پیوندهای مفید
اخبار و اعلانات
آمار
| تعداد نشریات | 44 |
| تعداد شمارهها | 1,877 |
| تعداد مقالات | 15,278 |
| تعداد مشاهده مقاله | 43,730,730 |
| تعداد دریافت فایل اصل مقاله | 17,563,047 |
بررسی تأثیر نوع محیطکشت پایه بر تولید داروی ضد سرطان تاکسول در کشت سوسپانسیون سلولی سرخدار (Taxus baccata L.) | ||
| علوم زیستی گیاهی | ||
| مقاله 8، دوره 4، شماره 12، شهریور 1391، صفحه 83-88 اصل مقاله (690.82 K) | ||
| نویسندگان | ||
| ابوالقاسم عباسی کجانی1؛ محمدرضا مفید* 2؛ محمود اطرشی1 | ||
| 1پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی منطقه مرکزی کشور، اصفهان، ایران | ||
| 2گروه بیوشیمی، دانشکده داروسازی و مرکز تحقیقات علوم دارویی، دانشگاه علوم پزشکی و خدمات بهداشتی درمانی اصفهان، اصفهان، ایران | ||
| چکیده | ||
| تاکسول یکی از مهمترین داروهای ضد سرطان حال حاضر جهان است که از جنس سرخدار (Taxus sp.) به دست میآید. امروزه کشت سلولی از مهمترین روشهای تولید تاکسول در دنیا محسوب میشود. در این رابطه، تعیین ترکیب بهینه محیطکشت برای دستیابی به بیشینه رشد سلولها و تولید محصول از اهمّیت ویژهای برخوردار است. این تحقیق به منظور بررسی و تعیین بهترین محیطکشت پایه برای تولید تاکسول از کشت سلولی سرخدار اجرا شد. بدین منظور از چهار محیطکشت پایه شامل WPM، B5، MS و SH که همگی حاوی ترکیب هورمونی یکسان شامل 2 میلیگرم در لیتر NAA، 2/0 میلیگرم در لیتر 2,4-D و 2/0 میلیگرم در لیتر کاینتین (Kinetin) هستند، استفاده شد و میزان تاکسول تولیدی در طول یک دوره 21 روزه، با استفاده از دستگاه HPLC بررسی گردید. از نظر میزان کل تاکسول تولیدی، اختلاف بارزی بین محیطهای مختلف مشاهده شد و بیشترین مقدار این ترکیب از محیط پایه WPM به میزان 58/16 میلیگرم در لیتر به دست آمد. پس از آن، محیطهای MS، B5 و SH به ترتیب با میزان تولید 66/8، 42/6 و 82/5 میلیگرم در لیتر قرار داشتند. از نظر میزان تاکسول ترشح شده به محیطکشت نیز تفاوت معنیداری بین محیطهای مختلف مشاهده شد و محیطهای WPM، B5، SH و MS به ترتیب 68/7، 28/4، 59/3 و 31/3 میلیگرم در لیتر تاکسول تولیدی را به محیطکشت ترشح کردند که این میزان به ترتیب 46، 67، 62 و 38 درصد از کل تاکسول تولیدی را شامل میشود. با توجه به نتایج حاصل میتوان نتیجهگیری کرد که نوع محیطکشت پایه، نه تنها بر میزان تولید این متابولیت مؤثر است، بلکه بر میزان ترشح آن از سلولها نیز تأثیر درخور توجهی دارد. | ||
| کلیدواژهها | ||
| تاکسول؛ سرخدار (Taxus sp.)؛ کشت سلولی؛ محیطکشت پایه | ||
| اصل مقاله | ||
|
تاکسول را میتوان مهمترین داروی ضدسرطان دانست که تاکنون شناسایی شده است (Abbasi Kajani et al., 2010). این ماده یک آلکالوئید دیترپنوئیدی است که به گروهی از دیترپنها به نام تاکسان تعلق دارد (Frense, 2007). به علت محتوای بسیار پایین تاکسول در بافتهای گیاهی سرخدار و نیز رشد بسیار کم این گیاه، تأمین نیاز درمانی به این دارو مهمترین مسأله پیش روی دانشمندان است. به نظر میرسد که کشت سلولی سرخدار یکی از مهمترین راهکارهای تولید بلند مدت و پایدار تاکسول باشد (Zhong, 2002). رسیدن به سطح تجاری تولید برای هر محصول ثانویه گیاهی، به اقتصاد فرآیند تولید آن بستگی دارد و این به نوبه خود به قابلیت تولید وابسته است. قابلیت تولید بالا منوط به حصول بالاترین قابلیت تولید بیوماس گیاهی و نیز متابولیت هدف است. اولین گام برای رسیدن به این منظور، رشد سلولها در محیطی مناسب است که ضمن تأمین شرایط رشد مطلوب، بالاترین سطح تولید را نیز داشته باشد (Dornenburg and Knorr, 1997). به علت اهمّیت بالای این دارو، تاکنون آزمایشهای نسبتاً زیادی در زمینه کشت بافت سرخدار انجام شده است. در زمینه منبع ریزنمونه برای تولید کالوس سرخدار، مشخص شده که در بین پوست، شاخه، آریل سبز و قرمز، اجزای دانه، ساقههای جوان و برگها، بهترین منبع ساقهها هستند (Hien et al., 2004; Zhong, 2002). در اکثر گزارشها بهترین محیط پایه برای تکثیر سلولها، محیط B5 ذکر شده است و عموماً از 2,4-D در ترکیب با سایر تنظیمکنندههای رشدی برای القا کالوس استفاده میشود (Gibson et al., 1993; Frense, 2007). نکته درخور توجه دیگر، ترکیب بهینه محیطکشت برای بیشینه تولید متابولیت هدف است. به طور معمول، شرایط بهینه برای رشد سلولها با شرایط بهینه برای تولید متابولیتها متفاوت است و نیاز به بررسی دقیق دارد. یکی از عوامل مهم در این رابطه، ترکیب و غلظت عناصر غذایی محیطکشت است که نه تنها میتواند بر رشد سلولها اثر گذارد، بلکه بر تولید متابولیتهای ثانویه نیز میتواند مؤثر باشد. در بین گزارشهای منتشر شده در مورد کشت سلولی سرخدار با توجه به اهمّیت تجاری موضوع، گزارش خاصی در مورد مطالعه و تعیین بهترین محیطکشت پایه به منظور دستیابی به بیشینه میزان محصول دیده نمیشود و بیشتر مقایسه ترکیبات دیگر از جمله ترکیب تنظیمکنندههای رشدی و الیسیتورها گزارش شده است. در این تحقیق، برخی از مهمترین و متداولترین محیطهای کشت پایه که در کشت سلولی سرخدار نیز بیشتر استفاده شدهاند، از نظر میزان تولید تاکسول درونسلولی و برونسلولی مقایسه شد.
مواد و روشها مرحله آمادهسازی نمونه و کشت سلول نمونههای گیاهی مورد نیاز در این آزمایش از درختچه موجود در باغ گلهای اصفهان تهیه گردید. بدین منظور از شاخههای جوان و سالم گیاه که فاقد علایم بیماری و کمبود بودند، نمونهبرداری انجام شد. به منظور سترونکردن نمونهها، از روشی که در تحقیقات پیشین تعیین شده بود، استفاده گردید (Abbasi Kajani et al., 2010). بدین منظور ابتدا ساقههای جوان گیاه جداسازی و به خوبی با آب شستشو شد. سپس نمونهها به مدت یک دقیقه در اتانول 70 درصد قرار داده شدند و پس از آن، برای 20 دقیقه در محلول هیپوکلریت سدیم 5/1، قرار گرفتند. در نهایت پیش از کشت و در زیر هود لامینار، 3 مرتبه با آب مقطر استریل شستشو شدند تا بقایای عوامل ضدعفونی کننده، به طور کامل حذف شوند. ریزنمونههای سترونشده در زیر هود لامینار به قطعاتی به طول یک سانتیمتر برش داده شدند و در محیطکشت جامد B5 حاوی ترکیب هورمونی 0/2 میلیگرم در لیتر نفتالن استیک اسید، 2/0 میلیگرم در لیتر 2، 4-دیکلرو فنوکسی استیک اسید و 2/0 میلیگرم در لیتر کاینتین کشت و برای القای کالوس، در شرایط تاریکی و دمای 25 درجه سانتیگراد قرار داده شدند. پس از القا و رشد اولیه کالوسها در طول ماه اول، نمونهها برای تکمیل دوره رشدی خود و تهیه بافت کالوسی یکنواخت، برای چندین دوره یکماهه دیگر نیز در محیطکشت تازه با ترکیبات مشابه قبل، واکشت گردیدند. در نهایت، سلولهای کالوس یکنواخت انتخاب و در آزمایشهای بعدی برای تولید تاکسول از کشت سوسپانسیون استفاده شدند. برای تهیه کشت سوسپانسیون، از 4 محیطکشت پایه شامل WPM، B5، MS و SH که همگی حاوی ترکیب هورمونی مشابه مرحله کالوسزایی بودند، استفاده شد. بدین منظور، 0/2 میلیگرم از سلولهای کالوسی سفید، تُرد و یکنواخت به هر ارلن 250 میلیلیتر که حاوی 50 میلیلیتر محیطکشت مایع بود، اضافه شد و محیطهای کشت مزبور برای یک دوره کشت 21 روزه در شرایط تاریکی و دمای 25 درجه سانتیگراد روی شیکر با سرعت rpm 110 قرار گرفتند. استخراج تاکسول از سلولها و محیطکشت پس از پایان دوره کشت، سلولها و محیطکشت با استفاده از روش فیلتراسیون و عبور دادن از کاغذ صافی، به طور کامل از یکدیگر جدا شدند و سپس میزان تاکسول موجود در هر بخش (درونسلولی و برونسلولی) به طور جداگانه تعیین شد. استخراج تاکسول از سلولها و محیطکشت با استفاده از روشی که قبلاً توسط Abbasi Kajani و همکاران (2010) گزارش شده بود، انجام شد. برای استخراج محتوای تاکسول موجود در محیطهای کشت، ابتدا هر محیطکشت با حجم برابری از متیلن کلراید مخلوط و به مدت 2 ساعت در دمای اتاق روی شیکر تکان داده شد تا فاز آلی و محیطکشت به طور کامل از هم تفکیک شوند. سپس فاز آلی (متیلن کلراید) که حاوی تاکسول بود، از محیطکشت جدا گردید و در دستگاه تقطیر تحت شرایط خلأ و دمای 40 درجه سانتیگراد تغلیظ شد. عصاره تغلیظ شده با یک میلیلیتر متانول مخلوط گردید و از فیلتر μm 2/0 عبور داده شد. سپس نمونه فیلترشده حاصل برای اندازهگیری میزان تاکسول با دستگاه HPLC استفاده شد. برای استخراج تاکسول موجود در سلولها، ابتدا کل سلولهای موجود در هر محیطکشت به طور جداگانه درون آون تهویهدار در دمای 40 درجه سانتیگراد به مدت 24 ساعت به طور کامل خشک و سپس توسط آسیاب، به پودر تبدیل شد. پودر حاصل با 10 میلیلیتر متانول مخلوط و درون لوله آزمایش به مدت 30 دقیقه تحت امواج اولتراسونیک به طور کامل لیز شد. عصاره حاصل در دستگاه تقطیر تحت شرایط خلأ و دمای 50 درجه سانتیگراد تغلیظ شد و کارامل باقیمانده در یک میلیلیتر متانول حل گردید و پس از عبور از فیلتر μm 2/0، برای اندازهگیری میزان تاکسول با دستگاه HPLC استفاده شد. اندازهگیری محتوای تاکسول موجود در نمونهها برای شناسایی و تعیین میزان تاکسول موجود در هر نمونه از روش reverse phase HPLC مطالعات آماری این آزمایش به صورت طرح پایة کاملاً تصادفی در 3 تکرار انجام شد. به منظور بررسی دادههای اندازهگیری شده، تحلیلهای آماری با کمک نرمافزار SAS نسخه 6 صورت گرفت و نمودارها با نرمافزار Excel رسم گردید. مقایسه میانگینها توسط آزمون دانکن در سطح P≤0.05 صورت گرفت. نتایج میزان کل تاکسول تولیدی نتایج (شکل 1) نشان داد که بین محیطهای مختلف از نظر مقدار کل تاکسول تولیدی (درونسلولی+ برونسلولی) اختلاف معنیداری وجود دارد. بیشترین مقدار از محیطکشت حاوی محیط پایه WPM به مقدار 58/16 میلیگرم در لیتر به دست آمد که اختلاف زیادی با محیطهای دیگر دارد و حدود 2 برابر بیشتر از محیط MS است. بنابراین، نتایج پژوهش حاضر این نظریه را که ترکیب و غلظت عناصر غذایی ماکرو و میکرو بر تولید تاکسول و به عبارتی متابولیتهای ثانویه مؤثر است به خوبی تأیید میکند و نشان میدهد که محیط پایه WPM برای دستیابی به بیشینه تولید تاکسول مناسبتر است. پس از محیطکشت یاد شده، محیطهای کشتی که توسط محیط پایه MS تهیه شده بودند با تولید 66/8 میلیگرم تاکسول در لیتر محیطکشت، بیشترین مقدار تولید را داشتند و محیطکشتهای حاوی محیطهای پایه B5 و SH به ترتیب با تولید 42/6 و 82/5 میلیگرم تاکسول در هر لیتر کشت، کمترین میزان تولید را به خود اختصاص دادند (شکل 1).
شکل 1- میزان تاکسول کل تولیدی در محیطهای پایه مختلف (mg.L-1). مقادیر، میانگین 3 تکرار است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنیدار با استفاده از آزمون دانکن در سطح P≤0.05 است. میزان تاکسول برونسلولی نتایج (شکلهای 2 و 3) نشان میدهد که بین محیطهای پایه مختلف از لحاظ میزان تاکسول برونسلولی نیز اختلاف معنیداری وجود دارد، بیشترین میزان به محیطکشت WPM به مقدار 68/7 میلیگرم در لیتر مربوط بود. با توجه به اینکه این مقدار 46 درصد از کل تولید در این محیط را شامل میشود، میتوان بالا بودن میزان تاکسول برونسلولی را به بالا بودن میزان تولید کل در این محیط نسبت داد. محیط B5 هرچند با میزان 28/4 میلیگرم در لیتر تاکسول برونسلولی، رتبه دوم را به خود اختصاص داد، ولی این مقدار 67 درصد از کل تولید در این محیط را شامل میشود. بنابراین، میتوان گفت محیط B5 شرایط مناسبتری را برای خروج تاکسول از سلولها فراهم کرده است. پس از آن، محیطهای SH و MS به ترتیب با 59/3 و 31/3 میلیگرم تاکسول در لیتر محیطکشت، کمترین مقادیر تاکسول خارج سلولی را داشتند که این مقادیر به ترتیب 62 و 38 درصد از کل تاکسول تولیدی در محیطهای یاد شده است. نتایج نشان میدهد که هرچند محیط MS میزان تولید کل درخور توجهی دارد، ولی بخش کمی از تاکسول تولیدی (38 درصد) به محیطکشت ترشح شده است. بنابراین در کل، این محیط برای کشت پیوسته و استحصال متابولیت هدف از محیطکشت، مناسب نیست. میزان تاکسول درونسلولی متوسط میزان تاکسول موجود درون سلولها در محیطهای مختلف در شکل 4 نشان داده شده است. نتایج نشان میدهد که بین محیطهای مختلف، از نظر تاکسول درونسلولی نیز تفاوت درخور توجهی دیده میشود. بیشترین مقدار، به میزان 9/8 میلیگرم در لیتر، از سلولهایی که در محیط WPM رشد کرده بودند، به دست آمد. با توجه به اینکه میزان تولید کل در این محیط بیشتر است، انتظار میرود که محتوای تاکسول درونسلولی نیز در این محیط بیشتر باشد. این مقدار به طور درخور توجهی (67/1 برابر) بیشتر از محیط MS است که با 35/5 میلیگرم تاکسول درونسلولی در لیتر محیطکشت، در رتبه دوم قرار دارد. میزان تاکسول درون سلولی در محیطهای SH و B5 به ترتیب 23/2 و 14/2 میلیگرم بر لیتر بود که به مراتب کمتر از دو محیط دیگر است.
شکل 2- میزان تاکسول برونسلولی در محیطهای پایه مختلف (mg.L-1). مقادیر، میانگین 3 تکرار است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنیدار با استفاده از آزمون دانکن در سطح P≤0.05 است.
شکل 3- میزان تاکسول برونسلولی در محیطهای پایه مختلف (بر حسب درصد). مقادیر، میانگین 3 تکرار است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنیدار با استفاده از آزمون دانکن در سطح P≤0.05 است.
شکل 4- میزان تاکسول درونسلولی در محیطهای پایه مختلف (mg.L-1). مقادیر، میانگین 3 تکرار است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنیدار با استفاده از آزمون دانکن در سطح P≤0.05 است
بحث میزان کل تاکسول تولیدی تأثیر عناصر غذایی پرمصرف و کممصرف بر رشد و نمو سلولها کاملاً واضح و اثبات شده است. بنابراین، میتوان گفت که این ترکیبات به طور غیر مستقیم و با تأثیر بر قابلیت زیست سلولها میتوانند بر میزان تولید محصولات متابولیتی سلول مؤثر باشند. از طرف دیگر بسیاری از این عناصر از جمله پتاسیم، کلسیم، منیزیم، و نیز اغلب عناصر کممصرف، در ساخت متابولیتها، اجزای سلول و همچنین، فعالیت آنزیمها دخالت دارند و از این طریق میتوانند بر تولید و ترشح ترکیبات از سلول تأثیر داشته باشند. ویتامینهای موجود در محیطکشت نیز نه تنها بر رشد و نمو سلولها اثر دارند، بلکه به عنوان کاتالیزور در فرآیندهای متابولیکی به کار میروند. با توجه به اینکه سرخدار گیاهی چوبی است، به نظر میرسد محیطهای کشت پایهای مثل محیط WPM که بیشتر اختصاصی درختان چوبی هستند، میتوانند شرایط مناسبتری را برای رشد سلولهای این گیاهان فراهم کنند. با این حال، تحقیقات بیشتر و جامعتر میتواند در دستیابی به محیطهای ویژه و کارآمدتر، مفید باشد. بررسی نوع و غلظت عناصر غذایی در محیطهای کشت مورد استفاده نشان میدهد که محیط WPM نسبت به محیطهای پایه دیگر حاوی مقادیر بالایی پتاسیم به شکل K2S04 و نیز مقادیر درخور توجه نیترات آمونیوم [(NH4)NO3] است که شاید به طور مستقیم یا غیر مستقیم بر مسیر متابولیکی تاکسول و سنتز آن مؤثر باشند. محیط پایه MS نیز به طور مشابه حاوی مقادیر بالایی نیترات آمونیوم است. میزان تاکسول برونسلولی ترشح مؤثر محصول به محیطکشت، یکی از الزامات کشت پیوسته است و در سیستمهای کشت انبوه و پیوسته برای تولید تجاری متابولیتهای ثانویه، استخراج و خالصسازی بخش برونسلولی محصولات آسانتر بوده، نیازمند امکانات و هزینههای کمتری است. از آنجا که در سیستمهای کشت پیوسته و به منظور ادامه فرآیند تولید ضروری است که سلولها زنده بمانند، بنابراین خروج بیشتر تاکسول از سلولها در این سیستمهای کشت، ضمن افزایش راندمان تولید میتواند به افزایش ماندگاری سلولها نیز کمک کند. بنابراین، در تولید متابولیتهای ثانویه از کشت سلولی سعی میشود به روشهای مختلف میزان خروج محصولات از سلول را افزایش داد. این کار بیشتر به کمک محرکهای زیستی، شیمیایی و فیزیکی انجام میشود که ضمن نیاز به صرف زمان و هزینه معمولاً آثار زیانآوری نیز بر قابلیت حیات سلولها دارد. میزان تاکسول درونسلولی با توجه به اینکه در کشت پیوسته سلولها کمتر برای استخراج محصول متابولیکی استفاده میشوند، لذا میزان محصول درونسلولی اهمّیت چندانی ندارد، ولی با توجه به اثر منفی تاکسول بر رشد و حیات سلولها (Fornale et al., 2002) بالا بودن میزان تاکسول درونسلولی در بلند مدت میتواند ضمن اثر بر قابلیت زیست سلولها، در ایجاد اثر بازخورد منفی نیز مؤثر بوده، در نتیجه بر فرآیند تولید آن اثر منفی بگذارد. بنابراین، فراهم کردن شرایطی که باعث کاهش هرچه بیشتر ماندگاری تاکسول در سلول شود میتواند بر کارآیی تولید اثر مثبت داشته باشد. نتایج تحقیق حاضر نشان میدهد که میزان تاکسول درونسلولی تقریباً ارتباط مستقیمی با میزان تولید کل دارد. به طور کلی، با افزایش میزان تولید کل، محتوای تاکسول درونسلولی نیز افزایش مییابد. به نظر میرسد، استفاده از راهکارهایی برای تسهیل خروج محصولات از سلول در محیطهای با میزان تولید بالا، میتواند به حصول بیشینه بهرهوری منتج شود. جمعبندی نتایج این تحقیق نشان میدهد که نوع محیطکشت پایه یا به عبارت دیگر نوع و غلظت عناصر غذایی میتواند بر میزان تولید تاکسول اثر در خور توجهی داشته باشد. علاوه بر آن، میتواند بر میزان ترشح و مبادله محصولات از غشای سلول نیز مؤثر باشد. بنابر نتایج حاصل، بیشترین میزان تولید تاکسول و نیز تاکسول برونسلولی از محیطکشت پایه WPM به دست میآید و مطالعات بیشتر بر ترکیبات این محیطکشت میتواند به افزایش تولید تاکسول و نیز خروج آن از سلول منجر شود.
| ||
| مراجع | ||
|
Abbasi Kajani, A., Mofid, M. R., Abolfazli, K. and Hosseini Tafreshi, S. A. (2010) Encapsulated activated charcoal as a potent agent for improving taxane synthesis and recovery from cultures. Biotechnology and Applied Biochemistry 56: 71-76.
Abbasi Kejani, A., Hosseini Tafreshi, S. A., Khayyam Nekouei, S. M. and Mofid, M. R. (2010) Efficient isolation of high quality nucleic acids from different tissues of Taxus baccata L. Molecular Biology Reports 37(2): 797-800.
Dornenburg, H. and Knorr, D. (1997) Challenges and opportunities for metabolite production from plant cell and tissue cultures. Food Technology 51: 47-54.
Fornale, S., Esposti, D. D., Navia-Osorio, A., Cusido, R. M., Palazon, J., Pinol, M. T. and Bagni, N. (2002) Taxol transport in Taxus baccata cell suspension cultures. Plant Physiology Biochememistry 40: 81-88.
Frense, D. (2007) Taxanes: perspectives for biotechnological production. Applied Microbiology and Biotechnology 73: 1233-1240.
Gibson, D. M., Ketchum, R. E. B., Vance, N. C. and Christen, A. A. (1993) Initiation and growth of cell lines of Taxus brevifolia (Pacific Yew). Plant Cell Reports 12: 479-482.
Goyer, A. (2010) Thiamine in plants: aspects of its metabolism and functions. Phytochemistry 71: 1615-1624.
Hien, N. T., Khiem, D. V., Vu, N. H., Don, N. T. and Nhut, D. T. (2004) Primary study on the induction and growth of Taxus wallichiana Zucc., a valuable medicinal plant in Lam Dong Province. Journal of Agriculture Sciences and Technology 4: 79-85.
Hirasuna, T. J., Pestchanker, L. J., Srinivasan, V. and Shuler, M. L. (1996) Taxol production in suspension cultures of Taxus baccata. Plant Cell Tissue Organ Culture 44: 95-102.
Srinivasan, V., Pestchanker, L., Moser, S., Hirasuna, T. J., Taticek, R. A. and Shuler, M. L. (1995) Taxol-production in bioreactors: kinetics of biomass accumulation, nutrient uptake and taxol production by cell suspension of Taxus baccata. Biotechnology Bioengineering 47: 666-676.
Wickremesinhe, E. R. M. and Arteca, R. (1994) Taxus cell suspension cultures: optimizing growth and production of taxol. Journal of Plant Physiology 44: 183-188.
Zhong, J. J. (2002) Plant cell culture for production of paclitaxel and other taxanes. Journal of Bioscience and Bioengineering 6(94): 591-599.
| ||
|
آمار تعداد مشاهده مقاله: 2,321 تعداد دریافت فایل اصل مقاله: 833 |
||