاوی 900 میکرولیتر بافر فسفات100 میلی‌مولار با اسیدیته 4/7، 450 میکرولیتر گلوتاتیون احیا 5/3 میلی‌مولار، 100 میکرو‌لیتر 1-کلرو، 2 و 4-‌دی‌نیتروبنزن 30 میلی‌مولار و 100میکرولیتر از محلول آنزیمی استخراج شده ‌است. تغییرات جذب نمونه‌ها در طول موج 340 نانومتر در مدت یک دقیقه ثبت و میزان فعالیت آنزیم با استفاده از ضریب خاموشی cm^-1 mmol^-1 0096/0 محاسبه شد (Panda et al., 2003).

میزان پروتئین محلول کل با استفاده از روش Bradford (1976) به دست آمد. از سرم آلبومین گاوی (BSA) به عنوان استاندارد استفاده شد.

میزان پراکسید شدن لیپیدها

این شاخص بر اساس روش Stewart و Bewley (1980) اندازه‌گیری شد. دو عدد دیسک برگی در 10 میلی‌لیتر از محلول 1/0 درصد تری‌کلرواستیک اسید همگن و به مدت 10 دقیقه در g 15000سانتریفیوژ شد. 2 میلی‌لیتر از مایع رویی حاصل با 4 مـیلـی‌لیتر از مـحـلول 20 درصد تری‌کلرواستیک اسید حاوی 5/0 درصد تیوباربیتوریک اسید مخلوط شد. کمپلکس حـاصل به مدت 30 دقیقه در دمای 95 درجه سانتیگراد نگهداری و سپس به حمام آب سرد منتقل شد. نمونه‌ها مجدداً به مدت 10 دقیقه در g10000 سانتریفیوژ شدند. جذب نمونه‌ها در طول موج 532 و 600 نانومتر ثبت شد. میزان پراکسید شدن لیپیدها با استفاده از اختلاف بین طول موج‌های جذبی و ضریب خاموشی cm^-1 mmol^-1 155 به دست آمد.

اندازه‌گیری میزان پراکسید هیدروژن

دو عدد دیسک برگی در 5 میلی‌لیتر از محلول 1/0 درصد تری‌کلرواستیک اسید (وزنی-حجمی) همگن شده، در g12000 به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شد. سپس کمپلکس واکنش با ترکیب 5/0 میلی‌لیتر مایع رویی، 5/0 میلی‌لیتر بافر فسفات 10 میلی‌مولار با اسیدیته 7 و یک میلی‌لیتر یدید پتاسیم یک مولار به دست آمد. میزان جذب نمونه‌ها در طول موج 390 نانومتر ثبت شد. میزان پراکسید هیدروژن با استفاده از منحنی استاندارد به دست آمد (Sergiv et al., 1997).

اندازه‌گیری کلروفیل

برای سنجش میزان کلروفیل کل 05/0 گرم از نمونه‌های برگی در 4 میلی‌لیتر دی متیل سولفوکسید غوطه‌ور شد. سپس نمونه‌ها به مدت 4 ساعت در دمای 65 سانتیگراد و تاریکی قرار گرفتند. پس از گذشت زمان یاد شده نمونه‌ها در تاریکی نگهداری و پس از رسیدن به دمای اتاق میزان جذب آنها در طول موج‌های 665 و 649 نانومتر ثبت شد. سپس از فرمول مورد استفاده Arnon (1949) برای تعیین میزان کلروفیل کل استفاده شد.

نتایج و بحث

همان طور که اشاره شد این پژوهش در دو بخش بررسی افزایش سن برگ بر عملکرد مکانیسم‌های دفاعی و مدل‌سازی شدت نور و ارزیابی عملکرد مکانیسم‌های دفاعی در چنین شرایطی صورت گرفته ‌است. بنابراین، نتایج حاصل نیز در دو بخش جداگانه آورده شده ‌است.

بررسی تأثیر سن برگ بر مکانیسم‌های دفاعی و برخی شاخص‌های فیزیولوژیک

نتایج نشان داد که میزان مالون‌دی‌آلدئید (شکل 1-الف) و پراکسید هیدروژن (شکل 1-ب) تولید شده در برگ‌های مسن و میان‌سال آفتابگردان به طور معنی‌داری (در سطح احتمال 5 درصد) بیشتر از برگ‌های جوان بود. در حالی که بین همه سن‌های برگی مورد مطالعه از نظر میزان پروتئین محلول کل (شکل 1-ج) و شاخص پایداری غشا (شکل 1-د) در سطح احتمال 5 درصد اختلاف معنی‌داری مشاهده شد. به طوری که میزان این شاخص‌ها در برگ‌های جوان بیشتر بوده، با افزایش سن به میان‌سالی و پیری، میزان شاخص‌های یاد شده به طور معنی‌داری کاهش یافت. بیشترین میزان فعالیت آنزیم کاتالاز در بین سن‌های مختلف برگی مورد مطالعه، در برگ‌های مسن به دست آمد که با برگ‌های میان‌سال و جوان در سطح احتمال 5 درصد اختلاف معنی‌داری داشت (شکل 2-الف). روند تغییر فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز متفاوت بوده، با افزایش سن برگ از جوانی به میان‌سالی و پیری در گیاه آفتابگردان، فعالیت این آنزیم افزایش معنی‌داری یافت (شکل 2-ب). به طوری که بیشترین و کمترین میزان فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز به ترتیب در برگ‌های مسن و جوان بود. بیشترین میزان فعالیت آنزیم گلوتاتیون S-ترانسفراز (شکل 2-ج) نیز در برگ‌های مسن آفتابگردان به دست آمد که با سنین میان‌سالی و جوانی برگ‌ها اختلاف معنی‌داری در سطح احتمال 5 درصد نشان داد. همچنین، نتایج حاصل مشخص نمود که سن برگ‌ بر میزان کلروفیل کل تأثیرگذار نبوده ‌است. به طوری که بین سن‌های جوانی، میان‌سالی و پیری از نظر این شاخص اختلاف معنی‌داری مشاهده نشد (شکل 2-د).

شکل 1- تأثیر سن برگ بر میزان الف) پراکسیداسیون لیپیدی؛ ب) میزان پراکسید هیدروژن؛ ج) میزان پروتئین کل؛ د) شاخص پایداری غشا در برگ آفتابگردان

شکل 2- تأثیر سن برگ بر الف) میزان فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان کاتالاز؛ ب) آسکوربات پراکسیداز؛ ج) گلوتاتیون S-ترانسفراز؛ د) کلروفیل کل در برگ آفتابگردان

مدل‌سازی شدت‌های مختلف نور و بررسی تأثیر آن بر اکسیداسیون نوری مواد زیستی در سنین مختلف برگ

نتایج حاصل نشان داد که در سنین جوانی و میان‌سالی برگ‌ آفتابگردان، قرار گرفتن در شدت‌های نور بالا قادر است فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز را به‌طور معنی‌داری نسبت به شاهد افزایش دهد (شکل 3-الف). در حالی که در برگ‌های مسن‌تر فعالیت این آنزیم در شدت نورهای مختلف مدل‌سازی شده در مقایسه با شاهد به طور معنی‌داری کاهش یافته، یا بدون تغییر بود (شکل 3-الف). روند تغییرات فعالیت آنزیم کاتالاز نیز در سن‌های مختلف برگ آفتابگردان و شدت‌های نور متفاوت مدل‌سازی شده با مقادیر متغیر متیل وایلوژن مشابه آنزیم آسکوربات پراکسیداز بود، به طوری که در برگ‌های جوان و به ویژه در مقادیر 1 و 2 میکرومولار متیل وایلوژن فعالیت آنزیم کاتالاز به طور معنی‌داری نسبت به شاهد افزایش داشت. اما نتایج نشان داد که در برگ‌های مسن‌ فعالیت این آنزیم در زمان قرار گرفتن در شدت‌های نور بالا به طور معنی‌داری نسبت به شاهد کاهش می‌یابد (شکل 3-ب). فعالیت آنزیم گلوتاتیون S-ترانسفراز در برگ‌های جوان و میان‌سال با قرار گرفتن در شدت‌های نور بالای مدل‌سازی شده با مقادیر متغیر متیل وایلوژن به طور معنی‌داری نسبت به شاهد افزایش نشان داد (شکل 3-ج). در حالی که فعالیت آنزیم یاد شده در برگ‌های مسن آفتابگردان در شدت‌های نور مختلف مدل‌سازی شده (به جز مقدار 5/0 میلی‌مولار متیل وایلوژن) تغییر معنی‌داری نسبت به شاهد مشاهده نشد (شکل 3-ج). میزان پراکسید هیدروژن در تمامی سن‌های برگ آفتابگردان و شدت‌های نور مدل‌سازی شده با استفاده از مقادیر متفاوت متیل وایلوژن در مقایسه با شاهد افزایش معنی‌داری داشت (شایان ذکر است که میزان پراکسیداسیون لیپیدی در 5/0 میکرومولار سن‌های میان‌سالی و پیری از این روند تغییرات تبعیت نمی‌کند) (شکل 4-الف). همچنین، نتایج حاصل نشان داد که تنها در برگ‌های جوان آفتابگردان میزان کلروفیل کل در شدت‌های نور مختلف مدل‌سازی شده با مقادیر مختلف متیل وایلوژن ثابت بوده، تغییر معنی‌داری نداشته ‌است. در حالی که در سنین پیری و میان‌سالی برگ آفتابگردان در اثر تیمار با غلظت‌های مختلف متیل وایلوژن مقدار کلروفیل کل به طور معنی‌داری کاهش یافت (شکل 4-ب).

Ohe و همکاران (2005) و Kitijima و همکاران (2002) کاهش فتوسنتز و Buchanan (1997) کاهش میزان mRNA روبیسکو را با افزایش سن برگ گزارش کرده‌اند. به علاوه Ohe و همکاران (2005) و اسفندیاری و همکاران (1389) نیز کاهش محتوای پروتئین برگ را با افزایش سن آن گزارش نموده‌اند که با نتایج حاصل از این پژوهش همسو است (شکل 1-د). روبیسکو بیشترین بخش پروتئین موجود در سلول‌های برگی را تشکیل می‌دهد، بنابراین، به نظر می‌رسد میزان آنزیم روبیسکو با افزایش سن برگ کاهش یابد که خود می‌تواند کاهش فتوسنتز را به دنبال داشته باشد. Smart (1994) گزارش نمود که در روند پیری برگ، کلروپلاست از نخستین محل‌های آغاز فرآیند کاتابولیسم به شمار می‌آید. زیرا به علت عدم مصرف پتانسیل هیدروژن در چرخه کالوین، نسبت NADP⁺/NADPH, H⁺ در کلروپلاست کاهش می‌یابد، سپس زنجیره انتقال الکترون در این اندامک بسته می‌شود و چون ریزش‌های فوتونی همچنان ادامه دارد، اکسیژن به طور ناقص احیا شده، بدین ترتیب تولید گونه‌های فعال اکسیژن از جمله رادیکال سوپراکسید افزایش خواهد یافت. اسفندیاری و همکاران (1389) توقف فعالیت آنزیم Cu/Zn-SOD را با افزایش سن برگ گزارش کرده‌اند. آیزوزیم Cu/Zn-SOD از جمله آنزیم‌های دخیل در جمع‌آوری رادیکال سوپراکسید و تبدیل آن به پراکسید هیدروژن است (Asada, 2000). آیزوزیم یاد شده در کلروپلاست در چرخه مهلر فعال است که از مهم‌ترین مکانیسم‌های دفاعی این اندامک برای حفظ ساختار آن به شمار می‌آید (Asada, 2000). در این پژوهش نیز افزایش نشانگرهای زیستی مالون‌دی‌آلدئید (شکل 1-الف) و پراکسید هیدروژن (شکل 1-ب) به همراه کاهش شاخص پایداری غشا (شکل 1-د) با افزایش سن نشان‌دهنده وقوع تنش اکسیداتیو در برگ‌های مسن است. اسفندیاری و همکاران (1389) در گندم دوروم و Ohe و همکاران (2005) در توتون نیز افزایش مالون‌دی‌آلدئید و پراکسید هیدروژن را با افزایش سن برگ گزارش نموده‌اند. آنها معتقدند که افزایش آسیب به غشاها باعث کاهش نفوذپذیری انتخابی این بخش مهم و کلیدی سلول می‌شود. تجمع مالون‌دی‌آلدئید و پراکسید هیدروژن درحالی در برگ‌های مسن اتفاق افتاده است که فعالیت آنزیم‌های کاتالاز (شکل 2-الف) و آسکوربات پراکسیداز (شکل 2-ب) در این برگ‌ها بیشتر از برگ‌های سایر سنین بود. اگر چه این آنزیم‌ها از مهم‌ترین آنزیم‌های جمع‌آوری کننده پراکسید هیدروژن به‌شمار می‌آیند (Edreva, 2005, Mittler, 2002)، با این وجود احتمال دارد که در برگ‌های میان‌سال و مسن میزان تولید پراکسید هیدروژن بیش از سرعت جمع‌آوری آن باشد. در حال حاضر نیز فیزیولوژیست‌های گیاهی بر این باورند که هرگاه تولید گونه‌های فعال اکسیژن بر فعالیت مکانیسم‌های دفاعی غلبه کند باعث آسیب به مولکول‌های زیستی مهم شده، تنش اکسیداتیو اتفاق خواهد افتاد (اسفندیاری و همکاران، 1389؛ Ort, 2001؛ Mittler, 2002؛ Mittler et al., 2004)؛ Edreva, 2005.

آسیب به غشاهای زیستی علاوه بر افزایش نشت الکترولیتی و میزان پراکسیداسیون لیپیدی، باعث تجمع متابولیت 4-hydroxynonenal (4HNE) می‌شود (Schnieder et al., 2008). این متابولیت در مقادیر بالا (در حدود 1-20 میکرومولار) برای سلول سمّی بوده، سبب فعال شدن مجموعه‌ای از مسیرهای متابولیسمی مخرب دیگر می‌شود. از جمله آنها می‌توان به فعالیت آنزیم اندونوکلئاز و رهاسازی آنزیم سیتوکروم C اکسیداز اشاره نمود. در پی فعالیت آنزیم اندونوکلئاز عمل تکه تکه شدن DNA (DNA-laddering) اتفاق می‌افتد (Marrs, 1996). به علاوه، رهاسازی آنزیم سیتوکروم C‌ اکسیداز تولید انرژی را در سلول‌های گیاهی کاهش می‌دهد (Zarkovic, 2003). تجمع این ترکیبات سمّی، همراه با آسیب به سایر نقاط کلیدی متابولیسم، در نهایت، مرگ سلول را در پی خواهد داشت. گلوتاتیون S-ترانسفراز آنزیمی است که 4HNE را با گلوتاتیون ترکیب و آن را سمّ‌زدایی می‌کند (Katsuhara et al., 2005; Koca et al., 2006). فعالیت این آنزیم‌ در مرحله پیری به طور معنی‌داری نسبت به سنین میان‌سالی و جوانی افزایش یافته ‌است (شکل 2-ج). نتایج پژوهش نشان می‌دهد که اگر چه فعالیت آنزیم‌های دخیل در سمّ‌زدایی متابولیت‌های مضر با مسن‌تر شدن برگ افزایش می‌یابد، با این حال سرعت تولید عوامل آسیب‌رسان بیش از فعالیت مکانیسم‌های دفاعی بوده‌ است؛ به طوری که با وجود ثابت بودن میزان کلروفیل کل (شکل 2-د)، سایر شاخص‌های بروز تنش اکسیداتیو نظیر مالون‌دی‌آلدئید (شکل 1-الف)، شاخص پایداری غشا (شکل 1-د) و تجمع پراکسید هیدروژن (شکل 1-ب) به طور معنی‌داری افزایش یافته ‌است. بنابراین، همه نتایج مؤید این موضوع است که با افزایش سن برگ به علت غلبه عوامل مضر بر مکانیسم‌های دفاعی در سلول‌های گیاه تنش اکسیداتیو اتفاق می‌افتد.

شدت‌های نور بالا در برگ‌های جوان و مسن باعث بر هم خوردن تعادل بین تولید و مصرف محصولات واکنش‌های نوری فتوسنتز می‌شود (Ort, 2001). در این شرایط نیز به علت کاهش مصرف پتانسیل ردوکس، نسبت NADP⁺/NADPH, H⁺ کاهش یافته و ناقل‌های زنجیره انتقال الکترون به شکل احیا درآمده، به اصطلاح مسیر بسته می‌شود که افزایش تولید گونه‌های فعال اکسیژن را در پی خواهد داشت. در حال حاضر، محققان از متیل وایلوژن برای مدل‌سازی شدت‌های بالای نور و مطالعه آن روی کلروپلاست استفاده می‌کنند (Ohe et al., 2005). این ترکیب به عنوان گیرنده الکترون از ناقل فرودوکسین عمل کرده، جایگزین چرخه کالوین در مصرف محصولات نوری فتوسنتز می‌شود. با این تفاوت که متیل وایلوژن نقش واسطه را داشته و با انتقال الکترون‌ بر روی اکسیژن باعث تولید رادیکال سوپراکسید می‌شود (Ohe et al., 2005). در حقیقت، هدف استفاده از این ترکیب بررسی توانایی مکانیسم‌های دفاعی فعال در کلروپلاست به ویژه چرخه‌های مهلر و گلوتاتیون-آسکوربات در جمع‌آوری گونه‌های فعال اکسیژن تولید شده ‌است. در همین راستا، رادیکال سوپراکسید تولید شده در کلروپلاست توسط آیزوزیم Cu/Zn-SOD به پراکسید هیدروژن تبدیل می‌شود (Asada, 2000). در این پژوهش، افزایش معنی‌دار پراکسید هیدروژن در همه سنین برگی و غلظت‌های مختلف متیل وایلوژن نشان‌دهنده افزایش فعالیت آیزوزیم Cu/Zn-SOD است (شکل 4-الف). پراکسید هیدروژن حاصل نیز با فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز در کلروپلاست جمع‌آوری و به آب تبدیل می‌شود که پتانسیل هیدروژن لازم از NADPH, H⁺ تأمین می‌شود (Edreva, 2005). این آنزیم در چرخه‌های گلوتاتیون-آسکوربات و مهلر فعال است. با افزایش شدت نور مدل‌سازی شده با متیل وایلوژن، فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز در سن جوانی و میان‌سالی افزایش یافت (شکل 3-الف). با توجه به اینکه محل اثر متیل وایلوژن کلروپلاست است، افزایش پراکسید هیدروژن تولید شده در غلظت‌های مورد مطالعه متیل وایلوژن در سنین مختلف برگ آفتابگردان نسبت به شاهد در این اندامک خواهد بود. بنابراین، اختلاف بین میزان فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز در شدت‌های نور مختلف مدل‌سازی شده و سن‌های متفاوت برگ مورد مطالعه ناشی از تغییر فعالیت این آنزیم در کلروپلاست است. بنابراین، افزایش فعالیت این آنزیم‌ در مراحل جوانی و میان‌سالی در کاربرد مقادیر مختلف متیل وایلوژن برای مدل‌سازی شدت‌های نور متفاوت نسبت به شاهد ناشی از فعال شدن آیزوزیم‌های آسکوربات پراکسیداز کلروپلاستی است. اجرای چرخه‌های مهلر و گلوتاتیون-آسکوربات باعث تعدیل نسبت NADP⁺/NADPH, H⁺ در کلروپلاست می‌شود (اسفندیاری و همکاران، 1387). زیرا در هر دو چرخه یاد شده پتانسیل هیدروژن لازم برای احیای پراکسید هیدروژن در نهایت، از NADPH, H⁺ تأمین می‌شود. علاوه بر این، در چرخه مهلر الکترون‌ها از برخی محل‌های دیگر نظیر فرّودوکسین نیز الکترون روی اکسیژن منتقل شده، تولید رادیکال سوپراکسید می‌کند که در نهایت، در چرخه مهلر به آب تبدیل شده، از اثر تخریبی آنها پیشگیری می‌شود (Edreva, 2005). اجرای این مسیر نیز خود به باز ماندن مسیر اصلی انتقال الکترون کمک شایانی می‌کند (Asada, 2000). در این برگ‌ها اگر چه پراکسید هیدروژن نیز تجمع یافته است، با این حال همواره کمتر از سن پیری بوده ‌است که نشان دهنده عملکرد خوب مکانیسم دفاعی است (شکل 4-الف). Ohe و همکاران (2005) نیز عامل اصلی تجمع پراکسید هیدروژن و بروز تنش اکسیدایتو در مدل‌سازی شدت‌های نور بالا را کاهش فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز کلروپلاستی اعلام نموده‌اند.

افزایش فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز در سنین جوانی و میان‌سالی گویای فعال شدن چرخه مهلر و کنترل پراکسید هیدروژن دارد (شکل 3-الف). به طوری که با وجود افزایش این ترکیب سمّی در هر دو سن برگی، مقدار پراکسید هیدروژن تولید شده به طور معنی‌داری کمتر از پیری (البته فقط در جوانی) بود (شکل 4-الف). در مرحله جوانی فعالیت آنزیم کاتالاز نیز با قرارگیری در غلظت‌های مختلف متیل وایلوژن افزایش معنی‌داری داشت (شکل 3-ب). در حالی که در مرحله میان‌سالی به جز غلظت‌ 5/0 میلی‌مولار در سایر موارد با شاهد تفاوت معنی‌داری نداشت (شکل 3-ب). اما در مرحله پیری فعالیت این آنزیم در همه موارد تیمار با متیل وایلوژن کاهش داشت. کاتالاز پراکسید هیدروژن تولید شده در پراکسی‌زوم را طی فعالیت تنفس نوری جمع‌آوری می‌کند. آنزیم کاتالاز در پراکسی‌زوم فعال است. پراکسید هیدروژن در این اندامک طی واکنش βـ اکسیداسیون اسیدهای چرب، کاتابولیسم اسیدهای آمینه آروماتیک و تنفس نوری تولید می‌شود (Del Rio et al., 2006).

آسیب به کلروفیل توسط گونه‌های فعال اکسیژن نشان‌دهنده وقوع تنش اکسیدایتو در کلروپلاست است. گونه‌های فعال اکسیژن کلروفیل‌های موجود در غشاهای تیلاکوئیدی را اکسیده نموده، با تجزیه آنها، برگ‌ها رنگ سبز خود را از دست می‌دهند. در برگ مسن با قرارگیری در غلظت‌های مختلف متیل وایلوژن به علت تجمع پراکسید هیدروژن و کاهش فعالیت آنزیم‌های دفاعی کاهش کلروفیل اتفاق افتاد (شکل 4-ب). در حالی که در برگ‌های جوان و میان‌سال اعمال تیمار با مقادیر مختلف متیل وایلوژن نتوانست میزان کلروفیل را کاهش دهد (شکل 4-ب)، زیرا در برگ‌های جوان مکانیسم‌های دفاعی فعال در کلروپلاست به راحتی توانسته‌اند مانع از تجزیه آنها شوند که افزایش فعالیت آنزیم‌های آسکوربات پراکسیداز از مهم‌ترین آنهاست (شکل 3-الف).

شکل 4- تأثیر سن برگ و مقادیر متفاوت متیل وایلوژن بر میزان کلروفیل کل (الف) و پراکسید هیدروژن (ب) در برگ آفتابگردان

نتایج حاصل از کلروفیل برگی‌ نیز تأییدی بر موارد یاد شده در بالا‌ست. زیرا در سن جوانی کلروفیل کل موجود در برگ در غلظت‌های مختلف متیل وایلوژن تفاوت معنی‌داری با شاهد نداشت (شکل 4-الف). در صورتی که یکی از اصلی‌ترین محل‌های آسیب به کلروپلاست تیلاکوئید است که در طی آن کلروفیل‌های موجود در آن تجزیه شده، برگ‌ها رنگ سبز خود را از دست می‌دهند. اما در برگ‌های جوان این عمل بر خلاف برگ‌های مسن اتفاق رخ نداد. این نتیجه در واقع ناشی از اجرای مؤثر مکانیسم‌های دفاعی است که توانست با ممانعت از تجمع گونه‌های فعال اکسیژن و صدمات ناشی از آنها، از تجزیه رنگیزه کلروفیل در برگ‌های جوان جلوگیری کند.

به طور کلی می‌توان گفت که با افزایش سن برگ، علیرغم عدم کاهش کلروفیل کل و سبز ماندن برگ‌ها، میزان تولید گونه‌های فعال اکسیژن و دیگر ترکیبات سمّی بر مکانیسم‌های دفاعی غلبه کرده و باعث بروز تنش اکسیداتیو در سلول‌های گیاه میشود. در شدت‌های بالای نور نیز به علت بر هم خوردن تعادل بین واکنش‌های نوری فتوسنتز و مرحله تثبیت دی‌اکسید کربن، تولید گونه‌های فعال اکسیژن افزایش یافته و به علت عدم توانایی سلول در سنین بالا برای جمع‌آوری متابولیت‌های سمّی، تنش اکسیداتیو اتفاق می‌افتد که کاهش کلروفیل و تجمع پراکسید هیدروژن بیانگر این موضوع است.