مقدمه

تیرة باقلا (Fabaceae) با حدود 600 جنس و بیش از 12000 گونه، سومین تیره بزرگ در بین گیاهان گل‌دار است. جنس گون (Astragalus L.) با دارا بودن حدود 2500 گونه، بزرگترین جنس گیاهان گل­دار در دنیاست. ایران با 850 گونه، به تنهایی یکی از مراکز اصلی تنوع این جنس است (Maassoumi, 1998; Lock and Simpson, 1991). بخش Incani DC.یکی از بزرگترین و متنوع‌ترین بخش‌های گون‌های کرک دوشاخه است و دارای حدود 135 گونه در سراسر دنیاست. ایران با دارا بودن 73 گونه و 57 گونه انحصاری (Ranjbar, 2007)، یکی از مهمترین مراکز گونه‌زایی و تنوع این بخش است. از این رو، بخش Incani DC. یکی از پیچیده‌ترین بخش‌های جنس گون از نظر سیستماتیکی در ایران است (Ranjbar et al., 2002; Ranjbar and Karamian, 2003, 2004; Ranjbar et al., 2005; Ranjbar, 2007). اغلب مطالعات سیتولوژیک انجام شده در این جنس بر روی شمارش عدد کروموزومی متمرکز شده است (Aryavand, 1983; Maassoumi, 1987; Maassoumi, 1989; Bader and Sherif, 2007; Ranjbar et al., 2010). بخش Incani DC. واجد عدد پایة کروموزومی (8=x) و دارای دو سطح پلوییدی (32=x4=n2 و 16=x2=n2) است (Ranjbar et al., 2010).

مواد و روش‌ها

مطالعه ریخت­شناسی

به منظور مطالعه ریخت‌شناسی از جمعیت‌های مختلف 5 گونه گون برگ ساده از بخش Incani DC. استفاده شد.نمونه‌ها در سال­های 1387 و 1388 از مناطق غرب، شمال غرب و شمال شرق ایران جمع‌آوری و مطالعه ریخت­شناسی گونه‌ها بر روی 85 ویژگی ریخت­شناختی که مهمترین آن­ها در جدول 1 نشان داده شده است، انجام گرفت. گونه­های مورد مطالعه در هرباریوم دانشگاه بوعلی سینا (BASU) نگهداری می­شوند. نقشه پراکنش گونه­های مورد مطالعه در ایران در شکل 1 و ویژگی­های ریخت‌شناختی مربوط به اندام­های رویشی و زایشی مورد مطالعه در جدول 2 ارائه شده است.

جدول 1- مشخصات تاکسون­های مورد مطالعه از گروه گون­های برگ ساده از بخش Incani DC.

جدول 2– ویژگی­های ریخت­شناختی مورد مطالعه در جمعیت­های مختلف 5 گونه از گروه گون­های برگ ساده از بخش Incani DC.

مطالعه ریز ریخت­شناسی دانه گرده

به منظور مطالعه ریز ریخت­شناسی دانه گرده از روش استولیز استفاده شد. گل‌های جدا شده از نمونه‌های هرباریومی توسط انتهای همزن شیشه‌ای تا اندازه‌ای خرد شد و سپس 6 میلی لیتر محلول استولیز به آن اضافه گردید. زمان لازم برای تیمار دانه‌های گرده با محلول استولیز به مقاومت دانه‌های گرده و به ضخامت اگزین بستگی دارد. این روش برای از بین بردن محتوای سیتوپلاسمی، انتین و هر نوع پوشش سطحی به کار برده می‌شود. پس از اضافه کردن محلول استولیز، نمونه‌ها به مدت 5 دقیقه در بن ماری حرارت داده شد. در هنگام حرارت دادن، محلول مرتب به هم زده شد. آنگاه لوله‌های آزمایش محتوی محلول فوق با دستگاه سانتریفوژ Hettich مدل D-7200 با 3000 تا 3500 دور در دقیقه به مدت 15 الی 20 دقیقه سانتریفوژ شد. سپس محلول رویی دور ریخته شد و به مابقی آب مقطر اضافه و دوباره سانتریفیوژ گردید. این کار سه بار تکرار شد (Erdtman, 1960). در نهایت، چند قطره محلول حاوی گرده روی لام قرار داده شد و پس از خشک شدن و قرار دادن قطره‌ای از محلول گلیسیرین- ژل روی آن، پس از 24 ساعت بامیکروسکوپ نوری مطالعه شد. ویژگی­های مختلف دانه گرده، مانند: قطر قطبی، قطر استوایی، طول شیار، عرض شیار، فاصلة بین دو شیار و ضخامت اگزین برای 20 دانه گرده از هر تاکسون با اوکولر مدرج اندازه‌گیری شد (شکل 2). داده‌های گرده­شناختی مورد مطالعه به روش PCO آنالیز شد.

شکل 2- تصاویر میکروگراف نوری دانه گرده در 3 گونه گون برگ ساده از بخش  Incani DC... A. supervisus 8 (A،
(B A. abnormalis 9،A. abnormalis 10 (C ، (D A. supervisus 12،A. fridae 40 (E ،A. supervisus 13 (F ،
A. supervisus 34 (G، A. supervisus 47 (H (مقیاس = 6 میکرومتر).

مطالعه کروموزومی

به منظور مطالعه کروموزومی، جمع­آوری غنچه دو گونة A. fridae وA. abnormalis از اواسط اردیبهشت تا اواسط تیر ماه در مناطق مختلف انجام شد. برای دستیابی به تمامی مراحل میوز از غنچه­های مختلف در اندازه­های متفاوت و در ساعات مختلف نمونه­برداری انجام شد. در این مطالعه، از سلول­های مادر دانه گرده در بساک پرچم­ها استفاده شد. غنچه‌های جوان به مدت 24-48 ساعت در محلول تثبیت‌کنندة پینار تثبیت و پس از شستشو با روش استاندارد استوکارمین، رنگ‌آمیزی شدند. در نهایت، سلول­های در حال تقسیم توسط میکروسکوپ Olympus BX-41 بررسی و عکس‌برداری توسط دوربین دیجیتال Olympus انجام شد. داده­های کروموزومی مربوط به دو گونه مورد مطالعه به روش PCO آنالیز شد.

نتایج

مطالعه ریخت­شناسی

نتایج حاصل از آنالیز ویژگی­های ریخت­شناختی مربوط به اندام­های رویشی و زایشی (جدول 2) به روش PCO نشان داد که جمعیت­های مختلف 5 گونه مورد مطالعه در دو گروه قرار می­گیرند. گروه اول شامل جمعیت‌های مختلف دو گونة A. abnormalisو
A. supervisusو گروه دوم شامل سه گونه A. fridae، A. rioxii وA. gueldenstaedtiae است (شکل 3). علت جدایی گروه دوم بلندی طول گیاه، دارا بودن تعداد برگچه­ بیشتر از یک و تعداد گل­های زیاد در سه گونة A. fridae، A. rioxii وA. gueldenstaedtiae است.

شکل 3- گروه‌های فنتیکی حاصل از آنالیز داده­های ریخت‌شناختی به روشPCO

مطالعه ریز ریختةشناسی دانه گرده

آنالیز داده­های گرده­شناختی (جدول 3) به روش PCO نشان داد که جمعیت­های مختلف 5 گونه مورد مطالعه در 2 گروه قرار می­گیرند. گروه اول شامل جمعیت­های مختلف دو گونة A. abnormalisو
A. supervisusو گروه دوم شامل گونة A. fridaeاست که نتایج حاصل از مطالعة ریخت­شناسی را تأیید می­کند (شکل 4). جدایی  A. fridaeبه علت تفاوت در میانگین فاصله بین شیار در محل بالای گرانول است که درfridae .A معادل 8/21 و در سایر گونه­ها، 02/13 تا 02/16 است. همچنین ، ضخامت دیواره اگزین در
A. fridae معادل 5/1 و در سایر گونه­ها، 02/1 تا 93/0 است. میانگین طول شیار در A. fridaeمعادل64/6 و در سایر گونه­ها، 15/3 تا 05/5 است. بعلاوه، میانگین قطر قطبی در A. fridae معادل 97/36 و در سایر گونه‌های گروه 5 ، 25 تا 15/29 است و میانگین قطر استوایی نیز در A. fridae معادل 67/29 و در سایر گونه­ها، 12/22 تا 35/23است.

شکل 4- گروه‌های فنتیکی حاصل از آنالیز داده­های گرده­شناختی به روش PCO

جدول 3– ویژگی­های گرده­شناختی مورد مطالعه در جمعیت­های مختلف 3 گونه از گروه گون­های برگ ساده از بخش Incani DC.

مطالعة کروموزومی

میوز یک رویداد تکاملی بزرگ است که در کاهش تعداد کروموزوم­‌ها به اوج خود می­رسد. مسیر هماهنگ و عادی میوز باعث ایجاد گامت­هایی با قابلیت حیاتی می­شود. در این مطالعه از تعداد 1354 سلول شمارش شده در گونة A. abnormalis 19162، 33/10 درصد مرحله زیگوتن/پاکیتن، 89/11 درصد مرحله دیاکینز/متافاز I، 91/27 درصد مرحله آنافاز I/تلوفاز I، 03/1 درصد مرحله متافاز II و 81/48 درصد مرحله آنافازII/تلوفاز II را نشان دادند. در گونة
A. abnormalis 19163، از 3681 سلول شمارش شده، 43/52 درصد مرحلة زیگوتن/پاکیتن، 25/17 درصد مرحلة دیاکینز/متافاز I، 71/17 درصد مرحله آنافاز I/تلوفاز I، 21/0 درصد مرحله متافاز II و 38/2 درصد مرحله آنافاز II/تلوفاز II را نشان دادند. در گونة
A. fridae، از تعداد 2377 سلول شمارش شده، 36/25 درصد مرحله زیگوتن/پاکیتن، 76/5 درصد مرحله دیاکینز/متافاز I، 45/17 درصد مرحله آنافاز I/تلوفاز I، 38/1 درصد مرحله متافاز II و 02/50 درصد مرحله آنافاز II/تلوفاز II را نشان دادند. نتایج حاصل از مطالعه مراحل مختلف میوز و ناهنجاری‌های مشاهده شده طی این فرآیند در جدول 4 ارائه شده است. جدایی گونة
A. fridaeدر آنالیز PCO داده‌های کروموزومی، تأیید‌کنندة نتایج حاصل از آنالیز­ داده­های ریخت‌شناختی و ­گرده­شناختی است ( شکل 5).

شکل 5- گروه‌های فنتیکی حاصل از آنالیز داده­های کروموزومی به روش PCO

جدول 4– ویژگی­های کروموزومی مورد مطالعه در دو گونة A. abnormalisوA. fridae

سیتومیکسی

اتصالات سیتوپلاسمی، پدیده­ای است که به طور عمده در نهاندانگان توصیف می­شود. مهاجرت اجزای کروماتینی بین سلول­های میوزی مجاور از طریق اتصالات سیتوپلاسمی که از پیش ‌ساختارهای پلاسمودسماتایی موجود در بافت بساک منشأ می­‌گیرد، سیتومیکسی نامیده می­‌شود. این پدیده منجر به ایجاد گیاهان آنوپلوییدی یا گامت‌­های کاهش نیافته می­‌شود. تشکیل گامت کاهش نیافته از نظر تکاملی مهم است، زیرا منجر به تولید گیاهانی با ویژگی­‌های ریخت‌شناختی متفاوت و درجه پلوییدی بالا می‌شود (Ranjbar et al., 2009). در این مطالعه، پدیدة سیتومیکسی در مرحله پروفاز I با فراوانی 76/1 درصد و در مرحله آنافاز/تلوفاز I به میزان 92/0 درصد در گونه A.abnormalis 19163، در مرحله پروفاز I با فراوانی 57/8 درصد، در مرحله آنافاز/تلوفاز I به میزان 58/1 درصد و در مرحله آنافاز/تلوفاز II با فراوانی 36/1 درصد در گونة A. abnormalis 19162 و در مرحلة آنافاز/تلوفاز II به میزان 33/0 درصد در گونة
 A. fridaeمشاهده شد (شکل­های 6 و 7).

کروموزوم­های سرگردان

کروموزوم‌­های سرگردان، کروموزوم­‌های عقب افتاده از تفکیک آنافازی هستند و در مقابل کروموزوم‌های پیشرو به دلیل حرکت زودهنگام کروموزوم­ها در آنافاز مشاهده می‌شوند. علت این پدیده، عدم اتصال صحیح کروموزوم­‌ها به رشته دوک و عدم انتقال آن­ها به قطبین است. کروموزوم‌های سرگردان در مرحله آنافاز I/تلوفاز I در گونة
A. abnormalis 19163 با فراوانی 29/4 درصد، در مرحلة آنافاز I/تلوفاز I در گونةA. abnormalis 19162 به میزان 79/0 درصد و در مرحلة آنافاز/تلوفاز I و II در گونة A. fridae به ترتیب با فراوانی 68/1 و 33/0 درصد مشاهده گردیدند (شکل 6).

چسبندگی کروموزوم‌‌ها و پل‌ها

چسبندگی کروموزوم­‌ها به یکدیگر از ایجاد انتهای چسبناک بین دو یا چند کروموزوم و تشکیل پل­‌های چسبناک در آنافاز ناشی می‌شود. البته، در شرایطی ممکن است کروموزوم یا کروماتیدها به یک قطب دوک کشیده شوند. احتمال بقای سلول‌های دچار چسبندگی کم است، زیرا به طور عمده تفکیک این کروموزوم­‌ها در آنافاز و تاخیر چند مرحله‌ای آن­ها در میوز مشاهده می‌شود (Ranjbar et al., 2010). در این مطالعه چسبندگی کروموزوم­‌ها در مرحله آنافاز I/تلوفاز I در گونة A. abnormalis 19163 با فراوانی 84/1 درصد، در مرحله آنافاز/تلوفاز I و II در گونة
A. abnormalis 19162 به ترتیب با فراوانی 26/0 و 3/0 درصد و در مرحله آنافاز II /تلوفاز II در گونة
A. fridae با فراوانی 08/0 درصد مشاهده شد (شکل 6).

میکرونوکلئوس

کروموزوم‌­هایی که میکرونوکلئوس را در طی میوز ایجاد می­کنند، از میکروسپور­های میکروسیت جدا می‌شوند. میکرونوکلئوس ممکن است واجد دیوارة میکروسپوری شده و نوعی برآمدگی را ایجاد کند. این میکروسیت­های جدا شده منشأ ایجاد دانه گرده­های نازا و کوچک خواهند بود (Baptista-Giacomelli et al., 2000). به طورکلی، جداشدن زود هنگام یونی­والان­ها یا عملکرد آنها به عنوان لاگارد در آنافاز باعث ایجاد میکرونوکلئوس در تلوفاز می­شود که معمولاً تا مرحله تتراد باقی می­مانند (Kodura and Rao, 1981). میکرونوکلئوس در این مطالعه در طی مرحلة تلوفاز II با فراوانی 3/0 درصد در گونة A. abnormalis 19162 مشاهده شد (شکل 6).

دوهستکی

این پدیده در مرحله پروفاز I به میزان 33/0 درصد در گونة A. fridae مشاهده شد (شکل 7).

کروموزوم‌های جدا افتاده

کروموزوم­‌های جدا افتاده در مرحله دیاکینز/متافاز I با فراوانی 48/14 درصد در گونة A. abnormalis 19163، در مرحله دیاکینز/متافاز I به میزان 42/12 درصد و در مرحلة آنافاز/تلوفاز I با فراوانی 11/2 درصد در گونة A. abnormalis 19162، در مرحلة دیاکینز/متافاز I با فراوانی 32/15 درصد، در مرحلة آنافاز/تلوفاز I به میزان 40/2 درصد، در مرحلة متافاز II به میزان 03/3 درصد و در مرحله آنافاز/تلوفاز II به میزان 08/0 درصد در گونة A. fridae مشاهده شدند (شکل­های 6 و 7).

ناهمزمانی هسته­ها

این پدیده در مرحله آنافاز I/تلوفاز I با فراوانی 15/0 درصد در گونة A. abnormalis 19163، در مرحلة آنافاز I/تلوفاز I به میزان 43/3 درصد در گونة A. abnormalis 19162 و در مرحلة آنافاز I/تلوفاز I به میزان 11/6 درصد در گونة A. fridae مشاهده شد (شکل 6).

بی­والان­های حلقوی

بی­والان­ها به دو شکل حلقوی و میله­ای وجود دارند. بی­والان­های حلقوی معمولاً توسط کروموزوم‌های متاسانتریک و ساب متاسانتریک به وجود می­آیند. در این بی­والان­ها، کیاسماها در هر بازوی کروموزوم­‌های هومولوگ تشکیل می شوند. اما در میله­ها، کیاسما در کروموزوم‌های اکروسانتریک و تلوسانتریک تشکیل می شوند. بی­والان­های حلقوی در مرحله متافاز I به میزان 15/0 درصد در گونة
A. abnormalis 19163 مشاهده شدند.

سلول­های چند­قطبی

رشته­های دوک در حالت عادی در هر دو قطب سلولی وجود دارند و به صورت یک مجموعه واحد عمل نموده، نقش مهمی در تنظیم کروموزوم‌­ها در طول متافاز بازی می­کنند. هر گونه تغییر یا شکستگی در این مجموعه دوک، ممکن است باعث قرار گرفتن کروموزوم‌‌ها در گروه­های تصادفی شود. سلول‌های چند­قطبی در مرحلة تلوفاز II با فراوانی 08/0 درصد در گونة A. fridae مشاهده شدند (شکل 7).

شکل 6- مراحل مختلف میوز در 2 جمعیت از گونه A. abnormalis. (A دیاکینز (19162)، (B تلوفاز I (19162)، (C تلوفاز II (19162)، (D متافاز I (19162)، (E, F کروموزوم­‌های سرگردان در آنافاز (19162) I، (G پل در آنافاز I (19162)، (H ناهمزمانی هسته­ها در تلوفازI (19162)، (I میکرونوکلئوس در تلوفاز II (19162)،(J  سیتومیکسی در تلوفاز II (19162)، (K ناهمزمانی هسته­ها در آنافاز(19162) II ، (L  پل در تلوفاز II (19163)، (M دیاکینز (19163)، (N کروموزوم­‌های جدا افتاده در متافازI (19163)، (O کروموزوم­‌های سرگردان و پل در آنافاز I (19163) (مقیاس = 6 میکرومتر).

شکل 7- مراحل مختلف میوز در گونةA. fridae. (A دیاکینز، (B متافازI ، (C تلوفاز II، (D دوهستکی، (E کروموزوم‌های جدا افتاده در تلوفاز II،(F سلول پنج قطبی در تلوفاز II، (Gسیتومیکسی در تلوفازII، (H تلوفاز II، (I سیتومیکسی در تلوفازII (مقیاس = 6 میکرومتر).