جنس اسپرس (Onobrychis,Fabaceae) شامل 77 گونه در ایران است (Rechinger, 1984)، که از میان آنها، گونه اسپرس زراعی (O. viciifolia Scop.) در مناطق زیادی از کشور کاشته می‌شود و همچنین این گونه به طور وحشی در اکثر نقاط کشور رویش دارد. گونه اسپرس زراعی گیاهی علفی دایمی و دارای ریشه‌های عمیق است و به خاطر داشتن برتری‌های اکولوژیک، نظیر مقاومت به آفات یونجه، مقاومت بالا به خشکی و رشد مطلوب در خاک‌های شور (Koivisto and Lane, 2001)، همچنین قادر به رشد در خاک‌های با فسفر خیلی پایین (Miller and Hoveland, 1995) - به عنوان گیاه علوفه‌ای در خاک‌هایی که یونجه توان رشد بهینه را ندارد- است. اسپرس زراعی دارای لاین‌های متعددی است که به شرایط اکولوژیک مختلف، مانند خاک‌های شور، اقلیم سرد و گرم و غیره سازش یافته اند(Prevost et al., 1987; Koivisto and Lane, 2001) و به همین علت، می‌توانند در برنامه‌های اصلاح و تولید ارقام جدید با ویژگی‌های مطلوب مورد استفاده قرار گیرند (Koivisto and Lane, 2001).

تعیین میزان شباهت ژنتیکی بین جمعیت‌ها و ارقام مختلف گیاهان زراعی، اطلاعات پایه ای برای برنامه‌های اصلاحی، برنامه‌های حفاظت از ذخایر ژنتیکی، و همچنین راجع به نحوه گرده‌افشانی (مثل تعیین درصد دگر‌ گرده‌افشانی و خودگرده‌افشانی) گونه‌های گیاهی به دست می‌دهند (Smartt, 1981; Hamrick and Godt, 1989, 1996; Bussell, 1999; Nybom and Bartish, 2000). هرچند سیستم گرده‌افشانی نقش برجسته‌ای در تعیین ساختار ژنتیکی جمعیت‌های گیاهی دارد، عوامل محیطی متعدد دیگری بر روی ساختار ژنتیکی جمعیت‌های یک گونه گیاهی اثر دارند (Hamrick and Godt, 1996; Bussell, 1999). عواملی مانند فرم رویشی مثل یک‌ساله و چند ساله بودن، و شرایط اکولوژیک، به طریق مختلف بر روی ساختار و تنوع ژنتیکی جمعیت‌های مختلف یک گونه گیاهی تأثیر می‌گذارند (Nybom and Bartish, 2000). همچنین تنش‌های محیطی، مانند تنش‌های غیرزیستی مثل خاکی و اقلیمی می‌توانند بر روی تنوع و شباهت ژنتیکی جمعیت‌های گیاهی اثر بگذارند (Van Valen, 1965). بر اثر انتخاب طبیعی، جمعیت‌های گیاهی که در شرایط اکولوژیک مشابه، ولی در نقاط مختلف جغرافیایی رشد می‌کنند، در مقایسه با جمعیت‌های گیاهی که در شرایط اکولوژیک متفاوت رشد کنند، شباهت ژنتیکی بیشتری با یکدیگر نشان می‌دهند (Volis et al., 2001).

مطالعه تأثیر شرایط محیطی بر میزان شباهت ژنتیکی بین جمعیت‌های گیاهی، با استفاده از نشانگرهای مولکولی، نظیر ریزماهواره‌ها (Simple Sequence Repeats, SSRs)، آلوزیم‌ها و RAPDs فقط در چند گونه‌ گیاهی انجام گرفته است و عمده این مطالعات بر روی گونه‌های وحشی جو (Hordeum spontaneum) و گندم (Triticum dicoccoides) است. این مطالعات نشان می‌دهند که در الگوی شباهت ژنتیکی بین جمعیت‌ها، انتخاب طبیعی بیشتر از عامل تصادفی نقش داشته است(Nevo et al., 1998, 1991; Fahima et al., 1999; Li et al., 2000; Turpeinen et al., 2001).

در این مطالعه، تأثیر شرایط اکولوژیک و فاصله و عرض جغرافیایی بر میزان شباهت ژنتیکی بین جمعیت‌های وحشی اسپرس زراعی با استفاده از نشانگرهای RAPD و DNA-ی توده‌ای (bulked DNA) بررسی گردید.

نشانگرهای RAPD به طور وسیعی در مطالعات مربوط به تنوع، ساختار و شباهت ژنتیکی جمعیت‌های بسیاری از گونه‌های گیاهی استفاده شده‌اند (Williams et al. 1990; Hollingsworth et al. 1999; Nybom, 1999; Nybom and Bartish, 2000).

این نشانگرها به دلیل مطالعه کل ژنوم، برای مطالعه اثر انتخاب طبیعی بر روی ساختار ژنتیکی جمعیت‌های گیاهی مناسب هستند (Volis et al., 2001)؛ گرچه این روش دارای محدودیت‌هایی، نظیر داشتن طبیعت غالب و عدم تشخیص هموزیگوسیتی از هتروزیگوسیتی است.

مواد و روش‌ها

مواد گیاهی و منطقه مورد مطالعه

در این مطالعه پنج جمعیت مختلف اسپرس زراعی که به طور وحشی در مناطق مختلف استان آذربایجان شرقی رویش دارند، بررسی شدند. از هر جمعیت تعداد 10 فرد گیاه به طور تصادفی انتخاب شدند. این جمعیت‌ها از نظر جغرافیایی از همدیگر دور و دارای حداقل فاصله 50 کیلومتری هستند (شکل 1). جمعیت‌های مورد مطالعه از نظر ارتفاع از سطح دریا، عرض جغرافیایی، آب و هوا و درجه شوری خاک از همدیگر متفاوتند (جدول 1). دو جمعیت امند و خسروشهر در خاک‌های نسبتاً شور و با فاصله جغرافیایی نزدیک به هم رویش دارند، دو جمعیت هریس و سراب در مناطق با اقلیم سرد و ارتفاع از سطح دریا بیشتر با فاصله نزدیک به یکدیگر پراکنش دارند، درحالی که جمعیت بناب از نظر فاصله از چهار جمعیت دیگر دور و از نظر اکولوژیک نیز به دلیل رویش در خاک‌های کاملاً شور با بقیه جمعیت‌های مورد مطالعه متفاوت است. از نظر عرض جغرافیایی، جمعیت‌های سراب و خسروشهر به همدیگر نزدیک هستند و همچنین دو جمعیت هریس و امند دارای عرض جغرافیایی تقریباً یکسانی هستند، در حالی که عرض جغرافیایی جمعیت بناب با بقیه جمعیت‌ها تفاوت فاحشی دارد.

شکل 1- پراکنش جمعیت‌های اسپرس زراعی مطالعه شده

جدول 1- ویژگی‌های اکولوژیک جمعیت‌های اسپرس زراعی مورد مطالعه

استخراج DNA و اجرای RAPD

DNA-ی هسته‌ای از بذر و یا دانه‌رُست جوان با استفاده از روش Madden (2002) استخراج شد. در مقایسه با روش‌های رایج استخراج DNA، این روش از نظر زمانی سریع و از نظر اقتصادی کم هزینه است. DNA-ی افراد یک جمعیت پس از استخراج با همدیگر مخلوط شدند تا اینکه فقط یک نمونه DNA؛ یعنی DNA-ی توده‌ای به عنوان نماینده آن جمعیت تهیه شود. برآورد غلظت DNA استخراج شده با استفاده از الکتروفورز ژل آگاروز 8/0 درصد و اسپکتروفتومتری در 260 نانومتر انجام گرفت تا غلظت نهایی نمونه‌هایی DNA در 10 نانوگرم در میلی‌تر (ng/ml) تنظیم شود. میزان چندشکلی نوارهای RAPD در پنج جمعیت مورد مطالعه با استفاده از تعداد 10 آغازگر تصادفی آزمایش شد. از میان این تعداد آغازگر، تنها آغازگرهایی که بیشترین و واضح‌ترین نوارهای چند شکل را تولید کردند، برای مطالعه انتخاب شدند. پروفیل RAPD با استفاده از CinnaGen PCR MasterKit, Cat. No. PR8251C=Master Mix محتوی 10 نانوگرم DNA الگو، 1 میکرولیتر (µl) آغازگر به غلظت pm/µl 100در حجم نهایی µl 25 در دستگاه ترموسیکلر (مدل Biometra) به شرح زیر اجرا شد:

مرحله اولیه واسرشتی: یک دور، 4 دقیقه، 94 درجه سانتیگراد؛ مراحل اتصال، تکثیر و واسرشتی: 40 دور، به ترتیب: 1 دقیقه و دمای 93، 1 دقیقه و دمای 40، 5/1 دقیقه و دمای 72 درجه سانتیگراد. نوارهای DNA-ی تولید شده با استفاده از الکتروفورز ژل آگاروز 5/1 درصد با بافر X1 جدا و توسط اتیدیوم بروماید رنگ‌آمیزی شدند. ژل رنگ‌آمیزی شده زیر پرتو ماوراء ‌بنفش مشاهده و توسط ترانسیلومیناتور ماوراء‌ بنفش (UVP, USA) عکس‌برداری شدند. اعداد 1 و 0 در تصویر ژل، برای حضور و عدم حضور نوارها قرار داده شدند. تعداد و درصد نوارهای چندشکل برای هر آغازگر و همچنین فاصله ژنتیکی بین جمعیت‌ها بر اساس ماتریس فاصله ژنتیکی Nei (1973) محاسبه گردید. میزان شباهت ژنتیکی بین جمعیت‌های مورد مطالعه بر اساس دندروگرام UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with Arithmetical Averages) مبتنی بر ماتریس فاصله ژنتیکی Nei بررسی شد.

نتایج

فقط نیمی از 10 آغازگر آزمایش شده، نوارهای چندشکل، واضح و قابل نمره‌دهی را تولید کردند (شکل 2). به منظور اطمینان از تکرارپذیری نوارهای تولید شده، (PCR) برای نمونه‌های مورد مطالعه با این پنج آغازگر به تعداد 3 بار تکرار شدند و الگوی نواربندی حاصل در هر تکرار یکسان بود که تأیید کننده تکرارپذیری الگوهای مذکور بود.

شکل 2- نواربندی  RAPDجمعیت‌های اسپرس زراعی تولید شده توسط آغازگرهای 1 (الف) و 2 (ب)

این پنج آغازگر در مجموع 12 نوار چندشکل را تولید کردند، بیشترین نوار چندشکل مربوط به آغازگرهای شماره 1 و 2 هر کدام با تعداد 3 (25%) نوار چندشکل و کمترین آنها مربوط به آغازگرهای شماره 2، 3 و 5 هر کدام با 2 (7/16%) نوار چندشکل بود (جدول 2). طول نوارهای چندشکل مذکور از 300 تا 2800 متغیر بود.

جدول 2- توالی نوکلئوتیدی آغازگرها، تعداد و درصد نوارهای چند شکل تولید شده در پنج جمعیت اسپرس زراعی

ماتریس فاﺻﻠﺔ ژنتیکی محاسبه شده بر اساس فاصله Nei بین پنج جمعیت اسپرس مورد مطالعه در جدول 3 نشان داده شده است. بیشترین فاصله ژنتیکی، 4904/0، بین جمعیت‌های بناب و هریس و کمترین فاصله، 0572/0، بین دو جمعیت امند و خسروشهر، و در مرحله بعدی، 0870/0، بین جمعیت‌های هریس و سراب و همچنین بین هریس و امند دیده شد. در روی (UPGMA dendrogram) که مبتنی بر فاﺻله ژنتیکی نی است، جمعیت‌های امند و خسروشهر با داشتن بیشترین شباهت ژنتیکی در یک خوشه قرار گرفتند و دو جمعیت سراب و هریس در خوشه دیگر واقع شدند، در حالی که جمعیت بناب به علت داشتن کمترین شباهت ژنتیکی به جمعیت‌های فوق در شاخه‌ای جداگانه قرار گرفته است (شکل 3).

جدول 3- ماتریس فاصله ژنتیکی نی بین پنج جمعیت مطالعه شده اسپرس زراعی

شکل 3- دندروگرام UPGMA  نشان‌دهنده شباهت ژنتیکی بین پنج جمعیت اسپرس زراعی

بحث و نتیجه‌گیری

شباهت ژنتیکی بسیار بالا بین دو جمعیت سراب و هریس و قرار گرفتن این دو جمعیت در یک خوشه در دندروگرام UPGMA را می‌‌توان به شرایط اکولوژیک مشابه حاکم بر این دو جمعیت ارتباط داد. این دو جمعیت در مناطقی که دارای ارتفاع بیشتر از سطح دریا و اقلیم سرد هستند، رویش دارند. هرچند این دو جمعیت دارای کمترین فاصله جغرافیایی هستند، ولی وجود موانع طبیعی مانند ارتفاعات بلند، امکان شارش ژنی و همچنین مهاجرت دانه گرده و بذر بین این دو جمعیت را کاملاً کاهش می‌دهد. همچنین، شباهت ژنتیکی بین جمعیت‌های امند و خسروشهر را می‌توان ناشی از سازش به شرایط محیطی مشابه مثل وجود خاک‌های نسبتاً شور و آب و هوایی نسبتاً گرم تفسیر کرد. از طرف دیگر، شباهت ژنتیکی کم جمعیت بناب با بقیه جمعیت‌های مورد بررسی را می‌توان در مرحله اول به شرایط اکولوژیک متفاوت و در مرحله بعدی به فاصله جغرافیایی بسیار دور جمعیت بناب از بقیه جمعیت‌ها ارتباط داد، زیرا جمعیت بناب از نظر جغرافیایی کاملاً از بقیه جمعیت‌ها دور است و همچنین به خاطر رویش در خاک‌های کاملاً شور از بقیه جمعیت‌ها متفاوت است. بنابراین، می‌توان گفت که بین میزان شباهت ژنتیکی و شرایط اکولوژیک حاکم در جمعیت‌های مورد مطالعه اسپرس زراعی رابطه‌ای مثبت وجود دارد. از نظر تأثیر عرض جغرافیایی بر میزان شباهت ژنتیکی بین جمعیت‌های مطالعه شده، داده‌های ما هم رابطه مثبت و هم رابطه منفی نشان می‌دهند؛ بدین صورت که جمعیت بناب که از نظر عرض جغرافیایی از سایر جمعیت‌ها دور است، از نظر میزان شباهت ژنتیکی نیز از بقیه جمعیت‌ها متفاوت است، در حالی که این رابطه در بقیه جمعیت‌ها صادق نیست، به طوری که دو جمعیت امند و هریس که نزدیکترین عرض جغرافیایی را به همدیگر دارند، کمترین شباهت ژنتیکی را نشان می‌دهند. همچنین بین دو جمعیت سراب و خسروشهر که حدوداً در عرض جغرافیایی یکسانی قرار دارند، شباهت ژنتیکی دیده نمی‌شود. نتایج ما در خصوص رابطه عرض جغرافیایی و شباهت ژنتیکی با نتایج حاصل از مطالعه ای که بر روی جمعیت‌های گیاهی سویا (Glycine soja) انجام گرفته است، تا حدودی مطابقت نشان می‌دهد. مطالعه بر روی جمعیت‌های مختلف این گونه نشان داده است که شباهت ژنتیکی بین جمعیت‌هایی که دارای عرض جغرافیایی مشابه‌اند، بیشتر است (Kiang and Chiang, 1990). همچنین نتایج ما با یافته‌های مطالعاتی که بر روی تأثیر فاصله جغرافیایی و شرایط اکولوژیک بر روی میزان شباهت ژنتیکی جمعیت‌های مختلف گونه‌های گیاهی انجام شده است، مطابقت نشان می‌دهد. در جمعیت‌های مختلف (Stipa grandis) همبستگی مثبت بین میزان شباهت ژنتیکی مبتنی بر RAPD و شرایط اکولوژیک حاکم نظیر اقلیم گزارش شده است (Nianxi et al., 2006). به طور مشابه، مطالعه بر روی جمعیت‌های مختلف جو وحشی (Hordeum spontaneum) از اقلیم‌های گرم و استپی با استفاده از نشانگرهای RAPD نشان داده است که رابطه معنی‌داری مثبت بین شباهت ژنتیکی و شرایط محیطی برقرار است، ولی چنین رابطه‌ای بین شباهت ژنتیکی و فاصله جغرافیایی دیده نمی‌شود (Nevo et al., 1998). بررسی بر روی جمعیت‌های مختلف گندم وحشی (Triticum dicoccoides) بر اساس نشانگرهای RAPD نشان می‌دهد که جمعیت‌هایی که در اقلیم‌های مشابه و شرایط خاکی یکسان رویش دارند، بیشترین شباهت ژنتیکی را با همدیگر دارند، در حالی که در این مطالعه جمعیت‌هایی که از نظر جغرافیایی نزدیک بودند، شباهت ژنتیکی با یکدیگر نشان نداده‌اند (Fahima et al., 1999). همچنین استفاده از دیگر نشانگرهای مولکولی، نظیر آلوزیم‌ها (Nevo et al., 1979; Nevo, 1988; Nevo et al., 1991) و ریزماهواره‌ها (Li et al., 2000) در بررسی جمعیت‌های مختلف گونه‌های گیاهی رابطه مثبت بین میزان شباهت ژنتیکی و شرایط محیطی و اکولوژیک نظیر اقلیم، ارتفاع از سطح دریا و شرایط خاکی گزارش شده است. Alpert و همکاران (1993) در جمعیت‌های مختلف گونه‌ای از توت‌فرنگی وحشی به نام Fragaria chiloensis نشان دادند که شباهت ژنتیکی جمعیت‌ها با میزان فاصله جغرافیایی بین آنها کاملاً همبستگی دارد؛ بدین نحو که جمعیت‌هایی که داری فاصله جغرافیایی کم هستند، بیشترین شباهت ژنتیکی به همدیگر نشان دادند. در دو مطالعه جداگانه بر روی جمعیت‌های مختلف گیاه برنج با استفاده از نشانگرهای ISSR (Inter Simple Sequence Repeats,) و RAPD ارتباط معنی‌داری بین فاصله جغرافیایی و شباهت ژنتیکی (He et al., 2004) و همچنین بین شباهت اکولوژیک و شباهت ژنتیکی دیده شده است (Liu et al., 2005)؛ بدین صورت که با نزدیک بودن فاصله جغرافیایی و مشابه بودن شرایط اکولوژیک جمعیت‌ها، میزان شباهت ژنتیکی آنها بیشتر بود. به طور مشابه، مطالعه بر روی شباهت ژنتیکی جمعیت‌های مختلف برنج از مناطق جغرافیایی دور و کشورهای مختلف با استفاده از نشانگرهای ریزماهواره نشان می‌دهد که اختلاف ژنتیکی بین جمعیت‌های کشورهای مختلف نسبت به میزان اختلاف ژنتیکی بین جمعیت‌های درون یک کشور، یا جمعیت‌های مناطق نزدیک به هم با اقلیم مشابه، بسیار بیشتر است (Wang et al., 2005). با وجود گزارش‌های فراوان که تأیید کننده همبستگی شباهت ژنتیکی با شباهت اکولوژیک و نزدیکی جغرافیایی هستند، تعدادی از مطالعات دیگر که با استفاده از نشانگرهای مختلف بر روی جمعیت‌های گونه‌های مختلف گیاهی انجام گرفته‌اند، وجود همبستگی مثبت بین میزان شباهت ژنتیکی و فاصله جغرافیایی را زیر سؤال برده‌اند. برای مثال، بررسی‌های مبتنی بر ایزوزایم‌ها در جمعیت‌های مختلف گونه‌ای از کاج به نام Pinus massoniana (Huang et al., 1997) و شاه بلوط (Castanea mollissima) (Lang and Huang, 1999) نشان داده‌اند که رابطه‌ای بین شباهت ژنتیکی و فاصله جغرافیایی وجود ندارد.

نتایج حاصل از این مطالعه بر روی جمعیت‌های وحشی اسپرس زراعی نشان می‌دهند که جمعیت‌هایی که در شرایط اکولوژیک مشابه رویش دارند (اکوتیپ‌های مشابه) و همچنین جمعیت‌هایی که فاصله جغرافیایی نزدیکی با همدیگر دارند، دارای شباهت‌های ژنتیکی بیشتری هستند. بر اساس یافته‌های این مطالعه می‌توان گفت که با استفاده از DNA-توده‌ای، نشانگرهای RAPD قابلیت شناسایی اکوتیپ‌های مختلف گونه‌های کاشته شده را دارند.